专利名称：一种用于治疗或预防猪感染性疾病的疫苗佐剂组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗佐剂，特别是指一种含有黄芪多糖及其聚合物的用于治疗或预防猪感染性疾病的疫苗佐剂组合物。
背景技术：
疫苗佐剂被用于达成二个目的:其减缓抗原从注射部位释出，且其刺激免疫系统。传统疫苗通常由灭活或被杀死或经修饰的活致病微生物的粗制备物组成。与这些致病微生物的培养物相关的杂质可作为增强免疫应答的佐剂。然而加入佐剂可容许使用较小剂量的抗原来刺激类似的免疫应答，从而减少疫苗的制造成本。因此，当将疫苗与佐剂组合时可显著增加某些可注射疫苗的效力。在选择疫苗佐剂时必须考虑许多因素。疫苗佐剂应该以有效方式使抗原的释出和吸收速率缓慢，且对宿主的毒性、变应原性、刺激及其它不想要的作用最小。为了使人满意，佐剂应为非杀病毒性、可生物降解、可持续产生高水平的免疫力、能刺激交叉保护作用、可与多种抗原兼容、在多种物种中有效、对宿主无毒且安全(如:无注射部位反应)。其它期望的佐剂特征为可微量给药、剂量节省、具有优良的货架稳定性、可承受干燥、可制成不含油、可作为固体或液体存在、为等张性、容易制造且其制造并不昂贵。最后，高度期望能够根据疫苗接种方案的需要而将佐 剂配置成诱导体液或细胞免疫应答或二者兼有。然而，可符合上述条件的佐剂的数量有限。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种用于治疗或预防猪感染性疾病的疫苗佐剂组合物，其特征在于，含有以下组分:黄芪提取物、聚合物和抗原成分。优选地,本发明所述黄芪提取物含有大于70% Wt的黄芪多糖；更优选地,含有大于90% wt的黄芪多糖优选地，本发明所述黄芪提取物中黄芪多糖量为0.1 100mg/ml ;更优选地，所述黄芪提取物中黄芪多糖量为I 10mg/ml ;最优选地，所述黄芪提取物中黄芪多糖量为3 4mg/mlο优选地，本发明所述聚合物为聚丙烯酸；更优选地，所述聚合物为商品名为卡波姆(Carbomer)的聚丙烯酸；更优选为 Carbomer940、Carbomer974P、Carbomer934P 和Carbomer971P,最优选为 Carbomer934P。本发明所述聚合物的量通常为0.001mg/ml 50mg/ml,优选0.1 10mg/ml,更优选 0.1 5mg/ml,最优选 lmg/ml 3mg/ml。本发明的所述疫苗佐剂与以下疫苗抗原配合使用:细菌性抗原或病毒性抗原；优选抗原猪细菌性抗原和病毒性抗原；最优选猪圆环病毒抗原或支原体抗原。本发明的另一方面为提供上述疫苗佐剂组合物的制备方法，包括如下步骤:A)在缓冲液中制备抗原成分的组合物；
B)将所述的黄芪多糖黄芪提取物加入步骤A的组合物中；C)将所述的聚合物加入步骤B的组合物中。本发明的另一目的在于提供一种疫苗佐剂组合物，其特征在于，还包括环糊精衍生物。优选地，本发明所述的环糊精衍生物为公开于CN 1175264A的环糊精衍生物SL-O),其含量为0.1 10mg/ml,更优选0.1 5mg/ml,最优选2mg/ml。同样地，上述含环糊精衍生物的疫苗佐剂可以与以下疫苗抗原配合使用:细菌性抗原或病毒性抗原；优选抗原猪细菌性抗原和病毒性抗原，最优选猪圆环病毒抗原或支原体抗原。本发明的另一方面为提供上述环糊精衍生物如SL-CD的疫苗佐剂组合物的制备方法，包括如下步骤:A)在缓冲液中制备抗原成分的组合物；B)将所述的黄芪提取物加入步骤A的组合物中；C)将所述聚合物加入步骤B的组合物中； D)将所述的环糊精衍生物加入步骤C的组合物中。由上可以看出，本发明的用于治疗或预防猪感染性疾病的疫苗佐剂组合物至少有以下优点:1.可以提高疫 苗免疫保护力，没有副作用:通过本发明后续实施例可以看出，本发明的疫苗佐剂可以大幅度提高疫苗的免疫效力，如至少可以降低到原抗原一般的用量即可达到原有免疫效力；另一方面，通过多种剂量的疫苗佐剂的试验证明，本发明的疫苗佐剂没有明显的副作用，特别是相对于常用的油相佐剂，副作用明显减少。2.本发明的疫苗佐剂配制简单，直接混匀即可；3.通过使用本发明的疫苗佐剂，可以大大降低疫苗中抗原的使用量，从而降低成本。
具体实施例方式术语:黄芪提取物:豆科植物蒙古黄芪或荚膜黄芪的提取物，主要成分为黄芪甲苷和黄芪多糖。SL-⑶:按照中国专利公开号CN1175264A实施例6制备的环糊精衍生物，被至少一个但不多于N-1个至少有8个碳原子的线性烃链基团和至少一个但不多于N-1个硫酸盐基团所取代，其中所述的线性烃链基团选自烷基酰基和烯基酰基，其中所述的线性烃链基团和硫酸盐基团的合并总数不超过N，进一步的是其中N是从中得到环糊精衍生物的环糊精
的轻基数。“抗原”或“免疫原”是指任何刺激免疫应答的物质。此名词包括被杀死的、灭活的、减毒的或经修饰的活细菌、病毒或寄生虫。术语抗原亦包括个别的或其任何组合的多核苷酸、多肽、重组蛋白质、合成的肽、蛋白质提取物、细胞(包括肿瘤细胞)、组织、多糖、或脂质、或其片段。术语抗原亦包括抗体，诸如抗受试者遗传型抗体或其片段，以及可模拟抗原或抗原决定簇(表位)的合成肽模拟位
“菌苗”是指可作为疫苗或免疫原性组合物的组分使用的一种或多种被杀死的细菌的悬浮液。佐剂通常被用于达到两种目的:减缓抗原从注射部位的释放以及刺激免疫系统。“缓冲液”是指防止另一种化学物质的浓度变化的化学系统是指防止另一种化学物质的浓度变化的化学系统，如:质子供体及受体系统可作为防止氢离子浓度(PH)明显改变的缓冲液。另一缓冲液例子为含有弱酸及其盐(共轭碱)或弱碱及其盐(共轭酸)的混合物的溶液“抗体”是指可因为对抗原的免疫应答而与特异抗原结合的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白是由具有“恒定”及“可变”区的“轻”及“重”多肽链所组成的血清蛋白质，且根据该恒定区的组成而区分为数类(如:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)“TCID50”是指“组织培养感染剂量”且定义为感染50%指定批次的经接种的细胞培养物时所需要的病毒稀释量。可使用多种方法来计算TCID50，包括本说明书全文中所使用的斯皮尔曼--伯法(Spearman-Karber method)。本发明实施例中所选用的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)毒株为PCV2b毒株SH株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期:2008年3月4日，保藏号为CGMCC N0.23890。此毒株在中国专利公开CN101240264公开。本发明的灭活剂为甲醛溶液，其使用的终浓度为0.1 0.3% (v/v)，灭活时间为24 48h。优选地，本发明实施例中使用了终浓度0.2%体积的甲醛灭活PCV2 SH株，灭活时间为18小时。本发明实施例 中使用了密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量为300Kda)作3倍浓缩，如后续实施例证明，该方法和浓度可以使最后获得二联疫苗获得较佳的疫苗效果；本发明还可以使用其他的超滤方法，如纤维素超滤法和多次超滤等方法。为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。实施例1、含猪圆环病毒抗原的疫苗佐剂组合物及其疫苗1.猪圆环病毒抗原的制备1.1生产用菌(毒)种的制备猪圆环病毒2型SH的制备:将毒种用MEM培养基(GibcO ，Invitrogen公司)作10倍稀释，按5%体积接种于PK15 (ATCC，保藏号为CCL-33)细胞培养，37°C吸附30分钟，加入含4%犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，37°C培养4日，冻融2 3次，收获病毒，病毒滴度为106_ 5TCID5(l/ml。1.2病毒液或菌液的培养制备猪圆环病毒2型SH株病毒液的制备:用转瓶细胞培养法。将长满单层的PK15细胞(购自ATCC)，倒去细胞培养液，将毒种液按0.1 0.2TCID50/个细胞的接种量接种于PK15细胞上，轻轻旋转细胞瓶2周，37°C吸附30分钟，加入细胞维持液，置37°C旋转(10 12转/小时)培养。每日观察I 2次，细胞生长良好，37°C培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20°C以下保存收获病毒，病毒滴度为106_5TCID5tlAiL
1.3病毒液或菌液的处理猪圆环病毒2型SH株病毒液的处理:将病毒液用中空纤维滤柱(孔径ΙΟμπι与
0.45 μ m)过滤，除去细胞碎片。1.4病毒液或菌液的灭活猪圆环病毒2型SH株病毒液的灭活:将检验合格的步骤1.3处理的病毒液加入甲醛溶液。灭活，使甲醛溶液的终浓度为0.2% (V/V)，随即充分摇匀升温，当温度升至37°C时开始计时，保持18小时灭活完毕，加入0.2% (w/v)的焦亚硫酸钠终止灭活，置2 8°C保存2.黄芪提取物的制备将黄芪药材粉碎成最粗粉，加10倍量水浸泡I小时后，回流提取3次，加水量依次为10倍、8倍、6倍，提取时间依次为2小时、1.5小时、1.5小时，合并3次提取液，冷却至室温，高速离心机离心，8000转每分钟离心20分钟，上清液浓缩至相对密度为1.15
1.20，加无水乙醇至含醇量为70%，4°C静置12小时，弃去上清液，沉淀加水溶解，使浓度成Ig生药/ml的溶液，加无水乙醇至含醇量为35%，高速离心机离心，8000转每分钟离心20分钟，取上清液，加无水乙醇至含醇量为70%，4°C静置12小时，弃去上清液，沉淀依次用80%、95%、无水乙醇洗涤 脱水后，80°C真空干燥12小时，即得黄芪提取物，用硫酸-苯酚比色法测得黄芪多糖的含量以葡萄糖计为90% wt，用高效液相色谱法测定其含黄芪甲苷为0.01 % Wt03.免疫佐剂组合物的制备3.1配制储备液3.1.UPBS 缓冲溶液的配制；0.0lM pH = 7.2 PBS 2000mla:先配制甲液:0.2M 的 Na2HPO4 缓冲溶液 IOOOmlNa2HPO4.12H20 71.625g，注射用水1000ml，于IOOOml容量瓶中定容b:再配制乙液:0.2M 的 NaH2PO4 缓冲溶液 IOOOmlNaH2PO4.2H20 31.202g,注射用水1000ml，在IOOOml容量瓶中定容c:甲液:乙液=72: 28 (体积);d:甲液和乙液混合，并用注射用水将其20倍体积稀释后，按终浓度0.85%加入NaCL即得0.0lM pH = 7.2的PBS。分装后，121 °C 30min高压灭菌。室温放置。3.1.2黄芪提取物溶液的制备将步骤2制备黄芪提取物溶解在去离子水中，制成250mg/ml (质量/体积)的储备溶液112°C 30min高压灭菌，4°C保存3.1.3卡波姆溶液的制备将卡波姆Carbomer 934P (青岛天力源生物科技有限公司)溶解在去离子水中，制成25mg/ml的储备溶液12°C 30min高压灭菌，4°C保存3.1.4 SL-CD 溶液的制备按照中国专利公开号CN1175264实施例6制备SL-⑶，用去离子水，制成浓度为0.75%的储备溶液12°C 30min高压灭菌，4°C保存。3.2含本发明的疫苗佐剂的猪圆环病毒疫苗组合物的制备:使用上述配制的黄芪提取物溶液、卡波姆溶液、SL-CD溶液，按照下面的方法配制猪圆环病毒疫苗组合物:A)在IOmlPBS液中加入上述猪圆环病毒抗原液；B)将黄芪提取物溶液加入A步骤溶液中；C)将卡波姆溶液加入B步骤溶液中；D)将SL-⑶溶液加入到C步骤溶液中；E)补加PBS液至最终体积50ml。其中，可按下表省略加入SL-⑶溶液等步骤，即省略步骤D，按下述方法配置猪圆环病毒疫苗组合物:A)在IOmlPBS液中加入上述猪圆环病毒抗原液；B)将黄芪提取物溶液加入A步骤溶液中；
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C)将卡波姆溶液加入B步骤溶液中；D)补加PBS液至最终体积50ml。或按下表配方省略其他成分，配置猪圆环病毒疫苗组合物:按下面表I的配方制备试验例1-9的含本发明疫苗佐剂的猪圆环病毒疫苗，其中含有上述实施例1中所述的疫苗佐剂组合物:表1、猪圆环病毒疫苗组合物配方组成
权利要求
1.种用于治疗或预防猪感染性疾病的疫苗佐剂组合物，其特征在于，含有以下组分:黄芪提取物、聚合物和抗原成分。
2.据权利要求1的疫苗佐剂组合物，其特征在于，所述黄芪提取物含有大于70%wt的黄芪多糖。
3.据权利要求1的疫苗佐剂组合物，其特征在于，所述黄芪提取物含有大于90%wt的黄芪多糖。
4.据权利要求1的疫苗佐剂组合物，其特征在于，所述黄芪多糖量为0.1 IOOmg/ml ο
5.据权利要求1的疫苗佐剂组合物，其特征在于，所述聚丙烯酸为Carbomer934P。
6.据权利要求1的疫苗佐剂组合物，其特征在于，所述聚合物的量为0.001mg/ml 50mg/ml。
7.据权利要求1-6任意一项所述的的疫苗佐剂组合物，其特征在于，所述组合物还含有环糊精衍生物，所述环糊精为SL-⑶，含量为0.1 10mg/ml。
8.种如权利要求1-6任意一项所述的疫苗佐剂组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: A)在缓冲液中制备抗原成分的组合物； B)将所述的黄芪提取物加入步骤A的组合物中； C)将所述聚合物加入步骤B的组合物中。
9.种如权利要求7所述的疫苗佐剂组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: A)在缓冲液中制备抗原成分的组合物； B)将所述的黄芪提取物加入步骤A的组合物中； C)将所述聚合物加入步骤B的组合物中； D)将所述的环糊精衍生物加入步骤C的组合物中。
10.据权利要求1-7任意一项的疫苗佐剂组合物，其特征在于，所述疫苗佐剂与以下疫苗抗原配合使用:细菌性抗原或病毒性抗原。
11.据权利要求1-7任意一项的疫苗佐剂组合物，其特征在于，所述疫苗佐剂与以下疫苗抗原配合使用:猪圆环病毒抗原或猪肺炎支原体抗原。
全文摘要
本发明提供了一种用于治疗或预防猪感染性疾病的疫苗佐剂组合物，含有以下组分黄芪提取物、聚合物和抗原成分；或含有黄芪提取物、聚合物、环糊精和抗原成分。本发明的所述疫苗佐剂可以与猪圆环病毒抗原或猪肺炎支原体抗原联合使用，可以大幅度提高疫苗的免疫效力，如至少可以降低到原抗原一般的用量即可达到原有免疫效力；另一方面，通过多种剂量的疫苗佐剂的试验证明，本发明的疫苗佐剂没有明显的副作用，特别是相对于常用的油相佐剂，副作用明显减少。
文档编号A61P31/04GK103083658SQ20111033263
公开日2013年5月8日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者张许科, 孙进忠 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司