专利名称：抗肿瘤多药耐药靶向脂质体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤耐药的脂质体及其制备方法，特别涉及抗肿瘤多药耐药长循环靶向脂质体。其特征在于将槲皮素与抗肿瘤药物联合包载于脂质体中，同时靶向于肿瘤组织，逆转肿瘤多药耐药，增强抗肿瘤药物对耐药肿瘤的细胞毒作用，避免不同药物在体内药代动力学性质上的差异和相互作用导致的抗肿瘤药物体内药代动力学性质的改变和毒副作用增强，提高对耐药肿瘤的治疗效果。
背景技术：
肿瘤多药耐药(Multidrug Resistance, MDR)是指肿瘤细胞长期接触一种化疗药物产生耐药性后，此肿瘤对未接触过的、结构无关、机制各异的多种抗肿瘤药物产生交叉耐药性。目前已知与MDR有关的药物包括阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、博来霉素、丝裂霉素、 长春碱、依托泊苷、紫杉醇类，以及顺钼和美法兰等；随着化疗药物的频繁使用，肿瘤治疗中的耐药问题显得越来越突出，目前已成为肿瘤化学治疗最严重的障碍之一。美国癌症协会估计90%的癌症患者的死亡在不同程度上与耐药性的产生有关。MDR形成的分子机制相当复杂，包括①多药耐药基因(MDRl)及其所编码的细胞膜P-gp(P-glyc0pr0tein)过度表达，以及MDR相关蛋白(Multidrug resistance-relatedprotein,MRP)表达增加，促进药物外排和药物的亚细胞分布改变以降低肿瘤中的药物浓度；②核酶DNA拓扑异构酶II (Topoisomerase II, TOPO II)含量减少或性质改变，导致对以TOPO为靶点的抗肿瘤药物耐药；③细胞内氧化和解毒酶系统谷胱甘肽(GSH)转移酶(GST)，以及P450活性增强，肿瘤细胞内药物灭活增加；④肿瘤细胞内DNA 修复能力增强；⑤蛋白激酶(Proteinkinase C, PKC)活性表达增加，使P_gp或MRP发生磷酸化而具有活性；⑥细胞凋亡(Programmedcel death，P⑶)相关基因对MDR基因表达的调节；⑦其它机制还包括细胞增殖速率改变，以及体内药代动力学因素改变等。MDR的形成是一个诸多因素参与的复杂生物过程，可以是某一耐药基因表达，也可以是多种耐药基因同时表达的多种耐药表型。如何针对MDR的发生机制设计出特异性的干预对策，以提高肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性，已成为国内外肿瘤治疗学的研究热点。到目前为止，人们已经尝试了多种方法努力克服肿瘤MDR，包括使用化学增敏剂和抗肿瘤药物的靶向治疗等。研究最深入，最重要的还是针对MDRl/P-gp介导的MDR的逆转剂。此外，还有与谷胱甘肽(GSH)转移酶(GST)有关的MDR逆转剂和与DNA修复有关的MDR逆转剂，以及与蛋白激酶(H(C)有关的MDR逆转剂等。但目前的肿瘤MDR逆转剂普遍存在作用靶点单一，自身毒副作用大的问题，使其临床应用受到很大影响。已有的个别研究尝试了将抗肿瘤药物与肿瘤耐药逆转剂联合给药，但最终效果不好。此外，有报道尝试采用脂质体为载体同时包载抗肿瘤药物与其它药物共同治疗肿瘤，但通过进一步研究发现这些药物与抗肿瘤药物联用后仍不能很好的解决多药耐药的问题。
发明内容
本发明通过比较摸索不同的肿瘤耐药逆转剂，发现槲皮素作为多靶点高效肿瘤 MDR逆转剂，与抗肿瘤药物联用效果好，并且适合采用脂质体制备技术制备复方长循环脂质体，通过静脉注射实现肿瘤MDR逆转剂与抗肿瘤药物的靶向给药，显著提高对耐药肿瘤的治疗效果。本发明提供了一种抗肿瘤的脂质体，脂质体的活性成分含有至少一种抗肿瘤药物以及至少一种肿瘤耐药逆转剂。本发明的抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、柔红霉素或其药学上可接受的盐或酯中的一种或多种，这些抗肿瘤药物的理化性质和药理活性相似，都可应用于本发明。本发明的肿瘤耐药逆转剂为槲皮素或其药学上可接受的盐或酯。优选本发明脂质体中的活性成分由上述两类物质组成，优选阿霉素和槲皮素或它们药学上可接受的盐，具体可使用阿霉素和槲皮素。本发明的脂质体含有上述活性成分、磷脂和胆固醇，磷脂和胆固醇的用量以能够形成脂质体为目标根据需要进行调整，优选磷脂和肿瘤耐药逆转剂的摩尔比为5 40 1， 磷脂和肿瘤药物的摩尔比为5 0.5 5。优选磷脂和肿瘤耐药逆转剂的摩尔比为10 30 1，磷脂和肿瘤药物的摩尔比为5 1 3。最优选所述磷脂和肿瘤耐药逆转剂的摩尔比为20 1，磷脂和肿瘤药物的摩尔比为5 1。磷脂和胆固醇的摩尔比为1 5 1;优选摩尔比为2 4 1;最优选摩尔比为3 1。本发明所采用的磷脂可采用本领域中制备脂质体的常规磷脂，磷脂选自一种或多种大豆磷脂(SPC)，二月桂酰卵磷脂(DLPC)，二肉豆蔻酰卵磷脂(DMPC)，二棕榈酰卵磷脂 (DPPC)，二硬脂酰卵磷脂(DSPC)，1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂(MPPC)，1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂(PMPC)，1-棕榈酰-2-硬脂酰卵磷脂(PSPC)，1-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂(SPPC)，蛋黄卵磷脂(EPC)，氢化蛋卵黄磷脂(HEPC)，大豆磷脂(SPC)，氢化大豆磷脂 (HSPC)，二油酰基卵磷脂(DOPC)，二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)，二棕榈脂酰甘油(DPPG)，二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)，二棕榈酰磷脂酸(DPPA)，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)，二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸(DPPS)，脑磷脂酰丝氨酸(PS)，脑神经鞘磷脂(BSP)，二棕榈酰神经鞘磷脂(DPSP)，二硬脂酰神经鞘磷脂(DSSP)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。优选采用氢化大豆磷脂。本发明还进一步提供了长循环脂质体，通过使脂质体中进一步含有被PEG修饰的磷脂或胆固醇达到长循环的效果。本发明选用的PEG修饰的磷脂或胆固醇中PEG的分子量为 200-5000，优选 1000-4000，更优选 2000-3000，最优选为 2000。本发明优选使用被PEG修饰的磷脂，特别是PEG修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (DSPE)制备长循环脂质体。通过实验摸索，确定最适合本发明的磷脂和PEG修饰的磷脂的摩尔比为12 4 1;优选摩尔比为10 6 1;最优选摩尔比为8 1。在此条件下，脂质体既能保证具有长效的效果，且制备的脂质体活性药物包封率较高。本发明具体提供的脂质体含有阿霉素、槲皮素、胆固醇、氢化大豆磷脂和PEG2000 修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)。本发明进一步具体提供的脂质体是含有以下摩尔比的成分的脂质体
5成分
氢化大豆磷脂胆固醇
PEG2000修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
摩尔比 120 40 15 6
24
阿霉素槲皮素本发明还提供了制备上述脂质体的方法，所述方法包括以下步骤采用薄膜分散法制备肿瘤耐药逆转剂脂质体；用挤压过聚碳酸酯膜或高压均质、超声等方法将脂质体的粒径控制在200nm以内；然后采用硫酸铵梯度法或PH梯度法包载抗肿瘤药物，优选采用硫酸铵梯度法，特别优选使用透析方式形成硫酸胺梯度。在进行硫酸铵梯度法时，实验证明适当控制孵育温度将有利于脂质体中抗肿瘤药物的包载，孵育温度优选控制在45-75°C ；更优选50-65°C ；最优选55°C。本发明还提供了一种含有本发明脂质体的药物组合物，本发明的药物组合物适合制备成注射制剂，通过静脉注射的方式给药实现对耐药肿瘤的靶向治疗。本发明中所称的“磷脂”或“胆固醇”系指未连接PEG基团的磷脂和胆固醇。本发明所称的“PEG修饰的磷脂”或“PEG修饰的胆固醇”系指具有PEG基团的修饰后的磷脂或胆固醇。多酚类化合物槲皮素(Quercetin)对多种恶性肿瘤细胞，如多种白血病细胞、人卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、前列腺癌细胞、多种胃癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、骨髓瘤细胞、鼻咽癌细胞、神经胶质瘤细胞、乳腺癌细胞、Hela细胞、Ehrlich腹水癌细胞和NK/LY实体瘤细胞等均具有抑制其增殖的作用，同时还能够通过多种机制强力逆转肿瘤MDR，具有良好的临床应用前景。但在临床使用时，要发挥槲皮素抑制肿瘤细胞增殖和逆转肿瘤MDR的作用需要使其在肿瘤部位达到有效浓度。特别是在与抗肿瘤药物联合应用时，如何使槲皮素与抗肿瘤药物同时在肿瘤部位达到有效治疗浓度，发挥协同作用，就成为问题的关键。通过常规给药途径，由于二者体内药代动力学性质上的差异，通常难以实现上述目标；此外， 由于槲皮素可直接抑制P-gp的表达，并且对细胞色素P4503A(CYP3A)同工酶的活性具有抑制作用。通过常规给药途径与抗肿瘤药物合用时，伴随正常细胞的P-gp功能抑制和CYP3A 活性降低，会导致合用药物的清除率发生改变，从而提高抗肿瘤药物的血药浓度，延长体内半衰期，增加在人体各器官的累积，增大毒副作用。为克服上述难题，如何提高槲皮素与抗肿瘤药物联合给药的靶向性，降低其在正常组织中的药物浓度，就成为要考虑和解决的关键问题。脂质体由磷脂和胆固醇组成，具有类似细胞膜的双分子层结构，可以包封水溶性药物和脂溶性药物。经亲水性聚乙二醇(PEG)修饰的长循环脂质体能够逃避血浆中调理素的调理，避免被巨噬细胞摄取，从而显著延长药物在循环系统内的滞留时间，提高药物的血药浓度，通过在肿瘤新生血管部位的渗透滞留增强效应(EPR)增加被包载药物在肿瘤组织内的分布，增强抗肿瘤药物的治疗指数，是抗肿瘤药物靶向治疗的优良载体。经研究发现采用长循环脂质体为载体同时包载肿瘤MDR逆转剂与抗肿瘤药物，通过靶向效应将两种药物同时靶向于肿瘤部位，能够有效避免两种药物在体内药代动力学性质上的差异和相互作用导致的抗肿瘤药物体内药代动力学性质的改变和毒副作用的增强，有利于提高对耐药肿瘤的治疗效果。但多种药物与阿霉素类抗肿瘤药物联用制备成脂质体后，实际效果不佳。通过研究，意外发现槲皮素和阿霉素联用制备成脂质体，特别是长循环脂质体对耐用肿瘤具有显著地治疗效果。本发明的优点本发明的组合物用长循环脂质体为载体，联合包载多靶点高效肿瘤MDR逆转剂槲皮素与抗肿瘤药物，通过肿瘤新生血管部位的渗透滞留增强效应(EPR)靶向于肿瘤组织， 可以显著提高抗肿瘤药物对耐药肿瘤的治疗效果。本发明的脂质体中脂溶性的多靶点高效肿瘤MDR逆转剂槲皮素以分子状态分散在脂质体的脂质双分子层中，进入肿瘤组织后能够通过与细胞膜之间的吸附、脂交换、膜融合和细胞内吞等作用较快释放；而阿霉素等蒽环类抗肿瘤药物由于在脂质体中产生不溶性沉淀而缓慢释放。先释放的槲皮素逆转肿瘤细胞的耐药性和P-gp介导的药物外排作用，提高阿霉素等蒽环类抗肿瘤药物在肿瘤细胞内的浓度，增强其对肿瘤细胞的细胞毒作用，因此特别有利于高效的杀伤耐药肿瘤细胞。本发明的药物组合物制备方法简单，技术可行，有利于产业化。
具体实施例方式通过以下实施例进一步说明本发明，但不作为本发明的限制。实施例1 不同肿瘤耐药逆转剂-阿霉素联合包载脂质体的血浆渗漏率比较称取处方量的HSPC、CHOL、DSPE-PEG2000、槲皮素或姜黄素 (HSPC CHOL DSPE-PEG2000 槲皮素或姜黄素=120 40 15 6mol/mol)置梨形瓶中，加无水乙醇溶解。40°C减压旋转蒸发形成均勻的薄膜。加入0. 15mol/L硫酸铵溶液， 75°C水浴常压水化30min，使磷脂充分溶胀水合。所得混悬液经探头超声(600W) 9min，再依次经0. 8 μ m、0. 4 μ m和0. 2 μ m核迹聚碳酸酯膜挤出各5次整粒。所得脂质体置于透析袋 (分子量8000-14000M)中，用生理盐水透析10h，形成硫酸铵梯度；再与处方量的阿霉素溶液 1 1 (ν/ν)混合(HSPC DOX = 5 lmol/mol)，55°C水浴孵育 25min，即得本品。所得槲皮素-阿霉素复方长循环脂质体平均粒径为118nm,姜黄素-阿霉素复方长循环脂质平均粒径为U9nm。称取处方量的HSPC、CHOL、DSPE-PEG2000 (HSPC CHOL DSPE-PEG2000 = 120 40 15m0l/m0l)置梨形瓶中，加无水乙醇溶解。40°C减压旋转蒸发形成均勻的薄膜。加入0. 15mol/L硫酸铵溶液，75°C水浴常压水化30min，使磷脂充分溶胀水合。所得混悬液经探头超声(600W) 9min,再依次经0. 8 μ m、0. 4 μ m和0. 2 μ m核迹聚碳酸酯膜挤出各5 次整粒。所得脂质体置于透析袋(分子量8000-14000M)中，用生理盐水透析10h，形成硫酸铵梯度；再与处方量的阿霉素和维拉帕米或粉防己碱溶液1 1 (v/v)混合(HSPC DOX =5 lmol/mol, HSPC 维拉帕米或粉防己碱=5 lmol/mol)，55°C水浴孵育25min，即得本品。所得维拉帕米-阿霉素复方长循环脂质体平均粒径为103nm，粉防己碱-阿霉素复方长循环脂质平均粒径为117nm。脂质体的血浆渗漏率测定方法取上述脂质体与空白血浆于37°C孵育，分别于不同时间点取样，经超速离心G°C，200，000g)后取上清液测定药物含量，与脂质体中药物的初始含量比较，计算渗漏率，结果见表1。表1脂质体的血浆渗漏率测定结果
权利要求
1.一种抗肿瘤的脂质体，其特征在于所述脂质体的活性成分含有至少一种抗肿瘤药物以及至少一种肿瘤耐药逆转剂，其中所述抗肿瘤药物选自阿霉素、表阿霉素、柔红霉素或其药学上可接受的盐或酯中的一种或多种，所述肿瘤耐药逆转剂为槲皮素或其药学上可接受的盐或酯；优选所述活性成分由上述两类物质组成，最优选所述活性物质是阿霉素和槲皮素或它们药学上可接受的盐，具体采用阿霉素和槲皮素。
2.根据权利要求1所述的脂质体，其特征在于所述脂质体含有活性成分、磷脂和胆固醇，优选所述磷脂和肿瘤耐药逆转剂的摩尔比为5 40 1，磷脂和肿瘤药物的摩尔比为 5 0.5 5;更优选所述磷脂和肿瘤耐药逆转剂的摩尔比为10 30 1，磷脂和肿瘤药物的摩尔比为5 1 3;最优选所述磷脂和肿瘤耐药逆转剂的摩尔比为20 1，磷脂和肿瘤药物的摩尔比为5 1。
3.根据权利要求2所述的脂质体，其特征在于所述磷脂和胆固醇的摩尔比为1 5 1 ；优选摩尔比为2 4 1 ；最优选摩尔比为3:1。
4.根据权利要求2或3所述的脂质体，其特征在于所述磷脂选自一种或多种大豆磷脂(SPC)，二月桂酰卵磷脂(DLPC)，二肉豆蔻酰卵磷脂(DMPC)，二棕榈酰卵磷脂(DPPC)，二硬脂酰卵磷脂(DSPC)，1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂(MPPC)，1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂(PMPC)，1-棕榈酰-2-硬脂酰卵磷脂(PSPC)，1-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂(SPPC)，蛋黄卵磷脂(EPC)，氢化蛋黄卵磷脂(HEPC)，大豆磷脂(SPC)，氢化大豆磷脂(HSPC)，二油酰基卵磷脂(DOPC)，二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)，二棕榈脂酰甘油(DPPG)，二硬脂酰磷脂酰甘油 (DSPG)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)，二棕榈酰磷脂酸(DPPA)，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸 (DMPS)，二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸(DPPS)，脑磷脂酰丝氨酸(PS)，脑神经鞘磷脂(BSP)，二棕榈酰神经鞘磷脂(DPSP)，二硬脂酰神经鞘磷脂(DSSP)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)； 优选氢化大豆磷脂。
5.根据权利要求2-4所述的脂质体，其特征在于所述脂质体还含有被PEG修饰的磷脂或胆固醇；优选含有被PEG修饰的磷脂；更优选含有PEG修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (DSPE)。
6.根据权利要求5所述的脂质体，其特征在于所述PEG的分子量为200-5000，优选 1000-4000，更优选 2000-3000，最优选为 2000。
7.根据权利要求5或6所述的脂质体，其特征在于所述磷脂和PEG修饰的磷脂的摩尔比为12 4 1;优选摩尔比为10 6 1;最优选摩尔比为8 1。
8.根据权利要求1所述的脂质体，其特征在于所述脂质体含有阿霉素、槲皮素、胆固醇、氢化大豆磷脂和PEG2000修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；优选脂质体含有以下摩尔比的成分成分摩尔比氢化大豆磷脂120胆固醇40PEG2000修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺15 °阿霉素6槲皮素24
9.权利要求1-9任意一项所述脂质体的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤采用薄膜分散法制备肿瘤耐药逆转剂脂质体，用挤压过聚碳酸酯膜或高压均质、超声等方法将脂质体的粒径控制在200nm以内，然后采用硫酸铵梯度法或pH梯度法包载抗肿瘤药物；优选采用硫酸铵梯度法，更优选所述硫酸铵梯度法使用透析方式形成硫酸胺梯度；硫酸铵梯度法中孵育温度优选控制在45-75°C ；更优选50-65°C ；最优选55°C。
10.一种药物组合物，所述组合物含有权利要求1-8任意一项所述脂质体，优选所述组合物是一种注射剂。
全文摘要
本发明涉及一种抗肿瘤耐药的脂质体及其制备方法，特别涉及抗肿瘤多药耐药长循环靶向脂质体。其特征在于将槲皮素与抗肿瘤药物联合包载于脂质体中，同时靶向于肿瘤组织，逆转肿瘤多药耐药，增强抗肿瘤药物对耐药肿瘤的细胞毒作用，避免不同药物在体内药代动力学性质上的差异和相互作用导致的抗肿瘤药物体内药代动力学性质的改变和毒副作用增强，提高对耐药肿瘤的治疗效果。
文档编号A61P35/00GK102357074SQ20111034903
公开日2012年2月22日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者孙毅坤, 戴俊东, 王玉蓉, 王英姿, 陈浩 申请人:北京中医药大学