蛋白酶抑制剂的制作方法

专利名称：蛋白酶抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种显示蛋白酶抑制活性的多肽，以及所述多肽在直接地或间接地抑 制一种或多种蛋白酶的方法中的用途。
背景技术：
血液凝固级联形成了称为止血(停止从受损血管的失血)的一种重要的宿主防御 机制的一部分。血管损伤时，血小板与内皮下组织中的大分子粘附，然后聚集形成初级止血 栓子。血小板刺激血浆凝血因子的局部活化，导致纤维蛋白凝块生成，这加固血小板聚集 物。此后，当伤口发生愈合时，血小板聚集物和纤维蛋白凝块分解。限制上面提及的血小板聚集物和纤维蛋白凝块在损伤部位形成的机制对于保持 血液的流动性是必需的，并且，在一些情况下，对于防止不合乎需要的血块形成诸如血栓形 成是必需的。血栓形成是一种病理过程，其中血小板聚集物和/或纤维蛋白凝块在完整的血管 腔内或心脏的腔室内形成。如果血栓形成发生在动脉中，则动脉所供应的组织可能会经历 缺血性坏死(例如由于冠状动脉的血栓形成引起的心肌梗塞)。如果血栓形成发生在静脉 中，则由静脉引流的组织可能变为水肿和发炎。下肢中的深静脉血栓形成可能并发于肺栓 塞，其中所有或部分血栓松脱，被血流携带通过腔静脉和右侧心脏，并且停留在肺动脉中。 大块肺栓塞(Massive pulmonaryembolism)可导致低氧血症、休克和死亡。血液凝固级联血液凝固的经典模型包括一系列(或级联的)酶原活化反应(图示在本文的

图1 中)。在各阶段中，前体蛋白(酶原)通过前体蛋白中的一个或多个肽键的切割而转变为活 性蛋白酶。可在各个阶段中涉及的各类型组分包括下列(a)蛋白酶(来自在前阶段(preceding stage))(b)酶原(c)非酶蛋白辅因子(d)钙离子(e)组构表面(例如，在体内由血小板提供)血液凝固或止血系统分为三个部分血小板聚集(初期止血)，凝固(二期止血) 和纤维蛋白溶解(三期止血)。参与止血中的凝固蛋白酶原是由肝细胞分泌至血流中的促 凝因子(凝血酶原/11因子，VII因子，IX因子，X因子，XI因子，XII因子和前激肽释放 酶)，抗凝因子(蛋白C、蛋白S)，和纤溶因子(纤溶酶原，t-PA和尿激酶原)。非酶蛋白辅因子包括V因子和VIII因子，组织因子和高分子量激肽原(HMWK)。V 因子和VIII因子是大的血浆蛋白，其含有与铜结合蛋白血浆铜蓝蛋白同源的重复序列。凝 血酶切割V和VIII，产生活化因子(Va和Villa)，其凝血活性为其前体形式的至少50倍。 Va和VIIIa没有已知的酶活性。而是，它们作为辅因子，分别增加Xa和IXa的蛋白水解效 率。因子VIII在血浆中循环，与von Willebrand因子(vWF)结合，后者是一种介导血流血
4小板与在血管损伤时暴露的内皮下结构诸如胶原结合的糖蛋白。蛋白酶Xa因子(fXa)形成内源性途径和外源性途径两者的一部分(图1)。这些 途径不是多余的而是高度相互联系的。凝固级联可在体内通过血浆与组织因子的接触而启 动。组织因子是在正常不与血浆接触的细胞(例如，成纤维细胞和巨噬细胞)的表面上组 成型表达的的非酶脂蛋白。血浆与这些细胞的接触启动了在破裂血管外的凝血。内皮细胞 当被内毒素、肿瘤坏死因子或白介素-1刺激时也表达组织因子，并且可参与病理状况下的 血栓形成。组织因子结合VIIa因子并加速X因子活化约30，000倍。尽管VII因子被其产物 蛋白酶Xa因子(fXa)活化，但似乎在所有时候血浆中均存在痕量的Vila因子与组织因子 相互作用。在组织因子的存在下VIIa因子还活化IX因子，提供“内源性”和“外源性”途 径之间的联系。IXa因子和Xa因子与其非酶蛋白辅因子(分别为VIIIa和Va)在聚集的血 小板表面上组装。这导致局部生成大量的fXa，活化在该途径中生成的最终的蛋白酶；凝血 酶(flla)。Xa因子通过切割酶原中的两个肽键将凝血酶原(II因子)转变为凝血酶(IIa 因子)。Va、血小板(或磷脂)和钙离子加速Xa活化凝血酶原。整个系统活化凝血酶原的 速率比Xa和钙单独活化快约300，000倍。随后，凝血酶将可溶性蛋白纤维蛋白原转变为不 溶性的纤维蛋白凝胶，纤维蛋白凝胶进一步通过由XIIIa因子催化的共价交联而加强。纤维蛋白溶解是其中纤溶酶降解已形成的纤维蛋白凝块的过程。纤溶酶在肝脏中 以无活性形式——纤溶酶原产生。尽管纤溶酶原不能切割纤维蛋白，但它仍与其有亲和性， 并且当纤维蛋白形成时其掺入至凝块中。纤溶酶原含有称为kringles (三环)的二级结构 基序，其特异性地结合纤维蛋白(纤维蛋白原)上的赖氨酸和精氨酸残基。当从纤溶酶原 转变为纤溶酶时，其作为丝氨酸蛋白酶发挥作用，特异性地切割C-末端上的这些赖氨酸和 精氨酸残基。纤维蛋白单体，当聚合时形成初原纤维。这些初原纤维含有两条链，它们反平 行地非共价缔合。在单链内，纤维蛋白单体通过凝血因子XIII的作用共价连接。因此，纤 溶酶对凝块的作用初步地在纤维蛋白中建立了切口 ；进一步消化导致溶解。组织纤溶酶原激活物(t-PA)和尿激酶是这样的药剂，即它们将纤溶酶原转变为 活性纤溶酶，因此使得发生纤维蛋白溶解。t-PA由血管的损伤内皮非常缓慢地释放至血液 中，使得几天后(当出血已经停止时)凝块分解。这种情况的出现是因为当凝块形成时纤 溶酶原陷入在凝块中；当其缓慢地活化时，其分解纤维蛋白网。t-PA和尿激酶本身受纤溶 酶原激活物抑制剂-1和纤溶酶原激活物抑制剂_2 (PAI-1和PAI-2)抑制。相比，纤溶酶通 过产生更多的tPA和尿激酶两者的活性形式而进一步刺激纤溶酶生成。α 2-抗纤溶酶和 α 2-巨球蛋白使纤溶酶失活。凝血酶活化的纤维蛋白溶解抑制剂(TAFI)也减少纤溶酶活 性，其将纤维蛋白修饰成为tPA介导的纤溶酶原活化的不太有效的辅因子。血液凝固级联的抑制剂血液凝固系统被该系统的许多天然存在的抑制剂所遏制。组织因子途径抑制剂 (TFPI)是一个与血浆脂蛋白并且和血管内皮缔合的34-kDa蛋白。TFPI是包含三个Kunitz 型结构域、酸性氨基末端和碱性羧基末端结构域的高亲和力丝氨酸蛋白酶抑制剂。其结合 并抑制Xa因子。然后Xa-TFP复合体与VIIa/组织因子相互作用并抑制X和IX因子的活 化。TFPI可防止凝血，除非初始存在的VIIa/组织因子生成足量的IXa因子以经“内源性” 途径维持X因子活化。因此VIIa/组织因子可提供对凝块的初始刺激(以相对小量的IXa和Xa的形式)，然后迅速地被转变，而IXa和VIIIa可以负责生成凝块形成所需的较大量的 Xa和凝血酶。抗凝血酶是58kDa糖蛋白丝氨酸蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白 (serpin))，其使丝氨酸蛋白酶；凝血酶和fXa，以及fXIIa，和fIXa失活。其持续地有活性， 但硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(糖胺聚糖)的存在或肝素的施用(不同的类肝素增加与F Xa, 凝血酶或两者的亲和力)增加其与这些因子的附着。抗凝血酶不使凝块结合的凝血酶或 fXa失活。抗凝血酶的数量或质量缺乏(先天性或获得性的，例如，在蛋白尿中)导致血栓 形成倾向。蛋白C是主要生理抗凝剂。其是维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶，其被凝血酶活化 成活化的蛋白C(APC)。活化形式(蛋白S和磷脂作为辅因子)降解Va因子和VIIIa因子。 蛋白C途径的关键酶，即活化的蛋白C，提供生理性的抗血栓形成活性，并且发挥抗炎和抗 细胞凋亡两种活性。其作用与血栓形成和缺血性卒中的发生有关。蛋白S是在肝脏中合成的维生素K依赖性血浆糖蛋白。在循环中，蛋白S以两种 形式存在游离形式和结合于补体蛋白C4b的复合体形式。蛋白S的最佳表征的功能是其 在抗凝途径中的作用，因为其在Va和VIIIa因子的失活中作为蛋白C的辅因子起作用。仅 游离形式具有辅因子活性。此外，蛋白S可经羧基GLA结构域与带负电荷的磷脂结合。此 特性允许蛋白S在清除正在经历凋亡的细胞中发挥作用，所述细胞在细胞表面上显示带负 电荷的磷脂。通过与带负电荷的磷脂结合，蛋白S作为凋亡细胞和吞噬细胞之间的桥分子 发挥作用。抗凝剂在正常状况下，促进血液凝固的因子与抑制它们的因子相平衡。当促凝刺激物压 倒抗凝剂和纤维蛋白溶解系统时发生静脉或动脉血栓形成。魏克氏三联征(Virchow' s triad)是一组已知影响凝块形成的三种因素流动速率、血液的浓度(稠度)以及血管壁 的性质。目前，治疗血栓形成的医疗干预是通过施用抗凝剂，其包括胃肠外施用，例如，低 分子量肝素(LMWH)，然后口服施用例如华法林。较新的一类药物，直接凝血酶抑制剂，正在 开发中；一些成员已经用于临床(诸如来匹卢定(1印irudin))。还有其他的小分子化合 物正在开发中，这些小分子化合物直接地干扰特定凝血因子的酶促作用(例如，利伐沙班 (rivaroxaban))。抗血小板剂包括阿司匹林，氯吡格雷，双嘧达莫和噻氯匹定；胃肠外糖蛋 白Ilb/IIIa抑制剂在血管成形术期间使用。肝素是天然存在的由嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生的高度硫酸化的糖胺聚糖。肝 素充当抗凝剂，防止凝块形成并防止已存在的凝块在血液内的延伸。尽管肝素不分解已经 形成的凝块(组织纤溶酶原激活物则会分解)，但其使机体的天然凝块溶解机制正常地工 作以分解已经形成的凝块。肝素与酶抑制剂抗凝血酶III (AT-III)结合，导致构象变化，造 成其活性位点暴露。然后活化的AT-III使凝血酶和参与血液凝固的其他蛋白酶(最显著 地是Xa因子)失活。由于与肝素的结合，AT-III使这些蛋白酶失活的速率增加1000倍。 AT-III结合肝素聚合物内包含的特异性五糖硫酸化序列。在肝素结合时AT-III的构象 变化介导其对Xa因子的抑制作用。然而，对于凝血酶抑制，凝血酶必须也在靠近五糖的位 点处结合肝素聚合物。肝素的高负电荷密度促进了其与凝血酶的非常强的静电相互作用。 AT-III、凝血酶和肝素之间的三元络合物的形成导致凝血酶的失活。为此原因，肝素针对凝血酶的活性是尺寸依赖性的，三元络合物的有效形成需要至少18个糖单位。相比，抗Xa因 子活性仅需要五糖结合位点。此尺寸差异性已经引领着开发小分子量肝素(LMWHs)，并且最 近开发了磺达肝素作为抗凝剂药物，其靶向抗Xa因子活性而非抗凝血酶(IIa)活性。如果 需要长期抗凝，仅经常使用肝素以开始抗凝治疗直至采用口服抗凝剂华法林。II、VII、IX和X因子在其N-末端彼此是同源的。在去除信号肽后，驻留在内质 网或高尔基体中的羧化酶与这些蛋白的每一种的前肽区结合，并在邻近的“Gla结构域”中 将 10-12个谷氨酸(Glu)残基转变为g_羧基谷氨酸(Gla)。在分泌之前前肽从羧化多 肽上被去除。Gla残基结合钙离子并且是这些凝血因子的活性所必需的。Gla的合成需要 维生素K。在g-羧化期间，维生素K变成氧化的，并且必需随后被还原以使循环继续进行。 抗凝药物华法林(来自香豆素组)抑制维生素K的还原，并且由此防止活性II、VII、IX和 X因子的合成。肝素的严重副作用是肝素诱发的血小板减少症(HIT综合征)。HITS由免疫反应引 起，该免疫反应使血小板在血管内聚集，由此消耗掉凝血因子。血小板凝块的形成可导致血 栓形成，而凝血因子和血小板的损失可导致出血。HITS可在给予肝素后很快发生(罕见)， 但也可以在当人已经使用肝素很长一段时间时发生。还存在有与早期使用肝素相关的血小 板减少症的良性形式，其消退不需要停用肝素。较少见的副作用包括长期使用的脱发和骨 质疏松症。此外，不确定的反应需要密切的患者监测，并且已经记载有过敏反应。与许多药 物一样，过量使用肝素可以是致命的。使用LMWH和磺达肝素，骨质疏松症和HIT的风险较 小。抗凝治疗，通常采用短期肝素注射和/或长期口服抗凝剂(通常为华法林)，当作 为预防措施，或作为急性动脉或静脉血栓形成的治疗措施给予高危患者时其能明显地有效 预防严重的血管事件。因此抗凝治疗防止凝块形成以及已有凝块的延伸。然而，足量抗凝 也是大多数内出血的常见原因，这些内出血包括颅内、胃肠或腹膜后出血，它们可以是致命 的。因此选择最可能从抗凝治疗中受益的患者(即，其中大多数血栓栓塞事件的风险超过 大多数出血的风险的患者)是很重要的；并且在抗凝治疗期间尽量减小血栓栓子和出血两 者的发病率和死亡率是很重要的。因此，存在着能够较好地控制和选择性地在预定的级联阶段抑制凝血级联的需 求。因此，开发作用于级联的特定组分的抗凝剂增加了施用抗凝药物的效率并减少了副作 用，诸如增加的出血危险。本发明致力于解决此问题并且提供了控制血液凝固级联的改进方案。发明_既述本发明涉及包含SEQ ID NO :1或由其组成的多肽，或与SEQ ID NO :1具有至少 70%序列同一性的多肽，或SEQ ID NO :1的多肽片段，所述多肽或其片段能够抑制凝血级联 的蛋白酶的活性。SEQ ID NO :1 多肽序列MMKCLFFLCLCLFPILVFSSTFTSQNPINLPSESPLPKPVLDTNGKELNPNLSYRIISTYWGALG⑶VY LGKSPNSDAPCPDGVFRYNSDVGPSGTPVRFIPLSTNIFEDQLLNIQFNIPTPKLCVSYTIWKVGNINAPLRTMLLE TGGTIGQADSSYFKIVKSSNFGYNLLYCPITRHFLCPFCRDDNFCAKVGVVIQNGKRRLALVNENPLDVLFQEV本发明还涉及SEQ ID NO 1的变体，和SEQ ID NO 1的片段的变体。
本发明进一步包括包含与N-末端侧翼序列可操作地融合的SEQ ID NO=I的融合 多肽。可选地，SEQ ID NO 1的片段与N-末端侧翼序列可操作地融合。最后，SEQ ID NO 1的变体或SEQ ID NO 1的片段的变体与N-末端侧翼序列可操作地融合。本发明进一步包括包含与C-末端侧翼序列可操作地融合的SEQ ID NO=I的融合 多肽。可选地，SEQ ID NO 1的片段与C-末端侧翼序列可操作地融合。最后，SEQ ID NO 1的变体或SEQ ID NO 1的片段的变体与C-末端侧翼序列可操作地融合。在另一个实施方案中，本发明涉及多肽SEQ ID N0:1、或SEQ ID NO :1的片段、或 SEQ ID NO :1的变体或SEQ ID NO :1的片段的变体的酸加成盐，所述盐优选地通过将多肽 或其片段或变体用无机酸或有机酸处理以提供所述多肽的水溶性盐而获得，所述无机酸诸 如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述有机酸诸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹 果酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙 磺酸、对甲苯磺酸、或水杨酸。本发明还涉及产生包含SEQ ID NO :1、或SEQ ID NO 1的片段、或SEQ IDNO 1的 变体、或SEQ ID NO :1的片段的变体的多肽的方法，包括从马铃薯采集马铃薯块茎并且提取 和纯化所述多肽的步骤。本发明进一步包括产生包含SEQ ID NO :1、或SEQ ID NO 1的片段的多肽的方法， 以及产生SEQ ID NO :1的变体或产生SEQ ID NO 1的片段的变体的方法，其中这些方法 包括下列步骤提供包含如上面所提到的核苷酸序列的任一个的多核苷酸或表达载体和在 分离的重组或转基因宿主细胞中表达所述多核苷酸或所述载体，从而产生根据本发明的多 肽。本发明进一步包括产生具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :1的片段的蛋白质的方 法，以及产生SEQ ID NO :1的变体或产生SEQ ID NO 1的片段的变体的方法，其中这些方法 包括下列步骤提供编码如本文上面所提到的多肽的多核苷酸，以及在体外，或在体内在适 当的宿主生物体内，表达所述多核苷酸，从而产生根据本发明的多肽。在另一个实施方案中，本发明涉及编码SEQ ID NO =USEQ ID NO :1的片段、SEQ ID NO 1的变体、或SEQ ID NO 1的片段的变体的多核苷酸。优选的多核苷酸是例如下面列举 的序列SEQ ID NO 2的编码区。aatcaatatg atgaagtgtttatttttcttatgtttgtgtttgtttcccattttggtgtt60
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agctactatg ttatgttgta aattaaaata aacacctgct aaggtatatc tatattttag 780catggatttc ttaataaatt gtctttcctt atcgtttaaa(SEQ ID NO 2)在一个实施方案中，本发明描述了能够与编码SEQ ID NO=USEQ ID NO :1的片段、 SEQ ID NO 1的变体或SEQ ID NO=I的片段的变体的多核苷酸杂交的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明包括编码SEQ ID NO 1的多核苷酸，编码SEQID NO 1的片段、或编码SEQ ID NO 1的变体、或编码SEQ ID NO 1的片段的变体的多核苷酸，其 中所述多核苷酸的编码所述多肽的部分与对应于SEQ IDNO 1的至少10个连续核苷酸的核 苷酸探针或其变体在严格条件下杂交。本发明还涉及包含编码SEQ ID NO =USEQ ID NO 1的片段、SEQ ID NO 1的变体 或SEQ ID NO :1的片段的变体的多核苷酸的表达载体，所述多核苷酸任选地与控制所述多 核苷酸在适当的宿主细胞中表达的调控序列可操作地连接。本发明进一步涉及包含SEQ ID NO :1,SEQ ID NO :1的片段，SEQ ID NO :1的变体， 或SEQ ID NO :1的片段的变体的多肽的分离的重组或转基因宿主细胞。本发明还涉及产生重组或转基因宿主细胞的方法，所述方法包括下列步骤提供 编码SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体或SEQ IDNO 1的片段的变 体的多核苷酸，将所述多核苷酸引入至所述重组或转基因宿主细胞中，并且任选地还在所 述重组或转基因宿主细胞中表达所述多核苷酸，从而生成产生所述多肽的重组或转基因宿 主细胞。在另一个实施方案中，本发明涉及一种包含上述的宿主细胞的转基因哺乳动物生 物体，其中所述哺乳动物宿主细胞是选自单系类群两侧对称动物的动物细胞，包括属于四 种主要谱系后口动物、蜕皮动物、扁形动物(Platyz0a)和冠轮动物的任一种的哺乳动物细 胞。哺乳动物宿主细胞可以是选自由下列各项组成的组的动物细胞卵裂球细胞，卵 细胞，胚胎干细胞，红细胞，成纤维细胞，肝细胞，成肌细胞，肌管，神经元，卵母细胞，成骨细 胞，破骨细胞，精细胞、T细胞和受精卵。还提供了一种产生所述哺乳动物宿主细胞的方法，所述方法包括下列步骤提供 编码SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体或SEQ IDNO 1的片段的变 体的多核苷酸，将所述多核苷酸引入至所述重组或转基因宿主细胞中，并且任选地还在所 述转基因哺乳动物宿主细胞中表达所述多核苷酸，从而生成产生所述多肽的转基因哺乳动 物宿主细胞。在另一个实施方案中，本发明涉及包含重组或转基因宿主细胞的转基因植物，所 述重组或转基因宿主细胞包含SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 1的片段，SEQID NO 1的变体或 SEQ ID NO 1的片段的变体的多肽。本发明进一步涉及一种产生上述转基因植物的方法，所述方法包括下列步骤提 供编码多肽SEQ ID NO :1，SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体或SEQ ID NO 1的片 段的变体的多核苷酸，将所述多核苷酸引入至所述植物中，从而生成产生所述多肽的转基 因植物。本发明进一步涉及一种转基因植物宿主细胞，其中所述宿主细胞是分类群有胚植物(Embryophyta)或绿色植物(Viridiplantae)或绿藻生物(Chlorobionta)的植物细胞， 优选地选自由下列各项组成的组糊粉层细胞，厚角细胞，内皮层细胞，胚乳细胞，表皮细 胞，叶肉细胞，分生组织细胞，栅栏细胞，薄壁细胞，韧皮部筛管细胞，花粉生殖细胞，花粉营 养细胞，厚壁组织细胞，管胞细胞，木质部导管细胞和受精卵细胞。在一个具体实施方案中，所述转基因植物是马铃薯植物。在另一个实施方案中，本发明涉及一种重组细菌宿主细胞，其包含多肽SEQID NO 1,SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体或SEQ ID NO 1的片段的变体和/或编码SEQ ID NO :1,SEQ ID NO :1的片段，SEQ ID NO 1的变体或SEQID NO 1的片段的变体的多核苷 酸和/或包含编码SEQ ID NO :1，SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体或SEQ ID NO 1的片段的变体的多核苷酸的载体。本发明还涉及一种细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞选自革兰氏阳性细菌宿 主细胞和革兰氏阴性细菌宿主细胞。本发明进一步涉及一种产生上述宿主细胞的方法，所述方法包括下列步骤提供 编码多肽SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体或SEQID NO 1的片段 的变体的多核苷酸，将所述多核苷酸引入至所述细菌细胞中，并且任选地还在所述细菌细 胞中表达所述多核苷酸，从而生成产生所述多肽的重组细菌细胞。在另一个实施方案中，本发明涉及一种重组酵母细胞，其包含多肽SEQ IDNO=I, SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体或SEQ ID NO 1的片段的变体和/或编码SEQ ID NO :1,SEQ ID NO :1的片段，SEQ ID NO :1的变体或SEQ IDNO 1的片段的变体的多核苷 酸和/或包含编码SEQ ID NO :1，SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体或SEQ ID NO 1的片段的变体的多核苷酸的载体。本发明进一步涉及一种产生上述的重组酵母细胞的方法，所述方法包括下列步 骤提供编码多肽SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体或SEQ ID NO 1的片段的变体的多核苷酸，将所述多核苷酸引入至所述酵母细胞中，并且任选地还在所述 酵母细胞中表达所述多核苷酸，从而生成产生所述多肽的重组酵母细胞。在另一个实施方案中，本发明涉及一种重组真菌宿主细胞，其包含多肽SEQID NO 1,SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体或SEQ ID NO 1的片段的变体和/或编码SEQ ID NO :1,SEQ ID NO :1的片段，SEQ ID NO 1的变体或SEQID NO 1的片段的变体的多核苷 酸和/或包含编码SEQ ID NO :1，SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体或SEQ ID NO 1的片段的变体的多核苷酸的载体。本发明进一步涉及一种产生上述的重组真菌宿主细胞的方法，所述方法包括下列 步骤提供编码多肽SEQ ID NO :1，SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO :1的变体或SEQ ID NO 1的片段的变体的多核苷酸，将所述多核苷酸引入至所述真菌细胞中，并且任选地还在所述 真菌细胞中表达所述多核苷酸，从而生成产生所述多肽的重组真菌细胞。在另一个实施方案中，本发明涉及对多肽SEQ ID NO :1,SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体或SEQ ID NO=I的片段的变体特异的抗体，或其结合片段。本发明还涉及一种产生对多肽SEQ ID NO :1,SEQ ID NO :1的片段，SEQ IDNO :1的 变体或SEQ ID NO :1的片段的变体特异的多克隆抗体或其结合片段的方法，所述方法包括 下列步骤用所述多肽在诱发抗体应答的条件下免疫哺乳动物对象，鉴定与所述多肽特异
10性结合的抗体，以及任选地从所述哺乳动物对象中分离所述抗体或其结合片段。本发明进一步涉及一种产生对多肽SEQ ID NO :1，SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO :1的变体或SEQ ID NO :1的片段的变体特异的单克隆抗体的方法，所述方法包括下列步 骤用所述多肽在诱发抗体应答的条件下免疫哺乳动物对象，制备产生对所述多肽特异的 单克隆抗体的杂交瘤，以及鉴定与所述多肽特异性结合的抗体。本发明还涉及能够被上述抗体识别的多肽。在另一个实施方案中，本发明涉及包含多肽SEQ ID NO :1，SEQ ID NO 1的片段， SEQ ID NO 1的变体或SEQ ID NO=I的片段的变体以及生理学可接受的载体的组合物。本发明还涉及包含多肽SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体 或SEQ ID NO :1的片段的变体以及药学可接受的载体的药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含多肽SEQ ID NO :1，SEQ ID NO 1的片段， SEQ ID NO :1的变体或SEQ ID NO 1的片段的变体以及生理学可接受的载体和一种或多种 另外的作用于止血中的血小板凝集的医用生物活性剂(抗血小板剂)的组合物。本发明还涉及包含多肽SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体 或SEQ ID NO :1的片段的变体以及药学可接受的载体和一种或多种另外的作用于止血中的 血小板凝集的医用生物活性剂(抗血小板剂)的药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含多肽SEQ ID NO :1，SEQ ID NO 1的片段， SEQ ID NO :1的变体或SEQ ID NO 1的片段的变体以及生理学可接受的载体和一种或多种 另外的作用于止血中的血液凝固级联的医用生物活性剂(抗凝剂)的组合物。本发明还涉及包含多肽SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体 或SEQ ID NO :1的片段的变体以及药学可接受的载体和一种或多种另外的作用于止血中的 血液凝固级联的医用生物活性剂(抗凝剂)的药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含多肽SEQ ID NO :1，SEQ ID NO 1的片段， SEQ ID NO :1的变体或SEQ ID NO 1的片段的变体以及生理学可接受的载体和一种或多种 另外的作用于止血中的纤维蛋白溶解的医用生物活性剂(纤维蛋白溶解剂)的组合物。本发明还涉及包含多肽SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体 或SEQ ID NO :1的片段的变体以及药学可接受的载体和一种或多种另外的作用于止血中的 纤维蛋白溶解的医用生物活性剂(纤维蛋白溶解剂)的药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含多肽SEQ ID NO :1，SEQ ID NO 1的片段， SEQ ID NO :1的变体或SEQ ID NO :1的片段的变体以及生理学可接受的载体和一种或多 种另外的选自由抗血小板剂、抗凝剂和纤维蛋白溶解剂组成的组的医用生物活性剂的组合 物。本发明还涉及包含多肽SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体 或SEQ ID NO :1的片段的变体以及药学可接受的载体和一种或多种另外的选自由抗血小板 剂、抗凝剂和纤维蛋白溶解剂组成的组的医用生物活性剂的药物组合物。还在另一个实施方案中，本发明涉及一种多组分试剂盒，其包含多肽SEQ IDNO=I, SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体或SEQ ID NO 1的片段的变体或上述的组合物 之一，以及至少一种另外的组分。本发明还涉及一种鉴定多肽SEQ ID NO :1，SEQ ID NO 1的片段，SEQ IDNO 1的变体或SEQ ID NO :1的片段的变体的结合伴侣的方法，所述方法包括提取所述多肽和分离 所述结合伴侣的步骤。本发明涉及用作药物的多肽SEQ ID NO :1,SEQ ID NO :1的片段，SEQ IDNO :1的变 体或SEQ ID NO 1的片段的变体或上述的包含SEQ ID NO 1, SEQ IDNO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体或SEQ ID NO 1的片段的变体的组合物之一。本发明还涉及一种使用上述的结合伴侣治疗需要该治疗的个体的方法，所述结合 伴侣诸如SEQ ID NO :1，SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体或SEQ ID NO 1的片段 的变体的激动剂或拮抗剂。本发明还涉及一种使用上述的结合伴侣结合所述多肽治疗需要该治疗的个体的 方法，所述结合伴侣诸如SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 1的片段，SEQ ID NO 1的变体或SEQ ID NO :1的片段的变体的激动剂或拮抗剂。本发明还涉及一种使用上述的结合伴侣治疗需 要该治疗的个体的方法，所述结合伴侣诸如SEQ IDNO :1,SEQ ID NO :1的片段，SEQ ID NO: 1的变体或SEQ ID NO 1的片段的变体的激动剂或拮抗剂。本发明进一步涉及一种治疗冠状动脉综合征的方法，包括将上述的组合物之一施 用于需要其的个体。在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗选自由下列各项组成的组的冠状动脉 综合征的药物组合物稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、心肌缺血、心肌梗塞、扩张型心肌 病、肥厚型心肌病、充血性心力衰竭和心力衰竭，所述药物组合物包含上述的一种或多种组 合物。另外本发明涉及一种治疗心房颤动的方法，包括将上述的一种或多种组合物施用 于需要其的个体。本发明还涉及用于治疗心房颤动和心脏复律的药物组合物，其包含上述的一种或 多种组合物。本发明进一步涉及一种治疗外周动脉闭塞的方法，包括将上述的一种或多种组合 物施用于需要其的个体。在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗由原发性或复发性血栓形成、栓塞或 动脉粥样硬化引起的外周动脉闭塞的药物组合物，其包含上述的一种或多种组合物。本发明还涉及一种治疗深静脉血栓形成的方法，包括将上述的一种或多种组合物 施用于需要其的个体。在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗深静脉血栓形成和肺栓塞的药物组合 物，其包含上述的一种或多种组合物。本发明还涉及一种治疗在体外回路和导管中凝血的方法，包括将上述的一种或多 种组合物施用于需要其的个体。在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗在心肺转流术和血液透析期间体外回 路中凝血的药物组合物，其包含上述的一种或多种组合物。本发明还涉及一种治疗血管成形术期间凝血的方法，包括将上述的一种或多种组 合物施用于需要其的个体。在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗血管成形术期间凝血的药物组合物， 其包含上述的一种或多种组合物。
本发明还涉及一种治疗与人工心脏瓣膜置换有关的凝血的方法，包括将上述的一 种或多种组合物施用于需要其的个体。在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗与假体心脏瓣膜置换有关的凝血的药 物组合物，其包含上述的一种或多种组合物。本发明还涉及一种治疗由侵袭心脏瓣膜的疾病引起的凝血的方法，包括施用上述 的一种或多种组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗由侵袭心脏瓣膜的疾病引起的凝血的 药物组合物，其包含上述的一种或多种组合物，所述疾病包括感染的瓣膜(细菌性心内膜 炎)、风湿性二尖瓣疾病、二尖瓣狭窄、二尖瓣脱垂、二尖瓣环钙化和孤立性主动脉瓣疾病。本发明还涉及一种治疗具有血栓形成倾向综合征的患者中的凝血的方法，包括施 用上述的一种或多种组合物。在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于治疗具有血栓形成倾向综合征的患者 中的凝血的药物组合物，其包含上述的一种或多种组合物，所述血栓形成倾向综合征包括 抗磷脂综合征、V因子莱顿突变、凝血酶原突变/11因子突变、由MTHFR突变或维生素缺乏 (维生素B6，B12和叶酸)引起的高同型半胱氨酸水平、抗凝血酶的肾损失、纤溶酶原和纤 维蛋白溶解功能障碍、阵发性夜间血红蛋白尿、蛋白C缺乏、蛋白S缺乏和抗凝血酶III缺 乏。本发明还涉及一种治疗凝血控制后的凝血的方法，包括施用上述的一种或多种组 合物。还在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗由于增加出血风险的病症的存在而 采取的凝血控制后的凝血的药物组合物，其包含上述的一种或多种组合物，所述增加出血 风险的病症包括血友病A、血友病B、血友病C、Von Willebrand病、大量失血、血小板无力症 (Glanzmann' s thrombasthenia)、巨大血小板综合征(Bernard-Soul ier syndrome)、灰色 血小板综合征和δ贮藏池缺乏症(delta storagepool deficiency)。另外，本发明涉及一种治疗导致血小板激活增加的血小板数目减少的方法，包括 将上述的一种或多种组合物施用于需要其的个体。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及用于治疗由于产量不足(例如，在骨髓 增生异常综合征或其他骨髓功能障碍中)、免疫系统造成的破坏(免疫性血小板减少性紫 癜/ITP)和由于各种原因引起的消耗(血栓性血小板减少性紫癜/TTP、溶血性尿毒症综合 征/HUS、阵发性夜间血红蛋白尿/PNH、弥散性血管内凝血/DIC、肝素诱导的血小板减少症 /HIT)导致的血小板数目减少所引起的凝血的药物组合物，其包含上述的一种或多种组合 物。本发明进一步涉及一种治疗不耐受市场上靶向凝血的其他治疗药物的个体中任 何原因的凝血的方法，包括将上述的一种或多种组合物施用于需要其的个体。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及用于治疗不耐受市场上靶向凝血的其他 治疗药物的个体中的凝血的药物组合物，其包含上述的一种或多种组合物。本发明还涉及一种治疗因任何原因而不活动的个体、患临界性肢体缺血或已经截 肢的患者中的凝血的方法，包括将上述的一种或多种组合物施用于需要其的个体。在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗因任何原因而不活动的个体、患临界性肢体缺血或已经截肢的患者中的凝血的药物组合物，其包含上述的一种或多种组合物。本发明还涉及一种治疗接受任何形式的化学治疗的患者中的凝血的方法，包括将 上述的一种或多种组合物施用于需要其的个体。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及用于治疗接受任何形式的化学治疗的患 者中的凝血的药物组合物，其包含上述的一种或多种组合物。本发明还涉及一种治疗处于发生血凝块的高危的患者中的凝血的方法，包括将上 述的一种或多种组合物施用于需要其的个体。还在另一个优选的实施方案中，本发明涉及用于治疗处于发生血凝块的高危的患 者中的凝血的药物组合物，其包含上述的一种或多种组合物。定义“血栓形成”是指形成血栓，且“血栓”是血凝块，S卩，止血的血液凝固级联的最终步 骤。在损伤的情况下血栓是生理性的，但在血栓形成从而在未受损伤的血管中发生的情况 下其是病理性的。血栓形成通常发生在血管壁或心脏壁损害的部位处(例如，粥样硬化斑 块的破裂；患病的或置换心脏瓣膜；心肌梗塞后心内膜损伤以后的附壁血栓)和/或血流 扰动(例如，心房颤动，卧床患者中的腿部静脉)。通过形态学研究(病理学，血管造影和血 管内窥镜)；止血变量的流行病学研究(与血小板、凝固和纤维蛋白溶解有关)；以及尤其 是通过对抗血小板、抗凝或溶栓治疗的大型随机化对照试验，已经确定了血小板_纤维蛋 白血栓对动脉和静脉闭塞以及对临床事件的作用。当物体(栓子，多个栓子)从机体的一个部位移行(通过循环)并且导致机体另 一部位中的血管阻塞(闭塞)时发生“栓塞”。“止血”是指使出血停止的生理过程的术语。其由多个步骤组成，包括1)血管收缩 以尽量减小血管腔直径并且延缓出血，2)血小板聚集，3)凝固以及4)纤维蛋白溶解，从而 降解血凝块。术语“凝血级联”或“血液凝固级联”是继发性止血的一部分，并且是指其中血液 和血管组分通过顺序地酶促激活凝血因子，最终导致包含纤维蛋白凝胶和血小板的固体血 凝块形成而对刺激发生反应的多步骤过程。术语“心脏复律”是终止异常快的心率或心律失常的过程。此过程可通过在心动 周期中的特定时刻向心脏递送治疗剂量的电流(表示‘同步心脏电复律’)，或通过使用药 物治疗代替电击从而转变心律失常(‘药物心脏复律’)而获得。“生物活性剂”是提供一些可在体内或体外证明的经常是有益的药理学作用的任 何药剂、药物、化合物、物质的组合物或混合物。如本文所使用，该术语进一步包括在患者中 产生局部或全身作用的任何生理学或药理学活性物质。生物活性剂的进一步实例包括，但 不限于，包括寡糖或由其组成的药剂，包括多糖或由其组成的药剂，包括任选地糖基化的肽 或由其组成的药剂，包括任选地糖基化的多肽或由其组成的药剂，包括寡核苷酸或由其组 成的药剂，包括多核苷酸或由其组成的药剂，包括脂质或由其组成的药剂，包括脂肪酸或由 其组成的药剂，包括脂肪酸酯或由其组成的药剂和包括次级代谢产物或由其组成的药剂。如本文所使用的术语“治疗(treating，treatment) ”和“疗法(therapy) ”同等 地指治愈性治疗、预防性治疗或预防治疗和改善性治疗。该术语包括可在临床上建立的获 得有益或所需生理学结果的方式。为本发明的目的，有益的或所需的临床结果包括，但不限
14于，症状的减轻，病变范围的减小，稳定(即，不恶化)状态，延缓或减慢状况/症状的进展 或恶化，状况或症状的改善或减轻，以及缓解(部分或全部)，不管可检测到或检测不到。如 本文所使用，术语“减轻”和其变化形式，是指与不施用本发明的组合物相比，生理状况或症 状的程度和/或不合乎需要的表现被减少和/或进展的时程被减慢或延长。术语“二级预防”是指病理状况首次出现后的预防性治疗，所述病理状况诸如心肌 梗塞，缺血性卒中，心绞痛和外周动脉疾病。如果通过构成术语“治疗”的定义的标准测量，被治疗状况有变化，则表现“治疗效 应”或“治疗性效应”。如果存在至少5%改善，优选地10%改善，更优选地至少25%改善， 甚至更优选地至少50%改善，诸如至少75%，且最优选地至少100%改善，则被治疗状况有 “变化”。所述变化可基于个体中被治疗状况的严重性改善，或基于使用或不使用生物活性 剂或生物活性剂结合本发明的药物组合物治疗的个体的群体中状况改善的频率的差异。“生物活性剂”的“药理学有效量”、“药学有效量”或“生理学有效量”是当施用如本 文所述的药物组合物时需要在待治疗的个体的血流中或作用部位(例如，肺，胃系统，结直 肠系统，前列腺等)处提供所需水平的活性剂以得到预期的生理学响应的所述药物组合物 中存在的活性剂的量。准确的用量将取决于许多因素，例如，活性剂，组合物的活性，采用的 递送装置，组合物的物理性质，预期的患者应用(即，每天施用的剂量次数)，患者考虑等， 并且可容易地由本领域普通技术人员基于本文提供的信息来确定。生物活性剂的“有效量” 可在一次给药中施用，或通过总计为有效量的量的多次给药来施用，优选地在24小时的时 间内。其可使用用于确定给药的适当的量和时机的标准临床方法来确定。要理解，就卫生 保健治疗专家和/或个人而言“有效量”可以是经验性和/或个体化(个例)确定的结果。如本文所使用，术语“增强”和“改善”有益效果，及其变化形式是指生物活性剂相 对于安慰剂的治疗效应，或现有技术医学治疗的治疗效应的增加在通常当施用药物组合物 而不施用本发明的生物活性剂时获得的治疗效应之上。当由于施用(多种)生物活性剂而 使获得的治疗效应的强度和/或程度加速和/或增加时，表现“治疗效应的增加”。其还包 括治疗益处的持续时间延长。在当药物组合物与本发明提供的(多种)生物活性剂共同施 用时与缺少该生物活性剂时该药物组合物的较高给药量相比，需要较少量的该药物组合物 以获得相同的益处和/或效应的时候，也可表现“治疗效应的增加”。增强效应优选地，但非 必需的，产生对急性症状的治疗，对于该急性症状单独的药物组合物在治疗上无效或不太 有效。当本发明的生物活性剂与药物组合物共同施用时，与单独施用该药物组合物相比，当 存在治疗效应的至少5%增加，诸如治疗效应的至少10%增加时达到增强作用。优选地，所 述增加为至少25%，更优选地至少50%，甚至更优选地至少75%，最优选地至少100%。如本文所使用，(多种)生物活性剂，或生物活性剂和现有技术药物的“共同使用” 或“共同给药”是指在特定时间周期内施用一种或多种本发明的生物活性剂，或施用本发明 的一种或多种生物活性剂和现有技术药物组合物。所述时间周期优选地小于72小时，诸如 48小时，例如小于24小时，诸如小于12小时，例如小于6小时，诸如小于3小时。然而，这 些术语还指生物活性剂和治疗性组合物可在一起施用。术语“个体”指脊椎动物，特别是哺乳动物物种的成员，并且包括，但不限于家养动 物，诸如牛，马，猪，羊，水紹，狗，猫，小鼠，豚鼠，兔，大鼠；体育动物，诸如马，多种矮马(poly ponies)，狗，骆驼，以及灵长类，包括人。
如在本发明中所使用，术语“多组分试剂盒”提供根据本发明的多肽和用于联合给 药的第二种生物活性剂。组合的活性物质可用于同时的、顺序的或单独的给药。在所有情 况下，优选本文提到的药物和生物活性剂的任一种以药学有效量施用，即，包括足以显示有 意义的患者益处的药物或药物组合物的各种活性组分的总量或方法的施用。制剂可通过本 领域普通技术人员知晓的方法方便地以单位剂型提供。优选地，试剂盒可例如包含在用于 给药的多种剂型中的活性化合物。一种剂型含有足量的一种或多种活性化合物，使得当施 用于对象时可获得所需的效应。因此，优选医药包装包括与相关给药方案对应的剂量单位 的量。因此，在一个实施方案中，医药包装包括药物组合物，其包含如上所定义的化合物或 其药学可接受的盐和药学可接受的载体、赋形剂和/或辅料。医药包装可以是任何合适的 形式，例如，用于肠内(经消化道)或胃肠外(消化道以外的途径)给药。在另一个优选的 实施方案中，该包装是药筒的形式，诸如注射笔的药筒，所述注射笔诸如已知用于胰岛素治 疗的注射笔。优选地，多组分试剂盒含有使用说明书，其指示为达到所需效应的所述剂型的 使用以及在规定的时间周期内摄入的剂型的量。因此，在一个实施方案中，所述医学包装包 括用于施用所述药物组合物的使用说明书。考虑到的是，至少一种(诸如2种或3种)另 外的在止血中或在对止血的基本病因或其危险的治疗中起作用的药物，和至少一种(诸如 2种或3种)根据本发明的多肽可用于制备本文所述的用于施用于需要其的个体的任一种 “多组分试剂盒”。“生物假体瓣膜”是一种包含生物材料的人工或假体心脏瓣膜。此类生物或生物假 体瓣膜是动物如猪的瓣膜，其经历几个化学步骤以便使其适于植入在人心脏中。猪心脏最 类似于人心脏，因此是在解剖学上最适于置换的代表。猪瓣膜的植入是一种异种移植术，或 异种移植物，其指从一个物种(在本例中为猪)至另一个物种的移植。存在一些与异种移 植物相关的危险，诸如人体有排斥异物的倾向。可使用药物治疗来延缓这种效应，但不一定 是成功的。另一类型的生物瓣膜利用生物组织来制成缝在金属框架中的小叶。该组织一般 从牛(奶牛)或马科动物(马)的心包囊获取。心包囊由于其非常耐用的物理性能而特别 适合用作瓣膜小叶。此类生物瓣膜是非常有效的瓣膜置换方式。该组织被灭菌从而去除生 物标志物，消除宿主免疫系统的应答。在美国和欧洲最常用的心脏瓣膜是那些利用组织小 叶的瓣膜。在亚洲和拉丁美洲较常使用机械瓣膜。术语“SEQ ID NO 1的同源物”是指具有与SEQ ID NO=I相似但不同的序列的多 肽，因为其是包含SEQ ID NO :1或其片段或由它们组成的多肽。术语“SEQ ID NO 1的变体”是指具有与SEQ ID NO 1相似但不同的序列的多肽， 因为其是SEQ ID NO :1或其片段的多肽变体。变体多肽具有如下的氨基酸序列，其是根据 本发明的多肽的修饰形式。所述修饰形式包括一个或多个氨基酸的一个或多个保守置换或 一个或多个等价置换，其改变SEQ ID NO :1的多肽的序列，但不改变其生物学活性。如本文所使用，“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或 核糖核酸(RNA)，寡核苷酸，通过聚合酶链式反应(PCR)生成的片段，以及通过连接、切断、 核酸内切酶作用和核酸外切酶作用的任一种生成的片段。核酸分子可由单体组成，所述单 体为天然存在的核苷酸(诸如DNA和RNA)，或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在 的核苷酸的α-对映体形式)，或两者的组合。修饰的核苷酸可具有在糖部分和/或嘧啶或 嘌呤碱基部分中的改变。糖修饰作用包括，例如，一个或多个羟基被卤素、烷基、胺和叠氮基置换，或糖可被官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可用空间上和电子上相似的结构置换， 诸如氮杂_糖和碳环糖类似物。碱基部分中的修饰作用的实例包括烷基化嘌呤和嘧啶，酰 化嘌呤或嘧啶，或其他公知的杂环取代基。核酸单体可通过磷酸二酯键或所述键的类似物 连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫 代磷酰氨酸酯(phosphoroanilothioate)、磷酰氨酸酯(phosphoranilidate)、氨基磷酸酯 等。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，其包含与聚酰胺主链连接的天然存在的或修 饰的核酸碱基。核酸可以是单链的或双链的。术语“天然核苷酸”是指四种脱氧核糖核苷酸dA、dG、dT和dC(DNA的成分)的任 意一种，并且四种核糖核苷酸，A、G、U和C(RNA的成分)是天然核苷酸。各种天然核苷酸包 括糖部分(核糖或脱氧核糖)、磷酸部分以及天然/标准碱基部分或主要由它们组成。天 然核苷酸与互补核苷酸根据公知的碱基配对法则(Watson和Crick)结合，其中腺嘌呤(A) 与胸腺嘧啶⑴或尿嘧啶⑶配对；以及鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对，其中相应的碱基 对是互补的反平行的核苷酸链的一部分。碱基配对导致预定的和互补的核苷酸之间的特异 性杂交。碱基配对是酶能够催化与模板寡核苷酸互补的寡核苷酸的合成的基础。在此合成 中，构件(通常为A，T，U，C或G的核糖或脱氧核糖衍生物的三磷酸盐)被模板寡核苷酸引 导以形成具有正确的互补序列的互补寡核苷酸。由此互补序列对寡核苷酸序列的识别通过 形成碱基对的相应的和相互作用的碱基来介导。本质上，产生碱基配对的特异性相互作用 是由碱基的大小和碱基的氢键供体和受体的模式来决定的。大的嘌呤碱基(A或G)与小的 嘧啶碱基(T、U或C)配对。另外，碱基之间的碱基对识别受碱基之间形成的氢键影响。在 Watson-Crick碱基对的几何形状中，将6元环(天然寡核苷酸中的嘧啶)并排成由稠合的 6元环和5元环(天然寡核苷酸中的嘌呤)构成的环系，中间的氢键连接两个环原子，并且 任一侧上的氢键连接附着于各个环的官能团，供体基团与受体基团相配对。术语“核酸分子的互补体”是指与参考核苷酸序列相比具有互补的核苷酸序列和 相反方向的核酸分子。例如，序列5' ATGCACGGG 3'与5' CCCGTGCAT3'互补。术语“简并核苷酸序列”指与编码多肽的参考核酸分子相比，包括一个或多个简并 密码子的核苷酸的序列。简并密码子含有不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基 (即，GAU和GAC三联体均编码Asp)。术语“结构基因”是指转录为信使RNA(mRNA)，然后翻译为特定多肽特有的氨基酸 序列的核酸分子。“分离的核酸分子”是未整合在生物体的基因组DNA中的核酸分子。例如，已经与 细胞的基因组DNA分开的、编码生长因子的DNA分子是分离的DNA分子。分离的核酸分子 的另一实例是未整合在生物体的基因组中的化学合成的核酸分子。已经从特定物种中分离 的核酸分子小于来自该物种的染色体的完整DNA分子。“核酸分子构建体”是单链或双链的核酸分子，其已经通过人为干预被修饰从而含 有以天然不存在的排列合并和并置的核酸节段。“线性DNA”指具有游离的5'和3'端的非环状DNA分子。线性DNA可从闭合的 环状DNA分子诸如质粒通过酶消化或物理性断裂而制备。“互补DNA(cDNA) ”是单链DNA分子，其通过逆转录酶从mRNA模板形成。典型地， 与mRNA的各部分互补的引物被用来启动逆转录。本领域普通技术人员还使用术语“cDNA”来指由此类单链DNA分子及其互补DNA链组成的双链DNA分子。术语“cDNA”还指从RNA 模板合成的cDNA分子的克隆。“启动子”是引导结构基因转录的核苷酸序列。典型地，启动子位于基因的5'非编 码区中，靠近结构基因的转录起始位点。启动子内在转录的启动中起作用的序列元件的特 征常常在于共有核苷酸序列。这些启动子元件包括RNA聚合酶结合位点，TATA序列，CAAT序 列，分化特异性元件(DSEs ；McGehee 等，Mol. Endocrinol. 7 :551 (1993))，环 AMP 应答元件 (CREs)，血清应答元件(SREs ；Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1 :47 (1990))，糖皮质 激素应答元件(GREs)，和其他转录因子的结合位点，诸如CRE/ATF(0' Reilly等，J. Biol. Chem. 267 19938 (1992)), AP2(Ye 等，J. Biol. Chem. 269:25728(1994))，SPl，cAMP 应答元 件结合蛋白(CREB ；Loeken, Gene Expr. 3 253(1993))和八聚体因子(通常，参见，Watson 等，编辑，Molecular Biology of the Gene (基因的分子生物学)，第四版(TheBenjamin/ Cummings Publishing Company, Inc. 1987),以及 Lemaigre 禾口 Rousseau, Biochem. J. 303 1(1994))。如果启动子是诱导型启动子，则响应于诱导剂转录速率增加。相反，如果启动子 是组成型启动子则转录速率不受诱导剂调节。还已知有阻抑型启动子。“核心启动子”含有用于启动子功能的必需核苷酸序列，包括TATA盒和转录起始 点。通过此定义，在缺少可增强活性或赋予组织特异性活性的特定序列的情况下，核心启动 子可以具有或不具有可检测活性。“调控元件”是调节核心启动子的活性的核苷酸序列。例如，调控元件可含有与使 转录专门或优先地在特定细胞、组织或细胞器中进行的细胞因子结合的核苷酸序列。这些 类型的调控元件通常与以“细胞特异性”、“组织特异性”或“细胞器特异性”的方式表达的 基因有关。“增强子”是一类调控元件，其可增加转录效率，无论增强子相对于转录起始位点 的距离或方向如何。“异源性DNA”是指天然不存在于指定宿主细胞内的DNA分子或DNA分子的群体。 对特定宿主细胞异源的DNA分子可含有来源于该宿主细胞物种的DNA ( S卩，内源性DNA)，只 要宿主DNA与非宿主DNA (S卩，外源性DNA)合并在一起。例如，含有与包含转录启动子的宿 主DNA节段可操作地连接的编码多肽的非宿主DNA节段的DNA分子被认为是异源性DNA分 子。相反地，异源性DNA分子，可包含与外源性启动子可操作地连接的内源性基因。作为另 一种说明，如果DNA分子被引入至缺少野生型基因的突变细胞中，则包含来源于野生型细 胞的基因的DNA分子被认为是异源性DNA。“多肽”是优选地专门通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物，无论是天然或合成产 生的。通过非宿主DNA分子表达产生的多肽是“异源的”肽或多肽。如本文所使用，术语“多 肽”涵盖蛋白质、肽和多肽，其中所述蛋白质、肽或多肽可以已经或尚未被翻译后修饰。翻译 后修饰作用可以是例如，磷酸化、甲基化和糖基化。“氨基酸残基”可以是通过肽键或不同于肽键的键连接的天然的或非天然的氨基 酸残基。氨基酸残基可以是D-构型或L-构型。氨基酸残基包括被包含碳原子或碳原子链 的中央部分分开的氨基末端部分(NH2)和羧基末端部分(C00H)，它们中的至少一个包含至 少一个侧链或官能团。NH2是指存在于氨基酸或肽的氨基末端处的氨基，并且C00H是指存 在于氨基酸或肽的羧基末端处的羧基。上位术语氨基酸包括天然和非天然氨基酸两者。列
18举在 J.Biol. Chem.，243 =3552-59(1969)中和在 37C. F. R.，1.822(b) (2)节中被采用的标准 命名的天然氨基酸属于本文下面表1中所列举的氨基酸组。非天然氨基酸是表1中未列举 的那些氨基酸。非天然氨基酸的实例是例如，列举在37C. F. R. 1.822(b) (4)节中的那些，所 有这些氨基酸均通过引用合并于此。此外，非天然氨基酸残疾包括，但不限于，修饰的氨基 酸残基、L-氨基酸残基以及D-氨基酸残基的立体异构体。
权利要求
包含SEQ ID NO1或由SEQ ID NO1组成的多肽，或与SEQ ID NO1具有至少70％的序列同一性的多肽，或SEQ ID NO1的多肽片段，所述多肽或其片段能够抑制凝血级联的蛋白酶的活性。
2.与SEQID NO :1具有至少70%的序列同一性的SEQ ID NO :1的多肽变体，或SEQ ID N0:1的片段的多肽变体。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽与SEQID NO :1具有至少80%的序列同 一性，诸如至少81%的序列同一性，例如至少82%的序列同一性，诸如至少83%的序列同 一性，例如至少84%的序列同一性，诸如至少85%的序列同一性，例如至少86%的序列同 一性，诸如至少87 %的序列同一性，例如至少88 %的序列同一性，诸如至少89 %的序列同 一性，例如至少90 %的序列同一性，诸如至少91 %的序列同一性，例如至少92 %的序列同 一性，诸如至少93%的序列同一性，例如至少94%的序列同一性，诸如至少95%的序列同 一性，例如至少96%的序列同一性，诸如至少97%的序列同一性，例如至少98%的序列同 一性，诸如至少99%的序列同一性，例如至少99. 5%的序列同一性，或含有SEQ IDN0 1的 片段。
4.一种包含根据权利要求1-3中任一项所述的多肽以及生理学可接受的载体的组合物。
5.一种包含根据权利要求1-3中任一项所述的多肽以及药学可接受的载体的药物组 合物。
6.一种用于治疗选自由下列各项组成的组的冠状动脉综合征的药物组合物稳定型 心绞痛、不稳定型心绞痛、心肌缺血、心肌梗塞、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、充血性心力 衰竭和心力衰竭，所述药物组合物包括根据权利要求4或5所述的组合物。
7.一种用于治疗心房颤动和心脏复律的药物组合物，包括根据权利要求4或5所述的 组合物。
8.一种用于治疗由原发性或复发性血栓形成、栓塞或动脉粥样硬化引起的外周动脉闭 塞的药物组合物，包括根据权利要求4或5所述的组合物。
9.一种用于治疗深静脉血栓形成和肺栓塞的药物组合物，包括根据权利要求4或5所 述的组合物。
10.一种用于治疗在心肺转流术和血液透析期间体外回路中凝血的药物组合物，包括 根据权利要求4或5所述的组合物。
11.一种用于治疗血管成形术期间凝血的药物组合物，包括根据权利要求4或5所述的 组合物。
12.一种用于治疗与假体心脏瓣膜置换有关的凝血的药物组合物，包括根据权利要求 4或5所述的组合物。
13.一种用于治疗由侵袭心脏瓣膜的疾病引起的凝血的药物组合物，包括根据权利要 求4或5所述的组合物，所述疾病包括感染的瓣膜(细菌性心内膜炎)、风湿性二尖瓣疾病、 二尖瓣狭窄、二尖瓣脱垂、二尖瓣环钙化和孤立性主动脉瓣疾病。
14.一种用于治疗具有血栓形成倾向综合征的患者中的凝血的药物组合物，包括根据 权利要求4或5所述的组合物，所述血栓形成倾向综合征包括抗磷脂综合征、V因子莱顿突 变、凝血酶原突变/II因子突变、由MTHFR突变或维生素缺乏(维生素B6、B12和叶酸)引起的高同型半胱氨酸水平、抗凝血酶的肾损失、纤溶酶原和纤维蛋白溶解功能障碍、阵发性 夜间血红蛋白尿、蛋白C缺乏、蛋白S缺乏和抗凝血酶III缺乏。
15.一种用于治疗由于增加出血风险的病症的存在而采取的凝血控制后的凝血的药物 组合物，包括根据权利要求4或5所述的组合物，所述增加出血风险的病症包括血友病A、血 友病B、血友病C、Von ffillebrand病、大量失血、血小板无力症、巨大血小板综合征、灰色血 小板综合征和S贮藏池缺乏症。
16.一种用于治疗由于产量不足(例如，在骨髓增生异常综合征或其他骨髓功能障碍 中)、免疫系统造成的破坏(免疫性血小板减少性紫癜/ITP)和由于各种原因引起的消耗 (血栓性血小板减少性紫癜/TTP、溶血性尿毒症综合征/HUS、阵发性夜间血红蛋白尿/PNH、 弥散性血管内凝血/DIC、肝素诱导的血小板减少症/HIT)导致的血小板数目减少所引起的 凝血的药物组合物，包括根据权利要求4或5所述的组合物。
17.一种用于治疗不耐受市场上靶向凝血的其他治疗药物的个体中的凝血的药物组合 物，包括根据权利要求4或5所述的组合物。
18.一种用于治疗因任何原因而不活动的个体、患临界性肢体缺血或已经截肢的患者 中的凝血的药物组合物，包括根据权利要求4或5所述的组合物。
19.一种用于治疗接受任何形式的化学治疗的患者中的凝血的药物组合物，包括根据 权利要求4或5所述的组合物。
20.一种用于治疗处于发生血凝块的高危的患者中的凝血的药物组合物，包括根据权 利要求4或5所述的组合物。
21.—种抑制X因子活性的方法，包括向个体施用根据权利要求1-3中任一项所述的多 肽和抑制所述个体中的X因子的步骤。
22.一种逆转X因子的抑制的方法，所述方法通过向其中根据权利要求1-3中任一项所 述的多肽抑制X因子的部位施用一种或多种抗体，所述一种或多种抗体与所述多肽结合， 至少部分地使所述多肽从X因子解离，由此逆转对X因子活性的抑制。
23.一种收集血液样品的方法，包括收集血液样品和将所述血液样品保存在涂敷以根 据权利要求1-3中任一项所述的多肽的容器中的步骤。
24.一种涂层组合物，包含根据权利要求1-3中任一项所述的多肽。
25.一种涂敷以根据权利要求1-3中任一项所述的涂层组合物的医疗技术装置。
全文摘要
本发明涉及一种显示蛋白酶抑制活性的多肽以及所述多肽在直接地或间接地抑制凝血级联的一种或多种蛋白酶的方法中的用途。本发明还涉及所述多肽作为例如用于预防性或改善性治疗血凝块的药物的用途。另外，本发明包括产生所述多肽的方法。
文档编号A61K38/55GK101952309SQ200880127250
公开日2011年1月19日 申请日期2008年12月19日 优先权日2007年12月21日
发明者索恩德鲁普·梅特·安德森, 莱曼·卡尔·尼尔森 申请人:Ifxa有限公司