专利名称：饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺及其合成方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及饱和脂肪链胺三肽酰胺，尤其涉及一系列具有免疫抑制活性的饱和脂 肪链胺GlU-Asp-Gly三肽酰胺，还涉及这些饱和脂肪链胺三肽酰胺的制备方法以及它们作 为免疫抑制剂的应用，属于生物医药领域。
背景技术：
据统计，截至2002年底，全球共进行各种器官移植935792例次，其中肾移植 585877例次、肝脏移植112153例次、心脏移植66559例次。此外，胰、肺、小肠等器官移植 及心_肺、胰-肾、肝-肾、肝-肠等多脏器联合移植也都获得成功并应用于临床。目前，肾 移植1年人/肾存活率达90 % 95 %，5年存活率超过70 %。脏器移植要形成移植耐受， 这就要求患者终身服用免疫抑制剂。器官移植的进展在很大程度上取决于免疫抑制剂的进 展。近几十年，虽然新免疫抑制药物使得器官移植在临床取突飞猛进发展，但它们的毒副作 用，例如肾毒性和骨髓抑制作用仍然是器官移植造必须面对的严重问题。环孢菌素A是目前临床常用的免疫抑制剂。由于环孢菌素A的水溶性极差以及肾 毒性很强，所以无论是剂型还是疗效都不尽人意。提高环孢菌素A制剂的水溶性，降低环孢 菌素A的肾毒性，一直是环孢菌素A研究的热点。尿毒素肽具有免疫抑制活性。发明人认 识到，把尿毒素肽与脂肪链胺缀合生成的酰胺具有自组装性能，因而可以用作具有免疫抑 制活性的载药材料。例如可以用来包裹环孢菌素A，达到提高环孢菌素A的水溶性和降低环 孢菌素A肾毒性的双重目的。
发明内容
本发明的目的之一是，将尿毒素三肽与脂肪链胺缀合，得到具有免疫抑制活性的 饱和脂肪链胺三肽酰胺缀合物。本发明的目的之一是通过以下技术方案实现的通式I的6种具有免疫抑制活性的饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺Glu-Asp-Gly-NH-CH2- (CH2) nCH3 I其中，通式I 中的 η = 6、8、10、12、14 或 16。本发明的目的之二是，提供一种制备上述具有免疫抑制活性的饱和脂肪链胺 Glu-Asp-Gly三肽酰胺的方法。本发明的目的之二是通过以下技术方案来实现的 一种制备通式I的6种具有免疫抑制活性的饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺 的方法，该方法包括(1)将N端保护基保护的甘氨酸与饱和脂肪胺缩合，所述饱和脂肪胺为CH3(CH2) nCH2NH2, η = 6、8、10、12、14 或 16 ；(2)脱去N端保护基得到饱和脂肪胺甘氨酸酰胺；(3)按照现有液相合成技术，将饱和脂肪胺甘氨酸酰胺与天冬氨酸的保护中间体、谷氨酸的保护中间体逐步接肽合成保护基保护的饱和脂肪胺三肽缀合物；(4)依次脱去保护基保护的饱和脂肪胺三肽缀合物的N端保护基和C端保护基得 到目标化合物。其中所述N端保护基是对多肽的N端进行保护时常用的保护基团，例如可以是叔 丁氧羰基(Boc)；所述C端保护基是对多肽的C端进行保护时常用的保护基团，例如可以是 苄氧基(OBzl)；所述液相合成技术及所述保护、缩合、脱保护的过程是本领域的常规并公 知的技术。该制备方法可以用图1的路线概括，具体的，所述方法包括(1)在(Boc)2O和NaOH存在下将甘氨酸转化为N-叔丁氧羰基甘氨酸；(2)在DCC、HOBt、无水THF存在下将N-叔丁氧羰基甘氨酸与饱和脂肪胺缩合，生 成饱和脂肪胺N-叔丁氧羰基甘氨酸酰胺；(3)在氯化氢-乙酸乙酯中将饱和脂肪胺N-叔丁氧羰基甘氨酸酰胺脱除叔丁氧羰 保护基，生成饱和脂肪胺甘氨酸酰胺；(4)在无水THF中，在DCC和HOBt存在下将饱和脂肪胺甘氨酸酰胺与N-叔丁氧 羰基-β -苄酯天冬氨酸缩合，生成饱和脂肪胺N-叔丁氧羰基_ β _苄酯天冬氨酰甘氨酸酰 胺；(5)在氯化氢_乙酸乙酯存在下将饱和脂肪胺N-叔丁氧羰基_ β _苄酯天冬氨酰 甘氨酸酰胺脱除叔丁氧羰基，生成饱和脂肪胺β _苄酯-天冬氨酰甘氨酸酰胺；(6)在无水THF中，在DCC和HOBt存在下将饱和脂肪胺β -苄酯天冬氨酰甘氨酸 酰胺与N-叔丁氧羰基_ Y _苄酯谷氨酸缩合，生成饱和脂肪胺N-叔丁氧羰基_ Y _苄酯谷 氨酰-β -苄酯天冬氨酰甘氨酸酰胺；(7)在氯化氢_乙酸乙酯中将饱和脂肪胺N-叔丁氧羰基_ Y _苄酯谷氨酰β _苄 酯天冬氨酰甘氨酸酰胺脱除叔丁氧羰基，生成饱和脂肪胺Y-苄酯谷氨酰苄酯天冬氨 酰甘氨酸酰胺；(8)在无水乙醇中，在Pd/C存在下将饱和脂肪胺Y-苄酯谷氨酰-β-苄酯天冬氨 酰甘氨酸酰胺氢解，生成饱和脂肪胺谷氨酰天冬氨酰甘氨酸酰胺。实验结果表明本发明的6种具有免疫抑制活性的饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽 酰胺具有优秀的免疫抑制作用，临床上可作为免疫抑制剂应用。并且本发明的饱和脂肪链 胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺水溶液中均能自组装成粒经稳定在38. 9-1030nm的纳米球，可作 为制备微乳或脂质体药物载体的制剂材料，另外可作为制备微乳、脂质体药物载体的靶向 制剂材料。
图1为通式I的6种具有免疫抑制活性的饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺的 合成路线。i)无水THF、DCC、HOBt和NMM ；ii)4N氯化氢-乙酸乙酯溶液；iii)无水乙醇、 Pd/C 和 H2 ；7a η = 6,7b η = 8,7c η = 10，7d η = 12，7e η = 14，7f η = 16。为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它 们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
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具体实施例方式实施例IBoc-Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 的制备将0. 80g (4. 57mmol) Boc-Gly溶于20ml无水THF，冰浴下往得到的溶液中 加入0. 62g(4. 57mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)，并使完全溶解。10分钟后加入 1. 13g(5. 48mmol) 二环己基羰二亚胺(DCC)，得到反应液(I)。冰浴下把0. 72g(4. 57mmol) 脂肪胺CH3(CH2)6CH2NH2悬浮于20ml无水THF中，然后加入Iml N-甲基吗啉(NMM)，调pH 8-9。搅拌35分钟，得到反应液(II)。冰浴下把反应液⑴加入反应液(II)中，先冰浴下搅 拌lh，再室温搅拌12h，TLC (氯仿/甲醇，10 1)显示Boc-Lys (Z)消失。滤除二环己基脲 (D⑶)，减压除去THF。残留物用50ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用饱和NaHCO3水溶 液洗、饱和NaCl水溶液洗、5% KHSO4水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。有机相用无水Na2SO4 干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到1. 24g(95% )标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/ ζ) :287[M+H]+。实施例 2Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 的制备按照实施例1 的方法由 0. 80g (4. 57mmol) Boc-Gly 和 0. 72g(4. 57mmol) CH3(CH2)8CH2NH2 制得 1. 35g(94% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z) :315[M+H] +。实施例3Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 的制备按照实施例1 的方法由 0. 80g (4. 57mmol) Boc-Gly 和 0. 85g(4. 57mmol) CH3(CH2)ltlCH2NH2 制得 1. 47g(94% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z) :343[M+H] +。实施例4Boc-Gly_NHCH2 (CH2) 12CH3 的制备按照实施例1 的方法由 0. 80g (4. 57mmol) Boc-Gly 和 0. 98g(4. 57mmol) CH3(CH2)12CH2NH2 制得 1. 6Ig(95% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS (m/z) :371[M+H] +。实施例5Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 的制备按照实施例1 的方法由 0. 80g (4. 57mmol) Boc-Gly 和 1. IOg (4. 57mmol) CH3(CH2) I4CH2NH2 制得 1. 76g(97% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z) :399[M+H] +。实施例6Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 的制备按照实施例1 的方法由 0. 80g (4. 57mmol) Boc-Gly 和 1. 23g(4. 57mmol) CH3(CH2)16CH2NH2 制得 1. 75g(90% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z) :427[M+H] +。
实施例 7HC1 · Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 的制备将1. 24g (4. 33mmol) Boc-Gly-OCH2 (CH2) 6CH3 溶解在 80ml 4N 氯化氢-乙酸乙酯溶 液中，室温搅拌2小时，TLC (氯仿甲醇，5 1)显示Boc-Gly-OCH2 (CH2) 6CH3消失，减压浓 缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢。最后加少量乙醚将 残留物研磨成0.92g(95% )标题化合物，为米黄色油状物。ESI-MS(m/z) :187[M+H] +。实施例8HC1 · Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 的制备按照实施例7 的方法，从 1. 35g(4. 29mmol) Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 制得 1.03g(96% )标题化合物，为米黄色油状物。ESI-MS(m/z) :215[M+H] +。实施例9HC1 · Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 的制备按照实施例7 的方法，从 1. 47g(4. 29mmol) Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 制得 1. 15g(96% )标题化合物，为米黄色油状物。ESI-MS(m/z) :243[M+H] +。实施例IOHCl · Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 的制备
按照实施例7 的方法，从 1. 61g(4. 35mmol)Boc-Gly-NHCH2(CH2) 12CH3 制得 1. 31g(98% )标题化合物，为米黄色固体。ESI-MS(m/z) :271[M+H] +。实施例1 IHCl · Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 的制备按照实施例7 的方法，从 1. 76g(4. 42mmol) Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 制得 1. 35g(91% )标题化合物，为米黄色固体。ESI-MS(m/z) :299[M+H] +。实施例 12HC1 · Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 的制备按照实施例7 的方法，从 1. 75g(4. 11 匪ol) Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 制得 1.40g(94% )标题化合物，为米黄色固体。ESI-MS(m/z) :327[M+H] +。实施例I3Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 的制备按照实施例1 的方法由 1.33g(4. 13mmol) Boc-Asp (OBzl)和 0.92g(4. 13mmol) HCl · Gly-NHCH2(CH2)6CH3 制得 1.93g(95% )标题化合物，为淡黄色油状物。ESI-MS(m/z) 492 [M+H]+，[a J20d = -15. 2 (c = 1. 0，CH3OH)。实施例14Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 的制备按照实施例1 的方法由 1. 33g(4. llmmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 03g(4. llmmol) HCl · Gly-NHCH2(CH2)8CH3 制得 1.94g(91% )标题化合物，为淡黄色油状物。ESI-MS(m/z) 520 [M+H]+，[a J20d = -16. 2 (c = 1. 0，CH3OH)。实施例I5Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 的制备按照实施例1 的方法由 1. 33g(4. 13mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 15g(4. 13mmol) HCl · Gly-NHCH2(CH2)ltlCH3 制得 2. 17g(96% )标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/z) 548 [Μ+Η]+, [α ]20d = -15. 8 (c = 1. O, CH3OH)。实施例I6Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 的制备按照实施例1 的方法由 1. 38g(4. 27mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 31g(4. 27mmol) HCl .Gly-NHCH2 (CH2)12CH3 制得 2.09g (85% )标题化合物，为淡黄色油状物。ESI-MS (m/z) 576[M+H]+，[a J20d = -14. 1 (c = 1. 0，CH3OH)。实施例I7Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 的制备按照实施例1 的方法由 1. 31g (4. 04mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 35g(4. 04mmol) HCl · Gly-HNCH2(CH2)14CH3 制得 2. 17g(89% )标题化合物，为淡黄色固体。ESI-MS (m/z) 604[Μ+Η]+, [α ]20d = -5. 4(c = 1. O, CH3OH)。实施例I8Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 的制备按照实施例1 的方法由 1. 25g (3. 86mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 40g(3. 86mmol) HCl · Gly-NHCH2(CH2)16CH3 制得 2. 09g(86% )标题化合物，为淡黄色固体。ESI-MS (m/z) 632[M+H]+，[a ]20d = -1. 3(c = 1. 0，CH3OH)。实施例I9HCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 的制备按照实施例7 的方法，从 1. 93g (3. 93mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 制 得 1.68g(91% )标题化合物，为米黄色固体。ESI-MS (m/z) 392 [Μ+Η]+, [ α J20d = 4. O (c = 1. O, CH3OH)。实施例2OHCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 的制备按照实施例7 的方法，从 1. 94g (3. 74mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 制 得 1. 64g(96% )标题化合物，为米黄色固体。ESI-MS (m/z) 420 [Μ+Η]+, [ α J20d = 2. 8 (c =
61. 0，CH3OH)。实施例2IHCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 的制备按照实施例7 的方法，从 2. 17g (3. 97mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 制 得 1. 77g(92% )标题化合物，为米黄色固体。ESI-MS (m/z) 448 [Μ+Η]+, [ α J20d = 15. 8 (c = 1· 0，CH3OH)。实施例22HCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 的制备按照实施例7 的方法，从 2. 09g (3. 63mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 制 得 1. 76g(94% )标题化合物，为米黄色固体。ESI-MS(m/z) 476 [Μ+Η]+, [ α J20d = 2. 8 (c = 1. O, CH3OH)。实施例23HCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 的制备按照实施例7 的方法，从 2. 17g (3. 60mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 制 得 185g(95% )标题化合物，为米黄色固体。ESI-MS(m/z) :504[Μ+Η]+，[α ]20D = 3. O (c = 1. O, CH3OH)。实施例24HC1 · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 的制备按照实施例7 的方法，从 2. 09g (3. 31mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 制 得 1. 82g(97% )标题化合物，为米黄色固体。ESI-MS(m/z) 532[Μ+Η]+, [ α J20d = 2. 4(c = 1. O, CH3OH)。实施例25Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 的制备按照实施例1 的方法由 1. 32g(3. 93mmol)Boc-Glu(OBzl)和 1. 68g(3. 93mmol) HCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3制得，所得化合物经硅胶柱层析纯化得无色透明油状 物 1.90g，纯化条件氯仿甲醇=100 1，收率为 68%。ESI-MS (m/z) 711 [Μ+Η]+, [ α J20d =-19. l(c = 1. 0，CH3OH)。实施例26Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 的制备按照实施例1 的方法由 1. 21g(3. 60mmol)Boc-Glu(OBzl)禾Π 1. 64g(3. 60mmol) HCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3制得，所得化合物经硅胶柱层析纯化得无色透明油状 物 1.81g，纯化条件氯仿甲醇=100 1，收率为 68%。ESI-MS (m/z) 739 [Μ+Η]+, [ α J20d =-36. 4 (c = 1. 0，CH3OH)。实施例27Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 的制备按照实施例1 的方法由 1. 23g(3. 66mmol)Boc-Glu(OBzl)和 1. 77g(3. 66mmol)HC 1 · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3制得，所得化合物经硅胶柱层析纯化得无色透明油状物 1. 71g，纯化条件氯仿甲醇=100 1，收率为 61%。ESI-MS(m/z) :767[Μ+Η]+，[α ]20D =-24. 6 (c = 1. 0，CH3OH)。实施例28Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 的制备按照实施例1 的方法由 1. 16g(3. 44mmol)Boc-Glu(OBzl)禾Π 1. 76g(3. 44mmol)HC 1 · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3制得，所得化合物经硅胶柱层析纯化得无色透明油状物 1. 78g，纯化条件氯仿甲醇=100 1，收率为 65%。ESI-MS(m/z) :795[Μ+Η]+，[α ]20D =-31. 8 (c = 1. 0，CH3OH)。实施例29Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 的制备按照实施例1 的方法由 1. 16g(3. 43mmol)Boc-Glu(OBzl)和 1. 85g(3. 43mmol)HC
71 · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3制得，所得化合物经硅胶柱层析纯化得无色透明油状物 2. 00g，纯化条件氯仿甲醇=100 1，收率为 71%。ESI-MS(m/z) :823[Μ+Η]+，[α ]20D =-13. 4 (c = 1. 0，CH3OH)。实施例3OBoc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 的制备按照实施例1 的方法由 1. 08g(3. 21mmol)Boc-Glu(OBzl)和 1. 82g(3. 21mmol)HC 1 · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3制得，所得化合物经硅胶柱层析纯化得无色透明油状物 1.88g，纯化条件氯仿甲醇=100 1，收率为 69%。ESI-MS(m/z) :851[Μ+Η]+，[α ]20D =-3. 0(c = 1. 0，CH3OH)。实施例31HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 的制备按照实施例7 的方法，从 1. 51g(2. 13mmol)Boc-Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-NHCH2 (CH2)6CH3 制得 1. 28g(93% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS (m/z) :611[M+H] +。实施例32HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 的制备按照实施例7 的方法，从 1. 41mg(l. 91mmol)Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH 2(CH2)8CH3 1. 16g(90% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z) :641[M+H]+。实施例33HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 的制备按照实施例7 的方法，从 1. 60mg(2. 09mmol) Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH 2(CH2)ltlCH3 制得 1. 36g(93% )标题化合物，为无色固体。ESI_MS(m/z) :669[M+H] +。实施例34HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 的制备按照实施例7 的方法，从 1. 52mg(l. 91mmol) Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH 2(CH2)12CH3 制得 1. 20g(86% )标题化合物，为无色固体。ESI_MS(m/z) :697[M+H] +。实施例35HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 的制备按照实施例7 的方法，从 1. 65g(2. Olmmol) Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2)14CH3 制得 1. 37g(90% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z) :725[M+H]+。实施例36HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 的制备按照实施例7 的方法，从 1. 56g(l. 84mmol)Boc-Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-NHCH2 (CH2)16CH3 制得 1. 27g(88% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z) :751[M+H]+。实施例 37Glu-Asp-Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 (7a)的制备将1. 28g(l. 98mmol)HCl .Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-NHCH2 (CH2)6CH3 用乙醇溶解、 加入适量Pd/C(约5% )、通H2(0. 02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压 浓缩至干。制得751mg(82% )标题化合物，为无色固体。ESI_MS(m/Z) :429[Μ_ΗΓ，[a]20D =-9. 6 (c = 1. 0，CH3OH)，Μ. p. 104. 7—106. 4°C。实施例38Glu-Asp-Gly_NHCH2 (CH2) 8CH3 (7b)的制备将1. 08g(l. 60mmol)HCl .Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-NHCH2 (CH2)8CH3 用乙醇溶解、 加入适量Pd/C(约5% )、通H2(0. 02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压 浓缩至干。制得699mg(80% )标题化合物，为无色固体。ESI_MS(m/Z) :457[Μ_ΗΓ，[a]20D =-6. l(c = 1. 0，CH3OH)，Μ. ρ. :89· 7-90. 1°C。实施例39Glu-Asp-Gly_NHCH2 (CH2) 10CH3 (7c)的制备将1. OOmg(1. 44mmol)HCl · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 用乙醇溶 解、加入适量Pd/C(约5% )、通H2(0. 02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压
8浓缩至干。制得853mg(84% )标题化合物，为无色固体。ESI_MS(m/Z) :485[Μ_ΗΓ，[a]20D =-5. 5(c = 1. 0，CH3OH)，Μ. ρ. :87· 4-89. 1°C。实施例40Glu-Asp-Gly_NHCH2 (CH2) 12CH3 (7d)的制备将1. 30g(l. 78mmol)HCl · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 用乙醇溶 解、加入适量Pd/C(约5% )、通H2(0. 02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压 浓缩至干。制得844mg(86% )标题化合物，为无色固体。ESI_MS(m/Z) :513[Μ_ΗΓ，[a]20D =-2· 8 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ. ρ. :84· 7-85. 7°C。实施例41Glu-Asp-Gly_NHCH2 (CH2) 14CH3 (7e)的制备将1. 26g(l. 66mmol)HCl · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 用乙醇溶 解、加入适量Pd/C(约5% )、通H2(0. 02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压 浓缩至干。制得882mg(81% )标题化合物，为无色固体。ESI_MS(m/Z) :541[Μ_ΗΓ，[a]20D =-2· 2 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ. ρ. :78· 3-79. 5°C。实施例42Glu-Asp-Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 (7f)的制备将1. 17g(l. 48mmol)HCl · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 用乙醇溶 解、加入适量Pd/C(约5% )、通H2(0. 02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压 浓缩至干。制得828mg(79% )标题化合物，为无色固体。ESI_MS(m/Z) :569[Μ_ΗΓ，[a]20D =-2· 9 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ. ρ. :79· 4-80. 8°C。试验例1饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺对小鼠脾淋巴细胞丝裂原增殖的抑 制作用脱颈处死小鼠，无菌取脾，用200目钢网和注射器芯研磨，用HANK’ S液洗两次， 1500转/分条件下离心10分钟，计数后用完全RPMI-1640培养液配成5X106/ml个脾淋 巴细胞，加100 μ 1细胞悬液于96孔培养板中(每孔含5Χ106个细胞)。每孔加20 μ 1 ConA (ConA终浓度为5 μ g/ml)，该96孔培养板置于体积分数为0. 05的CO2饱和湿度的培养 箱内37°C培养4h。4h后分别加入不同浓度饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺(1X10_4M、 8X 1(Γ5Μ、5Χ 1(Γ5Μ、3Χ 1(Γ5Μ、1Χ 1(Γ5Μ、8Χ 1(Γ6Μ、5Χ ICT6M 和 IX I(T6M)，每个浓度 3 个复孔。 同时设不含化合物对照孔和只含同量培养液无ConA的细胞空白孔。各个孔均重复3次(η =3)。培养48h后用MTT法检测化合物对脾淋巴细胞的抑制作用。按照公式“抑制率=(D对照-D含药)/D对照X 100%”计算不同浓度饱和脂肪链 胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺对脾淋巴细胞增殖的抑制作用，根据细胞相对生存率和化合物的 浓度绘制细胞生长曲线，利用该生长曲线求得半数抑制率(dxIC5ci)。结果列入表1。结果表明 本发明的饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺对小鼠脾淋巴细胞增殖有明确的抑制作用。表1饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺对小鼠脾淋巴细胞丝裂原增殖的抑制作 用 9 试验例2饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺对巨噬细胞吞噬的抑制作用将生长状态良好、处于对数生长期的Ana-I小鼠巨噬细胞以1 X IO5个/mL的密度 接种于96孔板，每孔100 μ 1，37°C、5% CO2培养箱中培养4小时，按预设的浓度梯度加入经 灭菌处理的饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺(1 X 10_4M、8X 10_5M、5X 10_5M、3X 10_5M、 1 X 10_5M、8X 10_6M、5X ΙΟ—Μ和1 X I(T6M)，每个浓度3个复孔，对照组加入等体积的溶解样 品的溶媒。继续培养24小时后，吸弃上清液，每孔加入100 μ 10. 的中性红溶液，置于 37°C孵育30分钟。吸弃中性红溶液，并用PBS缓冲溶液洗涤2-3次(除去未被巨噬细胞吞 噬的中性红)，加入细胞溶解液(乙醇乙酸=1 1)100 μ 1，4°C过夜，酶标仪检测吸光度 值，波长540nm。各个孔均重复3次(η = 3)。按照公式“抑制率=(D对照-D含药)/D对照Χ100%”计算不同浓度的化合物 对巨噬细胞的吞噬能力的抑制作用，根据细胞相对生存率和化合物的浓度绘制细胞生长曲 线，利用该生长曲线求得半数抑制率(dxIC5ci)。结果列入表2。结果表明本发明的饱和脂肪 链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺对Ana-I小鼠巨噬细胞吞噬有明确的抑制作用。表2饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺对Ana-I小鼠巨噬细胞吞噬的抑制作用 试验例3饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺在纳米水平的自组装将饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺配置成1 μ mol/ml的水溶液，在激光纳米 粒度仪上25°C测定粒径。连续测定8天，记录其粒径。结果列入表3。数据表明，本发明的 饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺水溶液中均能自组装成粒经稳定在38. 9-1030nm的纳 米球。表3饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺在水中自组装的纳米球粒径
权利要求
通式I的6种具有免疫抑制活性的饱和脂肪链胺Glu Asp Gly三肽酰胺Glu Asp Gly NH CH2 (CH2)nCH3 I通式I中的n＝6、8、10、12、14或16。
2.一种制备权利要求1的脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺的方法，包括(1)将N端保护基保护的甘氨酸与饱和脂肪胺缩合，所述饱和脂肪胺为CH3(CH2) nCH2NH2, η = 6、8、10、12、14 或 16 ；(2)脱去N端保护基得到饱和脂肪胺甘氨酸酰胺；(3)按照现有液相合成技术，将饱和脂肪胺甘氨酸酰胺与天冬氨酸的保护中间体、谷氨 酸的保护中间体逐步接肽合成保护基保护的饱和脂肪胺三肽缀合物；(4)依次脱去保护基保护的饱和脂肪胺三肽缀合物的N端保护基和C端保护基得到目 标化合物。
3.权利要求1的6种饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺在制备免疫抑制剂类药物中 的应用。
4.权利要求1的6种饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺作为制备微乳或脂质体药物 载体的制剂材料的用途。
5.权利要求1的6种饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺作为制备微乳、脂质体药物 载体的靶向制剂材料中的用途。全文摘要
本发明涉及通式I的6种具有免疫抑制活性的饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺缀合物，在饱和脂肪链胺中n＝6、8、10、12、14或16，涉及它们的制备方法以及作为免疫抑制剂的应用。这些饱和脂肪链胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺对脾淋巴细胞丝裂原增殖反应的抑制作用，以及对巨噬细胞吞噬活性的抑制作用的实验结果表明，本发明的化合物具有优秀的免疫抑制作用，临床上可作为免疫抑制剂应用。Glu-Asp-Gly-NH-CH2-(CH2)nCH3 I
文档编号A61K47/42GK101899087SQ20091008532
公开日2010年12月1日 申请日期2009年5月26日 优先权日2009年5月26日
发明者彭师奇, 赵明, 赵淑锐 申请人:首都医科大学