一种发酵混合水牛乳的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别设及一种高品质发酵混合水牛乳的制备方法。 技术背景
[0002] 水牛乳是世界公认的乳制品=大主要来源之一，同时作为我国南方的特色优质乳 资源，具有较高的营养价值和保健功能。与牛乳相比，水牛乳具有较高的脂肪、乳糖、蛋白 质、灰分、巧、维生素 A和CW及较低含量的维生素 E、核黄素和胆固醇等营养物质。水牛乳还 含有一些牛乳中没有的生物活性物质，如胆绿素、五糖和神经节巧脂等，被誉为"乳中之 王'。
[0003] 目前世界上最好的乳用水牛产于意大利和保加利亚。意大利也是世界水牛乳干酪 第一生产国，产量高达109.9万吨，埃及产量为49.8万吨，居第二位。此外还有伊拉克的格米 干酪(Gemir),埃及的咸乳酪，菲律宾的白奶酪，±耳其的凯玛干酪化aimak),阿塞拜疆的吉 思津斯奇干酪(Gianjinski)，都是用水牛乳加工的。水牛乳加工成奶酪后升值250%，目前， 意大利水牛乳酪市场潜力最大，产品远销英国、法国、美国等国家和地区，市场供不应求。
[0004] 在国内，水牛乳工业发展相对落后，由于文化和饮食习惯的差异，国外水牛乳制品 不太符合我国消费者爱好。目前，我国水牛乳的销售W直销为主，约占水牛乳产量的80%， 进入加工厂的原料乳仅占水牛乳产量的20%左右。我国水牛乳的产量较少，专口加工水牛 乳制品的企业不多，规模都比较小，其次，产品结构不合理，产品附加值不高，产品中，液态 乳占47.16%，传统乳制品占28.12%，酸乳占18.12%，乳酸饮料占6%。
[0005] 由于蛋白质和矿物质含量较高等原因，水牛乳的稳定性较差，其加工特性与普通 牛乳相比有较大差异，制约了水牛乳制品加工的工业化发展。因此研究水牛乳加工特性，研 究并建立具有较好稳定性的水牛乳热处理技术方案，开发高品质发酵水牛乳具有重要的现 实意义。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种高品质发酵混合水牛乳的制备方法，通过该方法制备的 发酵混合水牛乳酸甜适口，口感细腻，并具有良好的流变特性。
[0007] 本发明是通过W下技术方案进行的：牛乳中添加 10%-30%(w/w)水牛乳，添加 4%-8%(w/w)薦糖，经均质，适当热处理后，接种混合菌种发酵剂，再经发酵制备。
[000引本发明所述混合乳酸菌发酵剂菌株包括：鼠李糖乳杆菌grxl9(Lactobacillus rhamnosus grxl9)，于2011年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 菌种保藏中屯、，保藏号是CGMCC NO.5519,在专利"鼠李糖乳杆菌grxl9及其应用"中公开，专 利号是化201110441666.7;发酵乳杆菌g;rx07(Lactobacillus fermentum grxO?)，于2014 年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中屯、，保藏号是 CGMCC NO . 8874，在专利"人源发酵乳杆菌grx07及其应用"中公开，专利申请号是 201410156237.90
[0009] 本发明所述混合乳酸菌发酵剂的菌株由鼠李糖乳杆菌CGMCC NO. 5519和发酵乳杆 菌〔610：備.8874组成，其混合比例为1:1(￥八）。
[0010] 本发明方法发酵制备的发酵混合水牛乳不仅风味良好，且组织状态极为优异。
【附图说明】
[0011] 图1为组合乳酸菌对发酵水牛乳表观粘度的影响；
[0012] 图2为组合乳酸菌对发酵水牛乳触变性的影响；
[0013] 图3为组合乳酸菌对发酵水牛乳应变扫描的影响；
[0014] 图4为组合乳酸菌对发酵水牛乳屈服应力的影响；
[0015] 图5为菌株Bm09、Bm03的 16S rDNA-PCR产物;M:DNA Marker;2:Bm09;L5:Bm03;
[0016] 图6为牛乳与水牛乳不同混合比例对发酵水牛乳表观粘度的影响；
[0017] 图7为牛乳与水牛乳不同混合比例对发酵水牛乳触变性的影响；
[0018] 图8为牛乳与水牛乳不同混合比例对发酵水牛乳应变扫描特性影响；
[0019] 图9为牛乳与水牛乳不同混合比例对发酵水牛乳屈服应力的影响。
【具体实施方式】
[0020] 本研究利用从广西己马长寿人群肠道中筛选获得的乳酸菌，研究其在水牛乳中的 发酵及胆藏特性，通过菌株之间相互生长关系及不同菌株组合对发酵水牛乳流变特性研 究，得到适于水牛乳发酵的发酵剂，最后通过研究牛乳与水牛乳的不同比例对发酵水牛乳 流变特性分析，得到混合水牛乳的最优比例，制备的发酵混合水牛乳不仅风味良好，且具有 良好的流变特性。
[0021] 1.乳酸菌筛选
[0022] 从广西己马长寿人群肠道中筛选获得的乳酸菌中挑选300株具有良好发酵特性的 菌株，按5% (v/v)接种量接种于水牛乳中，42°C培养，通过是否凝乳、凝乳时间和凝乳状态 W及传代稳定性等初步筛选，淘汰发酵质量不稳定、凝乳时间较长、乳清析出严重、组织状 态不好菌株，获得18株初筛菌株，并对其进行胆藏稳定性实验，测定其在4°C条件下第OcU 1(1、3(1、7(1、14(1酸度和活菌数变化，结果如表1和2所示。
[0023] 表1不同乳酸菌在水牛乳中的凝乳特性
[00%]结果表明，18株乳酸菌在水牛乳中其发酵平均产酸速率在1.24-5.85°TA之间，凝 乳时间在9.6-48.加之间，凝乳时酸度在36.21-65.57° T之间，凝胶强度在O. OO化gf/cm2-0.029kgf/cm2之间，活菌数在8.761og CFU/mL-log CFU/mL之间。
[0027]表2不同乳酸菌发酵水牛乳胆藏稳定性
[0029] 结果表明，在4°C胆藏期间，不同菌株间后酸化程度有所差异。胆藏Hd内，后酸化 程度相对较弱的有 9 株菌株，分别为 8111〇1、8111〇3、8111〇4、8111〇6、8111〇8、8111〇9、811112、811116及811117， 酸度上升在l〇°TW内；其余菌株后酸化程度处于中等水平，酸度上升均在10°TW上。其中菌 株Bm03表现出最好的产酸特性，有比较好的产酸速率且后酸化弱。在胆藏期间，所有株菌株 活菌数在IO 8C即/mLW上，其中7菌株活菌数仍保持在IO9C即/mLW上，说明在胆藏过程中依 然能保持较高的活菌数，有利于发酵水牛乳产品的开发。从表中还可W看出，绝大多数菌株 的活菌数最大值出现在冷藏开始后的1-3天。
[0030] 综合乳酸菌在发酵水牛乳中产酸、凝胶强度、活菌数W及胆藏稳定性，选择了发酵 酸度大于35°T，后酸化在10°TW内，凝胶强度在0.01化gf/cm2W上，且乳酸菌活菌数量在 10化。11/血的6株乳酸菌，分别为曲1〇1、8111〇3、8111〇4、8111〇6、8111〇8及曲1〇9。
[0031 ] 2.不同菌株组合发酵特性比较
[0032] 利用纸片法对6株乳酸菌两两之间相互作用关系进行分析，结果如表3。
[0033] 表3菌株间括抗实验结果
[003引注:/表示同种菌株未做括抗试验;-无抑制作用;+微弱抑制作用;++抑制作用
[0036] 结果表明，在30对组合中，有8对菌株间相互无抑制作用，其余组合均有不同程度 相互抑制作用，8个组合分别是I: (BmOl与Bm03)、n : (BmOl与Bm06)、虹：（BmOl与Bm08)、IV: (Bm03与Bm09)、V:(Bm04与Bm08)、VI:(Bm04与Bm09)、VH:(Bm08与Bm06)和M:(Bm06与 Bm09)，各菌株比例均为I: l(v/v)。
[0037] 3.不同菌株组合发酵水牛乳特性研究
[0038] 将8组混合菌株，按5% (v/v)接种量接种于水牛乳中，42°C培养至凝乳后取出，巧U 定其终点所需时间、滴定酸度、pH值、发酵终点时的活菌数并进行感官评价，结果如表4所 /J、- O
[0039] 表4不同乳酸菌混合发酵水牛乳特性分析
[0041] 注：同一列中不同字母表示数据存在显著差异(P<0.05)
[0042] 结果表明，组合乳酸菌发酵水牛乳的凝乳时间范围为6-24h，滴定酸度在40-75°T 之间、活菌数范围为9.08-9.711ogCFU/mL、凝胶强度在0 . Ol-0.032kgf/cm2之间，感官评分 在7.7-8.6之间。8个组合中发酵水牛乳凝乳时间相对比单一菌株凝乳时间短，滴定酸度、活 菌数及凝胶强度有所增加。其中组合Bm03与Bmog(IV)凝乳时间为6.化、滴定酸度为73.05° T，活菌数为9.71 IogC即/ml，凝胶强度为0.032kgf/cm2，同时发酵水牛乳感官评价良好，为 最优组合。
[0043] 4不同菌株组合发酵水牛乳流变特性测定
[0044] 利用8组不同菌株组合制备发酵水牛乳，并在恒溫25°C、恒定剪切速率1.Os^i,剪切 时间为IOmin的条件下，测定表观粘度，如图I所示，测定8个组合乳酸菌发酵水牛乳触变性， 结果如图2。测定组合乳酸菌发酵水牛乳应变扫描结果，如图3所示。测定8个组合乳酸菌发 酵水牛乳屈服应力，如图4所示。
[0045] 由图1可知，8组乳酸菌发酵的水牛乳表观粘度变化量分别为:IV为40.78Pa ? S，虹 为30.49Pa ? s，Vni为25.88Pa ? S，n 为22.95Pa ? S，V为21.61Pa ? s，Vn为20.74Pa ? s，VI为 20.66化? s，I为12.13化? s，说明IV组合制备的发酵水牛乳表观粘度最高，虹组合次之。
[0046] 由图2可知，乳酸菌发酵水牛乳都能形成面积大小不同的滞后环，说明了发酵水牛 乳都是粘弹性和触变性流体。但不同组合乳酸菌发酵水牛乳滞后环的形状具有明显的差 异。滞后环面积及粘丝性大小如表5所示。
[0047] 表5组合乳酸菌对发酵水牛乳粘丝性的影响
[0049] 结果表明，8个样品粘丝性大小关系分别为；IV为0.46，虹为0.52，I为0.57，V为 0.53，VI为0.55，VD为0.50，M为0.55，n为0.51。IV组合发酵水牛乳粘丝性最小，组织间的 粘连能力最高，且组织受到破坏后结构恢复能力最好，具有较好的触变性，W组合次之。
[0050] G '和G"两者决定样品的稳定性：当G ' <G"时相位角>45°，样品的粘性形变优于弹性 形变，即测试样品呈现流体粘性；当G'〉G"时相位角<45%样品的弹性形变优于粘性形变，结 构变现为一定的刚性。由图3可知，组合乳酸菌发酵水牛乳在现行粘弹性区间G'、G"和相位 角无明显变化，随着应变量的增加，当超过酸凝胶体系的丫 C时，G'急剧变小变化量大于G"， 酸凝胶网络结构受到破坏；当应变量继续降低当达到形变临界点丫加寸，G'<G"相位角>45°。 组合乳酸菌发酵水牛乳丫 C及丫 d如表6所示。
[0051 ]表6组合乳酸菌对发酵水牛乳丫 C及丫 d的影响
[0化3] 结果表明，8组发酵水牛乳丫。量大小关系为1￥〉虹=￥〉珊〉\1〉￥1〉11〉1;丫3量大小 关系为iv〉vi〉n = v〉虹=vn=vni〉i。丫C和丫 d越大表明发酵水牛乳网络结构越稳定，不易 受到破坏能较好的保持发酵水牛乳的弹性形变。表明了 VI组合和虹组合发酵水牛乳具有较 好的稳定性。
[0054] 由图4可知，组合乳