专利名称：：一种有抗肿瘤协同增效作用的药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种有抗肿瘤协同增效作用的药物组合物，尤其涉及一种治疗HERG钾通道蛋白高表达肿瘤的治疗药物。
背景技术：
：:恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一种常见病。目前临床应用的抗肿瘤药物，其毒性是困扰肿瘤化疗的一个突出问题。寻找自身低毒，作用于生化代谢的特定环节或分子靶点，可以提高化疗药物的抗肿瘤效果或降低其毒性，能对现有抗肿瘤药物产生协同增效作用的生化调节剂，成为研究抗肿瘤药物的一个新途径。分子靶向治疗，是以肿瘤细胞过度表达的某些标志性分子为耙点，选择针对性的阻断剂，以有效干预受该标志性分子调控并与肿瘤发生密切相关的信号传导通路，从而达到抑制肿瘤生长、进展及转移的效果。由于该治疗手段专门针对在肿瘤发生中起关键作用的耙分子及其调控的信号传导通路，因而，不但增强了抗癌治疗的特异性和选择性，并且避免了一般化疗药物的无选择性毒副作用和耐药性。HERG(et力ar-a-go-go-re〗az^yge/e)是一种属于EAG电压依赖性钾通道蛋白超家族中的通道蛋白，通常只在人心肌和脑组织中表达，而在其他组织中几乎不表达。在小鼠中相应命名为MERGo"se￡/^蛋白。文献报道，它与细胞的增殖、分化以及肿瘤的形成有关。在某些肿瘤中，HERG的表达程度还与恶性程度成正相关(Abrar"s/^朋c/5>aA2005;266:225-32)。应用HERG通道的特异性阻断剂，可以抑制肿瘤细胞的增殖，侵袭能力(Cs/7cer/fes，2004;64:606-11)。因此，HERG通道蛋白可以作为肿瘤检测和治疗的一个潜在的理想靶点。对HERG电流有阻断作用的临床药物中，有大环内酯类和氟喹诺酮类药物。红霉素Erythromycin(E脂)属于大环内酯类抗菌药，司帕沙星Sparfloxacin(SPFX)属于氟喹诺酮类抗菌药。本发明实验室前期的研究已经证明，人结肠癌HCT116、HT-29细胞，小鼠结肠癌C26细胞，小鼠肝癌H22细胞均有较高程度服RG或MERG蛋白的表达。与HERG表达相关的药物敏感性及其生化调节作用研究表明，红霉素对HT-29细胞增殖的抑制，是与其作用时间和剂量相关的，它能将细胞阻滞于G2/M期并诱导细胞凋亡，抑制细胞的黏附能力和分泌明胶酶(Owcerae/Bof力er/%a/7Z7acW2005;56:212-20.)。红霉素与抗肿瘤药物联合，在体内和体外均有增效作用(中华医学杂志，2006;86:3353-7.)。同样，司帕沙星也是一类针对肿瘤细胞中HERG蛋白的小分子抑制剂。司帕沙星可以抑制结肠癌细胞的生长，其机制与诱导细胞凋亡、细胞周期阻滞、抑制细胞侵袭能力相关。司帕沙星在体外与5-氟尿嘧啶(5-FU)、长春新碱(VCR)及紫杉醇联合均有协同增效作用。体内实验表明，司帕沙星与5-FU联合也有增效作用。本发明所说的抗肿瘤协同增效药物组合物，特别是与肿瘤化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)、长春新碱(VCR)联合使用的红霉素/司帕沙星组合物，迄今尚未见有相关报道。本发明的目的是，提供一种具有协同作用、可以提高抗肿瘤效果特别是具高表达HERG钾通道蛋白的抗肿瘤药物组合物。
发明内容本发明提供了一种抗肿瘤协同增效药物组合物。所说组合物是将抗菌药红霉素与司帕沙星组合，作为分子耙向HERG调节剂，针对HERG蛋白高表达的肿瘤，与化疗药物如5-氟尿嘧啶(5-FU)或长春新碱(VCR)联合应用，以达到肿瘤治疗的协同增效目的。本发明所说的抗菌组合药物由司帕沙星和红霉素组成，其分子比为1:1，可与其它化疗药物如5-氟尿嘧啶或长春新碱联合使用。本发明还提供了所述组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。发明效果本发明的优点与积极效果在于两个针对同一分子靶点HERG的抗菌药物司帕沙星/红霉素组合，有显著的抑瘤作用，与化疗药物如5-氟尿嘧啶联合使用，可以产生明显的抗肿瘤协同增效作用，其效果明显优于单独使用所述化疗药物。:图1-Westernblot法检测HERG蛋白在人结肠癌细胞中的表达图2-Westernblot法检测MERG蛋白在小鼠C26和H22细胞中的表达图3-MTT法检测SPFX对结肠癌细胞HCT116和HT-29的增殖抑制作用其中HCT116HT-29图4-MTT法检测SPFX-E謂，SPFX和ERM对HCT116细胞的生长抑制作用其中ERM■SPFX—▲—SPFX-ERM图5-MTT法检测SPFX-ERM，SPFX和ERM对HT-29细胞的生长抑制作用其中一SPFX■E脂—▲—SPFX-E脂具体实施例方式以下所列实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。〈实施例1〉、HERG蛋白和MERG蛋白在人结肠癌细胞和小鼠肿瘤细胞中的表达收集处于对数生长期的上述细胞，用全细胞裂解液裂解细胞并提取细胞膜蛋白，测定总蛋白浓度。取各样品等量总蛋白50yg，分别加入5X上样缓冲液，沸水煮沸变性5分钟后加入7.5%的SDS-PAGE凝胶中进行电泳。电泳完毕后，以半干法将胶上的蛋白转到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。转完的膜浸于含1%(w/v)BSA(牛血清白蛋白)的TBS-T溶液(吐温-Tris盐酸缓冲液)中室温振摇封闭2小时或过夜，TBS-T室温润洗5次，每次5分钟，装入杂交袋，用含1%BSA的TBS-T溶液稀释第一抗体，室温振摇孵育3小时或者4'C振摇过夜，TBS-T室温润洗5次，每次5分钟。装入新的杂交袋内，用含1%BSA的TBS-T溶液稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育3小时，TBS-T室温润洗5次，每次5分钟。膜上滴加化学发光增强剂(美国SantaCruz公司，sc-2048)，按照试剂说明进行操作，通过化学发光成像系统捕获图像。抗体的稀释比例按说明书进行。结果表明(图1)，4个人结肠癌细胞系HCT116、HT-29、HCT-8和SW-480细胞中，HERG蛋白均有较高程度的表达。人胚肾细胞HEK293作为不表达HERG蛋白的阴性对照。其中，HCT116和HT-29细胞的HERG蛋白表达量最高。小鼠结肠癌C26细胞以及小鼠肝癌H22细胞中，也检测到HERG蛋白在小鼠中对应蛋白MERG的表达(图2)。<实施例2>、SPFX-ERM与化疗药物5-FU、VCR联合使用对高表达HERG蛋白HCT116和HT-29细胞的协同抑制作用将处于对数生长期的上述细胞消化，记数，铺96孔板，24小时后加入不同浓度的药物，继续培养72小时，加入MTT(四氮唑蓝)，37。C孵育4小时，加入DMS0(二甲基亚砜)溶解蓝紫色颗粒，在酶标仪上测每孔中570nm处吸光值。将各测试孔的0D值减去本底0D值(完全培养基加MTT，无细胞)，各平行孔的0D值取平均数。细胞的存活率以T/C(%)表示，T为加药细胞的0D值，C为对照细胞的0D值。细胞存活率％=(加药细胞0D—本底0D)/(对照细胞OD—本底OD)X100%，求出T/C=50%时的药物浓度即IC5。计算两药相互作用系数CDI=AB/(AXB)。T为加药细胞的OD值，C为对照细胞的OD值，AB为两药联合作用组的T/C比值，A、B是药物单独作用组的T/C比值，T/C是指给药组与对照组的OD比值。体内治疗试验，AB为两药联用组与对照组瘤体积的比值；A或B是各药物单独使用组与对照组瘤体积的比值。CDI<l时，两药有协同作用，CDI《0.70时，协同作用非常显著。结果表明，HCT116和HT-29细胞对SPFX-E脂的敏感性显著高于单独对SPFX或E脂的敏感性，SPFX与E函联合作用于HCT116和HT-29细胞存在协同作用(表1，表2，图3，图4)。将SPFX-ERM与不同浓度的5-FU和VCR联合作用于HCT116和HT-29细胞，均体现出明显的协同增效作用(表3-6)。表l、司帕沙星、红霉素以及司帕沙星与红霉素联合对结肠癌细胞的增殖抑制作用细胞ICso(UM)SPFXERMSPFX-ERMHCT11674.83±11.46143.52±19.8560.53±7.64HT—29137.57±15.2798.56±10.6784.51±12.05表2、司帕沙星与红霉素联合对结肠癌细胞的药物相互作用系数(CDI)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*SPFX-ERM浓度10iiM表5、SPFX-ERM与VCR联用对结肠癌HCT116细胞的增殖抑制作用药物浓度UM)存活率(％)CDIVCR0.00389.96±8.540.01380.98±6.920.0575.81±9.990.265.08±8.92SPFX-ERM1072.17±6.56VCR+SPFX-ERM*0.00371.36±7.091.110.01358.24±4.640.900.0538.36±3.560.710.232.77±4.510.70*SPFX-ERM浓度10tiM表6、SPFX-ERM与VCR联用对结肠癌HT-29细胞的增殖抑制作用药物浓度(iiM)存活率(%)CDIVCR0.00392.50±10.520.01373.56±7.340.0545.01±13.770.244.52±2.44SPFX-ERM1074.35±10.45VCR+SPFX-ERM*0.00360.08±4.930.830.01355.56±8.380.970.0529.83±1.390.850.221.84±1.380.63*SPFX-ERM浓度10iiM〈实施例3〉、组合药物SPFX-ERM及其与化疗药物5-氟尿嘧啶联用在体内对小鼠肝癌肿瘤生长的抑制作用根据剂量初筛结果，设计动物实验治疗的给药方式和剂量。取体重为18-22g的昆明种小鼠，随机分组，每组10只。取小鼠肝癌H22腹水，以生理盐水稀释成细胞数为7.5X106个/ml的悬液，0.2ml/只，接种于小鼠腋窝皮下。(1)、实验分为6组，接种肿瘤一天后，空白对照组腹腔注射生理盐水，阳性对照组腹腔注射5-氟尿嘧啶30mg/kg，每两天一次，其余各组分别口服给予小、中、大剂量SPFX-ERM，或5-氟尿嘧啶与400mg/kgSPFX-ERM联用。连续给药10天，每天2次，以公式V-l/2abH十算瘤体积，并计算抑瘤率。如表7所示，组合药物SPFX-ERM800mg/kg、400mg/kg组的抑瘤率分别为89.1%和64.7%(p〈0.01)，有显著疗效。SPFX-ERM与5-FU联用可增强抑瘤作用，其CDI为0.85。各用药组均无动物死亡，且小鼠体重均有所增加，表明上述药物剂量无明显毒性。(2)、实验分为10组，分别为对照组，小、中、大剂量ERM组，小、中、大剂量SPFX组，小、中、大剂量SPFX-ERM组。接种肿瘤一天后，各组开始口服灌胃给药，连续给药10天，每天2次，以公式V4/2abH十算瘤体积，并计算抑瘤率。如表8所示，1200mg/kgE服组的抑瘤率可达到50.6%(p<0.05)，1200mg/kgSPFX组的抑瘤率可达到70.6%(p<0.05)。相同剂量SPFX的抑瘤作用较E脂强。各用药组均无动物死亡，且小鼠体重均有所增加，表明上述药物剂量无明显毒性。相同剂量的组合药物SPFX-ERM抑瘤作用较单独应用SPFX和ERM明显增强，且CDI均在0.2以下，有显著的协同作用。表7.SPFX-ERM与5-FU联用对小鼠移植性肝癌H22的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求1.一种协同增效的抗肿瘤药物组合物，其特征是所述药物组合物含有抗菌组合药及抗肿瘤化疗药。2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征是该组合物中所含抗菌组合药为司帕沙星和红霉素。3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征是该组合物中所含抗肿瘤化疗药物为5-氟尿嘧啶或长春新碱。4.如权利要求1或2或3所述药物组合物在制备协同增效抗肿瘤药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种有抗肿瘤协同增效作用的药物组合物，该组合物是将抗菌药红霉素与司帕沙星组合，作为分子靶向钾离子通道HERG调节剂，针对HERG蛋白高表达的肿瘤，与化疗药物如5-氟尿嘧啶(5-FU)或长春新碱(VCR)联合应用，以达到肿瘤治疗的协同增效目的，研究结果表明，该药物组合物可产生明显的协同增效作用。文档编号A61K31/513GK101099744SQ20071010587公开日2008年1月9日申请日期2007年6月1日优先权日2007年6月1日发明者吴淑英,尚伯杨,弓建华,甄永苏申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所