专利名称：一种抗菌肽b及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗菌肽，尤其涉及一种具有显著抑菌活性的抗菌肽B及其应用。
背景技术：
目前，由于抗菌药物的广泛使用，使多数的常规抗生素都出现了相应的耐药性致病株系，因而寻找全新类型的抗菌药物成为解决耐药性问题的又一课题。抗菌肽是对多种微生物、病毒、原虫甚至癌细胞都有明显抑杀作用的小分子多肽， 广泛存在于生物体内。与抗生素不同，抗菌肽是特定基因编码的产物，它通过破坏细胞膜通透性使细胞内容物外流，最终导致细菌死亡，其抑菌过程中细菌不易产生耐药性，因此抗菌肽非常有望成为替代抗生素的新型抗菌药物。近年来，多肽在人体中的作用已越来越多的被科学界发现，其产生的医药效果也引起了人们的高度重视。因此，开发具有诊断、监测、预防和治疗药作用的多肽药物的研究成为迫切任务。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有显著抑菌活性的抗菌肽B及其应用。本发明所述的抗菌肽B，其氨基酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列；所述氨基酸序列具体信息是(a)序列特征*长度17氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(C)序列描述Leu Val Val Ala Gly Lys lie Ala Ala lie Gly lie Lys Lys lie Gly Lys0本发明提供的抗菌肽B不需任何修饰连接，且人工合成方便；试验证明具有显著的抑菌功能，同时对正常细胞无毒性。本发明所述抗菌肽B在制备抗菌药物中的应用。功能实验显示本发明所述抗菌肽B抗菌谱很广，无论是G+菌(革兰氏阳性菌)、 还是G菌(革兰氏阴性菌)，都能被它很好地抑制，而且对真菌的抑制作用也很明显。提示其在抗菌药物开发和应用方面有重要价值。进一步的功能实验显示本发明的抗菌肽B对细菌的抑制作用在IOmin之内就开始发挥，20min后抑制率即可达80%，45min后就可达到95%以上。鉴于上述多肽的性质和功能，本领域普通技术人员可以利用分子生物学技术，根据氨基酸与密码子的对应关系反推出核酸序列作为功能基因，用于制备转基因动物、植物或工程菌以表达功能蛋白，并用于药物的开发和临床治疗。
具体实施例方式实施例1本发明所述抗菌肽B的设计与合成1、依据目前国际主要抗菌肽数据库(http //www. imtech. res. in/raghava/ antibp/ ；http//aps.unmc. edu/AP/main. php ；http//www. bbcm. univ. trieste. it/ ； http://penbase. immunaqua. com/)中登陆的抗菌肽的序列，分析其一级结构与活性的关系的对应关系，设计人工多肽序列。2、利用蛋白质分析数据库http://WWW. expasy. org/分析已知活性的多肽序列与设计的多肽序列的二级结构的相似度，结合其它物理化学参数预测进行设计序列的修正。3、将设计的人工多肽序列(抗菌肽)送至生物公司合成或利用自动多肽合成仪合成序列。HPLC检测纯度要大于96%，同时通过质谱检测确定多肽合成质量。样品以冻干状态保存。4、合成后的多肽进行抑菌功能检测筛选。5、通过功能检测，最终获得具有抑菌功能的多肽序列——抗菌肽B，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。实施例2利用液体生长抑制法检测本发明所述抗菌肽B的抑菌活性2. 1材料、试剂1)本发明所述抗菌肽B由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，氨苄青霉素 (Amp)为solarbio公司产品，一次性滤器，为美国PALL公司产品，其它药品试剂为国产分析纯。2)选用革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subti lis (Ehrenberg) Cohn)、 金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、藤求菌(Sarcina ureae)、苏云金芽子包杆菌(Bacillus thuringiensis) > 巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)；革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)、 弧菌(Vibrio)、肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、变形杆菌(Proteus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)；真菌
病镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、瓜类炭疽病菌 (Colletetrichum lagenarium)、苹果炭疽病菌(Gloeosporium album)棉花黄萎病菌 (Verticillium dahliae)进行测试。3)封闭液0. 4% BSA(w/v),0. 02%冰醋酸，配制后过滤除菌。4) PB 液体培养基(PH 7. 4-7. 6)胰蛋白胨(Tryptone)10g/L氯化钠(NaCl)5g/L2. 2 实验1)向无菌96孔酶标板所使用的孔中加入200 μ L封闭液，室温封闭Mh。2)用PB液体培养基过夜培养上述各种细菌，转培养使细菌处于对数生长期。用PB培养基调整菌液0D_约为0. 005。3)酶标板弃去封闭液，每孔加90 μ L步骤2、所述菌液，再加入用10 μ L无菌水配好的各种浓度梯度(浓度范围20mg/mL 80mg/mL)的本发明所述抗菌肽B。阴性对照为 90 μ L菌液+10 μ L无菌水；阳性对照为90 μ 1菌液+10 μ L浓度为0. 25mg/mL氨苄青霉素溶液(终浓度为0. 025mg/mL,约62 μ M)。4)将加好菌液和药品的酶标板置于摇床，IOOrpm恒温培养。分别在培养后 0. 5h、3h、12h、15h、24h、36h，用 BIOTEK ELX800 酶标仪测定每孔的 630nm 吸光值(OD630)。5)利用SigmaplotlO和Excel软件分析处理数据。结果表明，本发明的抗菌肽B对G+菌、或是对G_菌都具有明显的抑制作用，并且对真菌也有抑制作用；35mg/mL 70mg/mL浓度范围内，浓度越大抑菌效果越明显。提示其在抗菌药物开发和应用方面有重要价值。实施例3以大肠杆菌(Escherichia coli)为指示菌。质量浓度为65mg/mL的本发明抗菌肽B，分别在作用大肠杆菌(Escherichia coli) IOmin, 25min, 45min, 60min 禾口 90min 后涂板。大肠杆菌抑制曲线显示本发明的抗菌肽B对细菌的抑制作用在IOmin之内就开始发挥，20min后抑制率即可达80%，45min后就可达到95%以上。
权利要求
1.一种抗菌肽B，其特征在于所述抗菌肽B的氨基酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列；其氨基酸序列具体信息是(a)序列特征*长度17氨基酸 *类型氨基酸 *链型单链 *拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)序列描述Leu Val Val Ala Gly Lys lie Ala Ala lie Gly lie Lys Lys lie Gly Lys。
2.权利要求1所述抗菌肽B在制备抗菌药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述细菌是革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。
全文摘要
本发明公开了一种抗菌肽B，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了所述抗菌肽B在制备抗菌药物中的应用，实验显示本发明所述抗菌肽B对革兰氏阳性菌或是革兰氏阴性菌都有很好地抑制作用，而且对真菌的抑制作用也很明显。提示其在抗菌药物开发和应用方面有重要价值。
文档编号A61P31/04GK102212118SQ20111013220
公开日2011年10月12日 申请日期2011年5月20日 优先权日2011年5月20日
发明者常宏文, 张尚立, 张恒, 王丽, 王萍, 马剑峰 申请人:山东大学