专利名称：纯化花红片粗提物中黄酮类化合物的方法
技术领域：
本发明属于一种纯化花红片粗提物中黄酮类化合物的方法。
背景技术：
花红片组成成份为一点红、白花蛇舌草、地桃花、白背叶根、桃金娘根、菥蓂、鸡血藤。 功能主治清热解毒、燥湿止带，祛瘀止痛。用于湿热下注，带下黄稠，月经不调，痛经等 症；附件炎、子宫内膜炎、盆腔炎等妇科炎症。由广西花红药业有限责任公司独家生产。经 过临床验证本品对因湿热瘀滞所致妇科炎症有很好的疗效，无明显毒副作用。
关于花红片药材水提醇沉浸膏的黄酮类化合物的进一步提取分离技术没有报道。由于粗 提物中总黄酮含量不高，制约了其药效更好的发挥。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用膜分离和大孔吸附树脂技术，纯化花红片粗提 物浸膏中黄酮类化合物的方法，以保证花红片能发挥更好药效。
本发明以如下技术方案解决上述技术问题 纯化方法为
(1) 将花红片药材的水提醇沉浸膏按1 : 20 1 : 200 (g/ml)溶于去离子水中，待充分
溶解后减压抽滤，除去水不溶成分；
(2) 进行膜过滤，合并滤液并浓縮至干；膜材料为聚丙烯中空纤维、陶瓷复合膜或聚四
氟乙烯膜，膜孔径为0. 05um 0.5um;
(3) 用醋酸水溶液和氢氧化钠或氢氧化钾水溶液调节pH值至1.0 10.0;
(4) 在瓶中静态吸附、解吸或上大孔吸附树脂柱动态吸附，用乙醇-水组合洗脱，控制吸 附速度和洗脱速度；大孔吸附树脂是DM130、 AB-8、 DlOl、 DM301或X-5;大孔吸附树 脂与吸附液用量之比为1 : 2~1 : 200g/ml;
(5) 收集各段洗脱液，减压浓縮，得高含量黄酮的花红片浸膏。
洗脱液pH值为1.0 10.0，洗脱液乙醇浓度为10 95%,洗脱液用量为吸附液体积的 Q.l 3倍，洗脱速度1 20ml/min，洗脱时间0.1 24h。用本发明方法生产的花红片浸膏，为黑色黏稠膏状固体，总黄酮含量大于60%，高于只
采用膜分离或只采用大孔吸附树脂单一技术得到的总黄酮含量。且生产成本低，安全无毒副 作用，为工业化生产提供了必要的条件，将使医药企业获得显著的经济效益和社会效益。
具体实施例方式
花红片是有明显清热解毒、燥湿止带、祛瘀止痛功能的一种中成药，得到众多患者的信 赖。但由于黄酮类化合物分离技术未能很好过关，导致花红片药材的水提醇沉浸膏中的黄酮
类化合物的含量一般只能在15%左右，直接影响到花红片药效的进一步提高。
本发明将技术效果明确、己经公知的膜分离技术和大孔吸附树脂技术结合起来，对花红 片药材的水提醇沉浸膏中的黄酮类化合物进一步纯化，结果可使水提醇沉浸膏中的黄酮含量. 提高到60%以上。
膜分离技术是采用陶瓷复合膜和聚四氟乙烯膜等对不同分子量大小的物质进行分离。原 料液从循环罐中由泵输送到膜组件后，由于膜的内外存在压差，溶解性的物质或粒径小于膜 孔径的物质透过膜进入到渗透侧，大分子物质被膜截留并被带出膜组件回流到循环罐。这样 循环工作，最终达到分离的目的。膜分离方法简单，易于工业化生产。
大孔吸附树脂法明显的好处是不需要复杂的设备，处理方法简单，树脂可再生，树脂再 生所用的酸和碱可互相中和，对环境造成的危害小，制备的成本较低，制备方法容易得到推 广。
本发明的方法先采用膜分离技术对花红片药材水提醇沉浸膏中水溶解完全的部分进行 初步纯化，去除一些大分子物质包括鞣质和多糖等，得到小分子的水溶液，再用处理好的树 脂柱(或瓶中树脂)对其中的总黄酮进行吸附，待吸附充分后，用乙醇-水洗脱，分别收集 过柱后的吸附液和解吸液，减压浓縮，溶剂可以回收再利用。
本发明采用的原料是花红片药材水提醇沉浸膏，这种浸膏是采用现有技术由花红片的七 种药材经水提取乙醇沉淀工艺得到的产品。
本发明的具体工艺是
(1) 称取定量的花红片药材水提醇沉浸膏，加入去离子水溶解。浸膏与去离子水的比
例为1 : 20 1 : 200 (g/ml);室温静置3h 6h分层后减压抽滤，加水静置分层1~5次，合 并滤液，即得水溶液。
(2) 进行膜过滤，合并并浓缩过滤液至干；膜孔径为0. 05um 0.5um。
(3) 加入醋酸水溶液和氢氧化钠或氢氧化钾水溶液调节经(2)所得的浓縮液pH值。 醋酸水溶液浓度可为10% 95%,氢氧化钠或氢氧化钾水溶液的重量百分比浓度为4% 20%;吸附液pH为1.0 10.0。(4) 采用大孔吸附树脂静态吸附、解吸时，大孔吸附树脂用量与吸附液用量之比为i :
2~1: 200 (g/ml)，放置恒温摇床震荡，温度0'C 80。C，震荡速度40 200(rad/min)，吸 附、解吸时间0. lh 24h。
(5) 若采用大孔吸附树脂柱进行动态吸附，大孔吸附树脂型号包括DM130， AB-8， DlOl， DM301， X-5;大孔吸附树脂柱径高比为1 : 1 1 :30，树脂用量与吸附液用量比为 1 : 2~1 : 200 (g/ml)，吸附次数1 5次，控制吸附速度1 20 (ml/min)，吸附时间0.1h 7h。
(6) 用乙醇水溶液洗脱。加入醋酸水溶液和氢氧化钠或氢氧化钾水溶液调节洗脱液 pH值为1.0 10.0，洗脱液乙醇浓度为10%~95%，洗脱液用量为吸附液用量的0.1 3倍， 洗脱速度1 20(ml/min)，洗脱时间0.1h 3.5h。
(7) 利用紫外分光光度法，在500nm处，以芦丁标准液为对照，测定各样品原液、 吸附液、洗脱液的黄酮浓度。分别精确移取各样品原液、洗脱液lml 50ml浓縮至干，计算 黄酮含量和提取率。
(8) 分别收集各段洗脱液(解吸液)，减压浓缩，得高黄酮含量的花红片浸膏。 实施例1:
称取花红片药材水提醇沉浸膏0.5kg，加入10L去离子水溶解，静置6h后过滤，滤渣干 燥称重，滤液经过0.5um陶瓷复合膜分离，浓縮至干，得到干浸膏。称取上述浸膏2.5g， 加水定容至50ml，得到质量浓度为50mg/ml的样品液。精确称取4.28g (滤纸吸干)已预处 理AB-8大孔吸附树脂于250ml锥形瓶中；样品液中加几滴10%醋酸水溶液，调节样品液pH 至5.0，移取40ml样品液于锥形瓶中(大孔吸附树脂用量与吸附液用量之比为1 : 10(g/ml))， 密封瓶口，放入恒温摇床震荡，温度为0'C，转速为40rad/min, 24h后取出吸附液；加入 10ml去离子水，室温下充分振摇6min，取出水洗液；加入40ml 10%乙醇水溶液(洗脱液用 量与吸附液用量相等)，放入恒温摇床同上述条件下震荡12h，取出醇洗液。分别测定原液、 水洗液、醇洗液的黄酮浓度。精确移取10ml原液、水洗液、醇洗液浓縮得到干浸膏，通过 计算，原液浸膏黄酮含量为15.47%，水洗液浸膏含量为4.83%，醇洗液浸膏含量为49.35%， 提取率为30.76%。
实施例2:
称取花红片药材水提醇沉浸膏lkg，加入30L去离子水溶解，静置5h后过滤，滤渣干 燥称重，滤液经过0.2um聚四氟乙烯膜分离，浓縮至干，得到干浸膏。称取上述浸膏0.5g， 加水定容至100ml，得到质量浓度为5mg/ml的样品液。精确称取4.11g (滤纸吸干)已预处理D101大孔吸附树脂于250ml锥形瓶中；样品液中加几滴95%醋酸水溶液，调节pH至1.0, 移取80ml样品液于锥形瓶中(大孔吸附树脂用量与吸附液用量之比为1 : 20 (g/ml))，密封 瓶口，放入恒温摇床震荡，温度为80'C，转速为200rad/min, 12h后取出吸附液；加入8ml 去离子水，室温下充分振摇6min，取出水洗液；加入8ml 50%乙醇水溶液(洗脱液用量为吸 附液用量的0.1倍)，放入恒温摇床同上述条件下震荡24h,取出醇洗液。分别测定原液、水 洗液、醇洗液的黄酮浓度。精确移取lml原液、水洗液、醇洗液浓縮得到干浸膏，通过计算， 原液浸膏黄酮含量为17.45%，水洗液浸膏含量为4.12%，醇洗液浸膏含量为45.55%，提取 率为34.26%。
实施例3:
称取花红片药材水提醇沉浸膏0.5kg，加入40L去离子水溶解，静置4h后过滤，滤渣干 燥称重，滤液经过O.l陶瓷复合um膜分离，浓縮至干，得到干浸膏。称取上述浸膏0.5g， 加水定容至100ml，得到质量浓度为5mg/ml的样品液。精确称取4.52g (滤纸吸干)已预处 理DM301大孔吸附树脂于250ml锥形瓶中；样品液中加几滴95%醋酸水溶液，调节pH至 1.0，移取80ml样品液于锥形瓶中(大孔吸附树脂用量与吸附液用量之比为1 : 20 (g/ml))， 密封瓶口，放入恒温摇床震荡，温度为80'C，转速为200rad/min， 0. lh后取出吸附液；加 入8ral去离子水，室温下充分振摇6min,取出水洗液；加入8ml 50%乙醇水溶液(洗脱液用 量为吸附液用量的O.l倍)，放入恒温摇床同上述条件下震荡0. lh,取出醇洗液。分别测定 原液、水洗液、醇洗液的黄酮浓度。精确移取lml原液、水洗液、醇洗液浓缩得到干浸膏， 通过计算，原液浸膏黄酮含量为18.18%,水洗液浸膏含量为3.23%,醇洗液浸膏含量为 38.78%，提取率为29.39%。
实施例4:
称取花红片药材水提醇沉浸膏0.2kg，加入20L去离子水溶解，静置3h后过滤，滤渣干
燥称重，滤液经过0.05pm陶瓷复合膜分离，浓縮至干，得到干浸膏。称取上述浸膏30.0g，
加水定容至2000ml，得到质量浓度为15mg/ml的样品液。称取10gDM-301湿树脂装柱，径
高比为1 : 8。调节吸附速度为20ml/min,对2000ml样品液进行动态吸附(大孔吸附树脂用
量与吸附液用量之比为1 :200 (g/ml))，吸附次数1次，吸附时间1.7h。控制洗脱速度为
lml/min，用200ml95。/。乙醇洗脱(洗脱液用量为吸附液用量的0.1倍)，洗脱时间3.5h，收
集洗脱液200ml。分别测定原液、洗脱液的黄酮浓度，移取50ml洗脱液浓縮得到干浸膏，
通过计算，原液浸膏黄酮含量为17.81%，浓组分洗脱液浸膏黄酮含量为64.53%，提取率为27.38%。
实施例5:
称取花红片药材水提醇沉浸膏0.6kg，加入12L去离子水溶解，静置4h后过滤，滤渣干 燥称重，滤液经过0.1wm聚四氟乙烯膜分离，浓縮至干，得到干浸膏。称取上述浸膏5.0g， 加水定容至200ml，得到质量浓度为25mg/ml的样品液。称取50gD-101湿树脂装柱，径高 比为1 : 30。样品液中几滴加入20%氢氧化钾水溶液，调节pH至10.0，控制吸附速度为 lml/min，对200ml样品液进行动态吸附(大孔吸附树脂用量与吸附液用量之比为1 :4 (g/ml))，吸附次数2次，吸附时间7.0h。控制洗脱速度为20ml/min，用600ml 30%乙醇洗 脱(洗脱液用量为吸附液用量的3倍)，洗脱时间0.5h，收集洗脱液596ml。分别测定原液、 洗脱液的黄酮浓度，移取50ml洗脱液浓縮得到干浸膏，通过计算，原液浸膏黄酮含量为 16.43%，浓组分洗脱液浸膏黄酮含量为61.59%，提取率为45.32%。
实施例6:
称取花红片药材水提醇沉浸膏0.3kg，加入12L去离子水溶解，静置4h后过滤，滤渣干 燥称重，滤液经过O.lum陶瓷复合膜分离，浓缩至干，得到干浸膏。称取上述浸膏2.0g, 加水定容至200ml，得到质量浓度为10mg/ml的样品液。称取10gAB-8湿树脂装柱，径高比 为1 : 1。样品液中加入几滴4%氢氧化钠水溶液，调节pH至8.0,控制吸附速度为5.0ml/min， 对20ml样品液进行动态吸附(大孔吸附树脂用量与吸附液用量之比为1 : 2),吸附次数5 次，吸附时间0.4h。控制洗脱速度为5.0ml/min，用60ml7()Q/。乙醇洗脱(洗脱液用量为吸附 液用量的3倍)，洗脱时间0.2h，收集洗脱液58ml。分别测定原液、洗脱液的黄酮浓度，移 取lml洗脱液浓縮得到干浸膏，通过计算，原液浸膏黄酮含量为16.27%，浓组分洗脱液浸 膏黄酮含量为62.52%,提取率为57.86%。
实施例7:
称取花红片药材水提醇沉浸膏0.4kg，加入12L去离子水溶解，静置4h后过滤，滤渣干 燥称重，滤液经过0.2um聚四氟乙烯膜分离，浓縮至干，得到干浸膏。称取上述浸膏2.0g， 加水定容至200ml，得到质量浓度为10mg/ml的样品液。称取10g D101湿树脂装柱，径髙 比为1:1。样品液中加入几滴4%氢氧化钠水溶液，调节pH至8.0，控制吸附速度为 3.34ml/min,对20ml样品液进行动态吸附(大孔吸附树脂用量与吸附液用量之比为1 :2 (g/ml))，吸附次数1次，吸附时间O.lh。控制洗脱速度为10.0ml/min,用60ml 70%乙醇洗脱(洗脱液用量为吸附液用量的3倍)，洗脱时间0.1h，收集洗脱液60ml。分别测定原液、 洗脱液的黄酮浓度，移取lml洗脱液浓縮得到干浸膏，通过计算，原液浸膏黄酮含量为 16.34%，浓组分洗脱液浸膏黄酮含量为60.26 %，提取率为41.62%。 实施例8:
称取花红片药材水提醇沉浸膏0.8kg,加入40L去离子水溶解，静置3h后过滤，滤渣干 燥称重，滤液经过0.1um陶瓷复合膜分离，浓縮至干，得到干浸膏。称取上述浸膏2.0g， 加水定容至200ml,得到质量浓度为10mg/ml的样品液。称取10gAB-8湿树脂装柱，径高比 为1 : 1。样品液中几滴加入20%氢氧化钠水溶液，调节pH至10.0，控制吸附速度为 1.0ml/min，对20ml样品液进行动态吸附(大孔吸附树脂用量与吸附液用量之比为1 :2 (g/mU)，吸附次数3次，吸附时间lh。控制洗脱速度为1.0ml/min，用60ml70。/。乙醇洗脱 (洗脱液用量为吸附液用量的3倍)，洗脱时间lh,收集洗脱液60ml。分别测定原液、洗脱 液的黄酮浓度，移取lml洗脱液浓縮得到干浸膏，通过计算，原液浸膏黄酮含量为15.96%， 浓组分洗脱液浸膏黄酮含量为62.61%，提取率为43.48%。
权利要求
1.一种纯化花红片粗提物浸膏中黄酮类化合物的方法，其特征是纯化方法为(1)将花红片药材水提醇沉浸膏按1∶20～1∶200g/ml溶于去离子水中，待充分溶解后减压抽滤，除去水不溶成分；(2)进行膜过滤，合并滤液并浓缩至干；膜材料为聚丙烯中空纤维、陶瓷复合膜或聚四氟乙烯膜，膜孔径为0.05μm～0.5μm；(3)用醋酸水溶液和氢氧化钠或氢氧化钾水溶液调节pH值至1.0～10.0；(4)在瓶中静态吸附、解吸或上大孔吸附树脂柱动态吸附，用乙醇-水组合洗脱，控制吸附速度和洗脱速度；大孔吸附树脂是DM130、AB-8、D101、DM301或X-5；大孔吸附树脂与吸附液用量之比为1∶2～1∶200g/ml；(5)收集各段洗脱液，减压浓缩，得高含量黄酮的花红片浸膏。
2.如权利要求1所述的纯化花红片粗提物浸膏中黄酮类化合物的方法，其特征是洗脱液 pH值为1.0 10.0，洗脱液乙醇浓度为10 95%,洗脱液用量为吸附液体积的0.1 3倍，洗 脱速度1 20ml/min，洗脱时间0.1 24h。
全文摘要
一种纯化花红片浸膏中黄酮类化合物的方法，其纯化方法为将花红片药材水提醇沉浸膏溶于去离子水中，充分溶解后减压抽滤，除去水不溶成分，进行膜过滤，去除大分子物质。在瓶中静态吸附、解吸或上大孔吸附树脂柱动态吸附，用乙醇-水组合洗脱，收集各段洗脱液，减压浓缩，得高黄酮含量的花红片浸膏。用本发明的方法生产的花红片浸膏，总黄酮含量大于60％，较现有花红片水提醇沉浸膏中黄酮含量提高四倍以上，可直接入药。且生产成本低，安全无毒副作用，经济效益显著。
文档编号A61K36/185GK101618097SQ20091011429
公开日2010年1月6日 申请日期2009年8月10日 优先权日2009年8月10日
发明者周永红, 华 杨, 王立升 申请人:广西大学