专利名称：抗癌药番酯素及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及番酯素技术领域，尤其涉及一种抗癌物质番酯素及其制备方法和应用。
背景技术：
癌症是危害人类健康的大敌。我国每年新发癌症病例约有160万人，每年死于癌症的约有130万人，全国因癌症而死亡的人数逐年上升，我国为肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等癌症的高发区域，癌症死亡率居高不下。
目前尚无有效的药物治愈大多数癌症患者。化疗药物对癌症虽有一定疗效，但毒副作用大，中成药对癌症的疗效普遍较低，如参莲胶曩对肺、胃癌的癌灶缓解率仅为3.5％，疗效均不理想。
番荔枝科番荔枝属植物番荔枝(Annona squamosa Linn.)的干燥种子，据文献记载，其中主要的化学成分有番荔枝内酯类、环肽类、酰胺类及甾醇类等，其中番荔枝内酯类是主要活性成分。番荔枝种子中含有近100种番荔枝内酯类化合物，其中番荔枝内脂化合物(bullatacin)对人肝癌和肺癌的抑制活性显著高于化疗药5-氟脲嘧啶(5-Fu)，其体内抗肝癌活性和抗肺癌活性分别是化疗药5-FU的540倍和430倍。
本申请发明人研究了番荔枝(Annona squamosa Linn)的树皮、枝叶、种子的抗癌有效物质和化学成分，从中提取出多种抗癌单体化合物(活性成分)，经抗癌实验研究表明，对人肝癌细胞、人胃癌细胞、人食管癌细胞和动物移植性肿瘤(如S180、H22和Heps)均有显著的体外和体内抗癌治疗效果，并已申请获得数项抗癌物质发明专利证书(专利号分别为ZL02148474.0，ZL02148475.9，ZL03112707.X，ZL 20060085781.4)。在上述研究的基础上，本发明人继续提取分离、筛选番荔枝(Annona squamosa Linn)种子的抗癌有效化学成分，从中又发明了一种抗癌有效物质番酯素(bullatacin含量超过50％wt)的提取制备方法。
发明内容
发明目的提供一种抗癌物质番酯素(bullatacin含量超过50％wt)及其制备方法和在制备抗癌药物中的应用。
技术方案抗癌药番酯素，其番荔枝内脂化合物(bullatacin)含量超过50％wt。
一种抗癌药番酯素的制备方法，制备步骤为番荔枝(Annona squamosa Linn.)种子风干后，粉碎成粗粉；取番荔枝粗粉9～11倍质量的乙醇，对番荔枝粗粉热回流提取2小时，提取液回收得到浸膏A；浸膏A先用石油醚萃取，石油醚萃取后的残留液再用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并回收得到浸膏B；浸膏B再按浸膏重量∶硅胶重量＝1∶4～1∶6的比例装硅胶柱，用体积比分别为(19～21)∶1、(9～11)∶1、(8～10)∶1、(7～9)∶1、(6～8)∶1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，以薄层色谱跟踪检测，富含番酯素的馏分在体积比为(8～10)∶1的石油醚-乙酸乙酯洗脱液的后5个柱体积，合并洗脱液回收得到浸膏C；浸膏C用体积比为1∶(0.8-1.2)的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂重结晶3次得到番荔枝内脂化合物(bullatacin)含量超过50％wt的晶体，此即为番酯素。
所述重结晶法的方法为将浸膏C溶于5倍体积量的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂中，所述石油醚-乙酸乙酯混合溶剂中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为1∶(0.8～1.2)，在65-75℃的水浴中充分搅拌使其溶解，室温放冷后，有黄白色固体析出，弃去黄色母液，再反复重结晶两次，即可得到白色固体。
所述乙醇的体积浓度为95％。
番酯素在制备抗肿瘤药物中应用。
有益效果本发明提供了一种抗癌物质番酯素(bullatacin含量超过50％wt)及其制备方法和应用，该提取方法效率高，有效成分的含量达到中药五类新药原料药的要求，并且操作简单，降低了生产成本。
四
图1是本发明的重结晶法得到的番脂素中间体液相色谱图(峰1为Bullatacin，含量为56.61％)； 图2是番荔枝药材液相色谱图(峰1为Bullatacin)； 图3是Bullatacin对照品液相色谱图(峰1为Bullatacin)； 图4柱层析法得到的番酯素中间体液相色谱图(峰1为Bullatacin，含量为41.18％)。
五具体实施例方式 实施例1番酯素的提取制备方法 番荔枝种子风干后，粉碎成粗粉。取药材10倍量的95％vt乙醇热回流提取2小时，提取液回收得到浸膏A。浸膏A先用石油醚萃取，残留液再用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，回收得到浸膏B。浸膏B再按浸膏重量硅胶重量(1∶5)装硅胶柱，分别用石油醚-乙酸乙酯(20∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1，体积比)梯度洗脱，以薄层色谱跟踪检测，富含Bullatacin的馏分在石油醚-乙酸乙酯(9∶1，体积比)洗脱液的后5个柱体积，合并，回收得到浸膏C。浸膏C用石油醚-乙酸乙酯(1∶1，体积比)混合溶剂重结晶3次可得到bullatacin含量超过50％wt的番酯素中间体。
重结晶法的具体方法为将富含Bullatacin的浸膏溶于5倍量的石油醚-乙酸乙酯(1∶1，体积比)混合溶剂中，在70℃的水浴中充分搅拌使其溶解。室温放冷后，有黄白色固体析出。弃去黄色母液，再反复重结晶两次，即可得到白色固体。
实施例2番酯素的提取制备方法 一种抗癌药番酯素的制备方法，制备步骤为番荔枝(Annona squamosa Linn.)种子风干后，粉碎成粗粉；取番荔枝粗粉9倍质量的乙醇，对番荔枝粗粉热回流提取2小时，提取液回收得到浸膏A；浸膏A先用石油醚萃取，石油醚萃取后的残留液再用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并回收得到浸膏B；浸膏B再按浸膏重量∶硅胶重量＝1∶4的比例装硅胶柱，用体积比分别为19∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，以薄层色谱跟踪检测，富含番酯素的馏分在体积比为8∶1的石油醚-乙酸乙酯洗脱液的后5个柱体积，合并洗脱液回收得到浸膏C；浸膏C用体积比为1∶0.8的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂重结晶3次得到番荔枝内脂化合物(bullatacin)含量超过50％wt的晶体，此即为番酯素。重结晶法的方法为将浸膏C溶于5倍体积量的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂中，所述石油醚-乙酸乙酯混合溶剂中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为1∶0.8，在65℃的水浴中充分搅拌使其溶解，室温放冷后，有黄白色固体析出，弃去黄色母液，再反复重结晶两次，即可得到白色固体。所述乙醇的体积浓度为95％。
实施例3番酯素的提取制备方法 一种抗癌药番酯素的制备方法，制备步骤为番荔枝(Annona squamosa Linn.)种子风干后，粉碎成粗粉；取番荔枝粗粉11倍质量的乙醇，对番荔枝粗粉热回流提取2小时，提取液回收得到浸膏A；浸膏A先用石油醚萃取，石油醚萃取后的残留液再用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并回收得到浸膏B；浸膏B再按浸膏重量∶硅胶重量＝1∶6的比例装硅胶柱，用体积比分别为21∶1、11∶1、10∶1、9∶1、8∶1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，以薄层色谱跟踪检测，富含番酯素的馏分在体积比为10∶1的石油醚-乙酸乙酯洗脱液的后5个柱体积，合并洗脱液回收得到浸膏C；浸膏C用体积比为1∶1.2的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂重结晶3次得到番荔枝内脂化合物(bullatacin)含量超过50％wt的晶体，此即为番酯素。重结晶法的方法为将浸膏C溶于5倍体积量的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂中，所述石油醚-乙酸乙酯混合溶剂中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为1∶1.2，在75℃的水浴中充分搅拌使其溶解，室温放冷后，有黄白色固体析出，弃去黄色母液，再反复重结晶两次，即可得到白色固体。所述乙醇的体积浓度为95％。
实施例4 第一部分番荔枝药材和中间体的质量标准研究 1.仪器及色谱条件 仪器高效液相系统为Aglient 1100 HPLC system，包括具有在线脱气二元泵，自动进样器，紫外检测器，KH500DB型超声波提取器(昆山超声仪器有限公司)，十万分之一电子天平(上海天平仪器厂)，自动纯水机(Millipore，Bedford，MA，USA)。
色谱条件色谱柱为ODS C18柱Hedra ODS-3(4.6×250mm，5μm)，SB-C18预柱。柱温25℃，流速1mL/min；流动相甲醇-水(90∶10)；检测波长220nm。
2.提取条件的优化 我们比较了甲醇、95％vt乙醇两种溶剂的提取效率。结果表明95％vt乙醇的提取率略高于甲醇。但是乙醇的提取物定容时有油状液滴不溶于甲醇，这将给含量测定带来很大误差，所以我们选择甲醇为质量分析研究的提取溶剂。为了优化条件，我们考察了不同提取时间对提取效率的影响。称取药材粗粉2份，每份2g，精密称定，加入20ml甲醇冷浸2小时后按下表操作考察。结果如下 以上实验结果表明，质量分析研究用提取的最优条件为以药材10倍量的甲醇浸泡2小时后超声20分钟。
3.标准曲线及线性范围 精密称取Bullatacin对照品10.08mg，定容于10mL容量瓶中。分别精密吸取0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1mL对照品溶液于1mL容量瓶中，甲醇定容。依次进样10μL，作HPLC分析。以峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y＝6761X+7.6071，r＝0.9998，表明Bullatacin在1.008～10.08μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
4.精密度试验 在上述色谱条件下以中间浓度的Bullatacin对照品溶液，在一天内连续进样6次，每次10μL，进行HPLC分析，测定峰面积的RSD为0.2％；再以同样的Bullatacin对照品溶液连续进样3天，每天2次，测定峰面积的RSD为2.8％，结果表明精密度良好。
5.重复性试验 取番荔枝种子粗粉2g，按“7.样品分析”项下操作，平行制备供试液5份，分别测定，计算各峰面积RSD为1.2％，结果表明测定方法重复性良好。
6.稳定性试验 取番荔枝种子粗粉2g，按“7.样品分析”项下操作，制备供试液，于1、2、4、8、12、24、48小时内分别测定，计算各峰面积的RSD为2.1％，结果表明供试液在48小时内稳定。
7.加样回收率试验 称取已知含量的番荔枝种子2g，精密称定，分别加入适量的对照品，按“7.样品分析”项下操作，平行制备供试液5份，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，以10μL的进样量进行HPLC分析，记录各峰面积，计算回收率。结果回收率为95.57％～104.71％，平均回收率为99.90％，回收率RSD为3.7％。
8.样品分析 8.1取番荔枝药材2g，精密称定，加入20mL甲醇浸泡2小时，超声20分钟，过滤，滤液回收至干，残渣加甲醇定容于10mL容量瓶中。用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，以10μL的进样量进行HPLC分析，重复进样3次，记录峰面积，计算药材中Bullatacin的含量，含量平均值为0.146％。
8.2取重结晶得到的番脂素中间体1mg，精密称定，甲醇定容于1mL的容量瓶中，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，以10μL的进样量进行HPLC分析，重复进样3次，记录峰面积，计算中间体中Bullatacin含量，含量平均值为56.61％。
实施例5 一、提取工艺研究 1.提取工艺路线设计 理想的提取溶媒应符合下列条件①能最大限度地提取药材中的有效成分而不提取或少提取杂质。②性质稳定，不与有效成分发生反应。③廉价易得，或可回收利用。④使用方便，安全。
番荔枝中间体的制备原料是番荔枝中的有效部位——番荔枝内酯。番荔枝内酯一般易溶于甲醇和乙醇。现在常用的提取方法有以甲醇或乙醇为溶媒超声或热回流提取。
2.提取溶剂的初步判定 我们比较了95％乙醇和甲醇在超声和热回流下的提取效率。称取番荔枝种子药材粗粉4份，各约2g，精密称定，置于50mL圆底烧瓶中，将4份药材分为A、B两组。每组中两份药材分别加入20mL的95％乙醇和20mL的甲醇。浸泡2小时后，取A组超声20min，过滤，滤液回收至干。B组于水浴锅上热回流提取2小时，过滤，滤液回收至干。然后用甲醇定容于10mL容量瓶中，经微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液10μL进行HPLC分析。实验结果如下。
从上表中可以看出，95％乙醇的提取效率比甲醇高，故确定95％乙醇为提取溶剂。
3.提取工艺技术参数的优化 我们还考察了不同乙醇浓度和提取时间对提取效率的影响。称取药材4份，各约2g，于50mL圆底烧瓶中，分别加入75％vt、85％vt、95％vt、95％vt乙醇各20mL，提取1次，其中一份95％乙醇溶剂提取2小时，其他三份提取3小时，过滤，滤液回收至干。然后用甲醇定容于10mL容量瓶中，经微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液10μL进行HPLC分析。实验结果如下。
由上表可知，10倍量的95％vt乙醇热回流提取效率最高。基于以上结果，我们又比较了95％vt乙醇回流1小时和2小时的提取效率，其结果为回流1小时的有效成分含量0.107％，回流2小时的有效成分含量为0.113％。
综上所述，我们确定提取工艺为10倍量的95％vt乙醇热回流提取2小时。
二.纯化工艺研究 通过以上方法提取到的番荔枝乙醇提取物，其中的Bullatacin含量很低，达不到中药五类新药原料药的要求(含量应大于50％wt)，需要进一步纯化。
番荔枝内酯类成分在乙酸乙酯、氯仿等中等极性溶剂中溶解性很好。故提取得到的乙醇提取物，先用石油醚萃取，以除去脂肪酸等小极性物质。考虑到氯仿对环境的污染较严重，我们选择乙酸乙酯萃取乙醇提取物中的中等极性物质，此时得到的产品中番荔枝内酯的含量还比较低。
萃取得到的浸膏，我们用普通硅胶柱层析进行粗分。步骤如下以浸膏重量∶硅胶重量(1∶5)装柱，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱液梯度洗脱。从石油醚-乙酸乙酯(20∶1，体积比)开始，洗脱3个柱体积；之后加大极性为石油醚-乙酸乙酯(10∶1，体积比)，洗脱7个柱体积；再加大极性为石油醚-乙酸乙酯(9∶1，体积比)，洗脱10个柱体积；再加大极性为石油醚-乙酸乙酯(8∶1，体积比)，洗脱10个柱体积；再加大极性为石油醚-乙酸乙酯(7∶1，体积比)，洗脱至接近空白。各馏分经薄层色谱检测，Bullatacin在石油醚-乙酸乙酯(9∶1，体积比)的后5个柱体积中被洗脱出来。
洗脱液浓缩后，富含Bullatacin的馏分呈黄色或淡黄色半固体状。我们用两种方法进行纯化，以期得到符合中药五类新药原料药要求的Bullatacin中间体。
第一种方法是反复硅胶柱层析。富含Bullatacin的浸膏再以浸膏∶硅胶(1∶5)装柱，用石油醚-乙酸乙酯(9∶1，体积比)洗脱，在经过3次硅胶柱层析后，得到的产品为淡黄色固体。称取适量溶于甲醇，微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液10μL进行HPLC分析，按归一化法计算，Bullatacin含量为41.18％。
第二种方法为重结晶法。具体方法为将富含Bullatacin的浸膏溶于5倍量的石油醚-乙酸乙酯(1∶1，体积比)混合溶剂中，在70℃的水浴中充分搅拌使其溶解。室温放冷后，有黄白色固体析出。弃去黄色母液，再反复重结晶两次，即可得到白色固体。取适量溶于甲醇，微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液10μL进行HPLC分析，按归一化法计算，Bullatacin含量为56.61％。
比较两种方法可以发现，重结晶法操作简单，成本少，可达到中药五类新药原料药的要求，作为工业化生产方法具有可操作性。
通过以上实验确定工艺为取药材10倍量的95％乙醇热回流提取2小时，提取液回收得到浸膏A。浸膏A先用石油醚萃取，残留液再用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，回收得到浸膏B。浸膏B再按浸膏重量∶硅胶重量(1∶5)装硅胶柱，分别用石油醚-乙酸乙酯(20∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1，体积比)梯度洗脱，以薄层色谱跟踪检测，富含Bullatacin的馏分在石油醚-乙酸乙酯(9∶1，体积比)洗脱液的后5个柱体积，合并，回收得到浸膏C。浸膏C用石油醚-乙酸乙酯(1∶1，体积比)混合溶剂重结晶3次可得到符合中药五类新药原料药的要求的番酯素中间体。
实施例6 样品为白色固体(石油醚-乙酸乙酯)，mp 77～79℃。ESI-MS m/z645.6[M+Na]+，显示化合物分子量为622。1H-NMR(CDCl3)δ0.88(3H，t，H-34)，1.43(3H，d，H-37)，2.40(1H，ddt，H-3)，2.53(1H，ddt，H-3)，3.40(1H，m，H-15)，3.85(1H，m，H-4)，3.85(1H，m，H-16)，3.85(1H，m，H-20)，3.85(1H，m，H-24)，3.92(1H，m，H-19)，3.92(1H，m，H-23)，5.06(1H，m，H-36)，7.18(1H，m，H-35)。13C-NMR谱中δ174.56为内酯羰基信号，δ151.73和131.22为双键上两个碳的信号。1H，13C-NMR数据与文献报道基本一致，确定为番酯素主要成分bullatacin。结构如下图所示，13C-NMR信号归属见表1。
番酯素主要成分bullatacin的化学结构 式分子式为C37H66O7 表1化合物bullatacin与文献13C-NMR谱数据比较(CDCl3) 实施例7 番酯素对移植性肺癌的抑制作用 1、实验动物和瘤株 雄性健康C57BL/6小鼠，体重18-22g，鼠龄6-8周，购自本校动物实验中心；小鼠Lewis肺癌瘤株购自江苏省肿瘤研究所动物实验中心。
2、造模与实验方法 C57BL/6小鼠60只，按比例随机留10只为阴性对照组，其余50只进行造模。制备Lewis肺癌荷瘤小鼠，剥离生长旺盛期的瘤组织，选取生长良好的肿块1.5mm3左右，按肿瘤(g)∶生理盐水(ml)为1∶3比例匀浆，调细胞数为2×106/ml。选取健康小鼠，在无菌条件下每只小鼠右侧腋窝皮下接种0.2ml。整个接种过程须在无菌罩内以无菌操作进行，1h内完成接种。
接种后随机分为5组，每组10只，分别为肿瘤模型对照组、15μg/kg、30μg/kg和60μg/kg试验组、5-fu阳性对照组，另加阴性对照组，共6组。接种瘤细胞24h后，试验组腹腔注射番酯素，剂量分别为15μg/kg、30μg/kg和60μg/kg，阴性对照组和肿瘤模型对照组等体积注射药物溶媒，5-FU对照组以生理盐水为溶剂，剂量为20mg/kg，各组动物均按0.2ml在腹腔注射，连续给药10d。末次给药后次日，进行如下观察 完整剥离瘤块，并称重计算肿瘤抑制率，肿瘤抑制率＝(对照组肿瘤重量-治疗组肿瘤重量)/对照组肿瘤重量×100％。
3、实验结果 番酯素对小鼠移植性肺癌的生长抑制作用不同剂量的番酯素均能显著抑制小鼠移植性肺癌的生长(P＜0.01)，其抗肺癌活性高于化疗药5-氟脲嘧啶(5-FU)，见表2。
权利要求
1.抗癌药番酯素，其特征在于其番荔枝内脂化合物(bullatacin)含量超过50％wt。
2.一种抗癌药番酯素的制备方法，其特征在于制备步骤为
a.番荔枝(Annona squamosa Linn.)种子风干后，粉碎成粗粉；
b.取番荔枝粗粉9～11倍质量的乙醇，对番荔枝粗粉热回流提取2小时，提取液回收得到浸膏A；
c.浸膏A先用石油醚萃取，石油醚萃取后的残留液再用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并回收得到浸膏B；
d.浸膏B再按浸膏重量∶硅胶重量＝1∶4～1∶6的比例装硅胶柱，用体积比分别为(19～21)∶1、(9～11)∶1、(8～10)∶1、(7～9)∶1、(6～8)∶1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，以薄层色谱跟踪检测，富含番酯素的馏分在体积比为(8～10)∶1的石油醚-乙酸乙酯洗脱液的后5个柱体积，合并洗脱液回收得到浸膏C；
e.浸膏C用体积比为1∶(0.8-1.2)的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂重结晶3次得到番荔枝内脂化合物(bullatacin)含量超过50％wt的晶体，此即为番酯素。
3.根据权利要求1所述的番酯素的制备方法，其特征在于所述重结晶法的方法为将浸膏C溶于5倍体积量的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂中，所述石油醚-乙酸乙酯混合溶剂中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为1∶(0.8～1.2)，在65-75℃的水浴中充分搅拌使其溶解，室温放冷后，有黄白色固体析出，弃去黄色母液，再反复重结晶两次，即可得到白色固体。
4.根据权利要求1所述的番酯素的制备方法，其特征在于所述乙醇的体积浓度为95％。
5.权利要求1所述番酯素在制备抗肿瘤药物中应用。
全文摘要
抗癌药番酯素，其番荔枝内脂化合物含量超过50％wt。一种抗癌药番酯素的制备方法，制备步骤为番荔枝种子粉碎成粗粉；取乙醇，对番荔枝粗粉热回流提取，提取液回收得到浸膏A；浸膏A先用石油醚萃取，石油醚萃取后的残留液再用乙酸乙酯萃取，合并萃取液并回收得到浸膏B；浸膏B再用硅胶柱，石油醚-乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，以薄层色谱跟踪检测，合并洗脱液回收得到浸膏C；浸膏C用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂重结晶得到番荔枝内脂化合物含量超过50％wt的晶体。本发明提供了一种抗癌物质番酯素及其制备方法和应用，该提取方法效率高，有效成分的含量达到中药五类新药原料药的要求，并且操作简单，降低了生产成本。
文档编号A61K31/365GK101700261SQ20091023451
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月20日 优先权日2009年11月20日
发明者章永红 申请人:南京中医药大学