ADP受体p2y12在血管生成中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及ADP受体p2y12在血管生成中的应用。具体地，ADP的受体p2y12特异地表达于血管内皮细胞，用p2y12特异的抑制剂抑制p2y12的表达，体节间血管出现生长缺陷；p2y12的配体ADP也同样参与血管新生，利用高选择性拮抗剂阻断ADP对p2y12的激活，出现与上述相同的异常；并且ADP-p2y12信号通过调控尖端细胞行为，即迁移和增殖参与血管新生过程；反之，过表达p2y12可以促进尖端细胞命运的获得，表现为出现过度迁移的内皮细胞及参与体节间血管形成的内皮细胞数目显著增加；此外，ADP-p2y12信号通过抑制notch通路，从而起到调节体内血管新生的作用。本发明为干预血管新生相关疾病提供了新的靶点。
【专利说明】ADP受体p2y12在血管生成中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于发育生物学和生物医学领域，具体地，ADP受体p2yl2在血管生成中的应用。
【背景技术】[0002]血管新生是指在原有毛细血管网的基础上，通过血管内皮细胞增殖、迁移进而形成新生血管的过程。血管新生在体内胚胎发育、损伤修复等生理过程中发挥重要作用，同时也是众多新生血管性疾病，如肿瘤生长与转移、增殖性糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、类风湿关节炎等疾病的主要病理变化。因此新生血管抑制剂的研究与应用对于一些难治性新生血管相关疾病具有重要意义。
[0003]在血管新生的过程中，不同的血管内皮细胞有不同的等级，也具有不同的细胞命运，因此内皮细胞之间表现出非常不同的细胞行为。
[0004]依细胞学行为的不同，可以将血管内皮细胞分为血管内皮尖端细胞和血管内皮柄细胞。目前已知血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, vegf)与notch信号通路的相互作用在细胞命运决定中发挥重要作用。在血管内皮尖端细胞表达的notch配体dll4可以激活其临近内皮细胞上的notch受体以抑制vegfr3的表达,使其不能获得尖端细胞的命运。尽管如此，何种信号通路控制了尖端细胞dll4的表达水平尚不明确。
[0005]本领域目前对于血管新生中信号调节的路径和其中各个因子的作用还不了解，因此迫切需要进行此方面的研究。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是提供ADP受体p2yl2在血管生成中的应用。
[0007]在本发明的第一方面，提供了一种p2yl2蛋白的抑制剂、或p2yl2基因的抑制剂的用途，它们被用于制备预防或治疗肿瘤的药物组合物；和/或用于制备抑制血管生成的药物组合物。
[0008]在另一优选例中，所述的p2yl2蛋白是ADP的受体蛋白。
[0009]在另一优选例中，所述的p2yl2蛋白选自下组:
[0010]⑷氨基酸序列如SEQ ID N0.:1所示的多肽；
[0011](B)将SEQ ID N0.:1所示的氨基酸序列经过一个或几个(通常为1_60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的p2yl2蛋白衍生物，或其活性片段；
[0012](C)序列与SEQ ID N0.:1所示的氨基酸序列相比，同源性≥90%，较佳地≥95%，更佳地> 98%，最佳地> 99%的p2yl2蛋白衍生物，或其活性片段。
[0013]在另一优选例中，所述的p2yl2基因编码p2yl2蛋白。
[0014]在另一优选例中，所述的p2yl2基因为编码如SEQ ID N0.:1所示p2yl2蛋白的多核苷酸序列。[0015]在另一优选例中，所述的p2yl2基因为如SEQ ID N0.:2所示的多核苷酸序列。
[0016]在另一优选例中，所述的p2yl2蛋白(氨基酸序列如SEQ ID N0.:1所示)或p2yl2基因(核苷酸序列如SEQ ID N0.:2所示)来源于人。
[0017]在另一优选例中，所述的p2yl2蛋白为氨基酸序列如SEQ ID N0.: 3所示的多肽。
[0018]在另一优选例中，所述的氨基酸序列如SEQ ID N0.: 3所示的p2yl2蛋白来源于斑马鱼。
[0019]在另一优选例中，所述p2yl2蛋白的抑制剂选自下组:p2yl2蛋白的抗体、p2yl2蛋白的结合蛋白、p2yl2蛋白拮抗剂、或其组合。
[0020]在另一优选例中，所述的p2yl2蛋白拮抗剂选自下组:MRS2395、clopidogrel (氯批格雷)、ticagrelor (替格瑞洛)、或其组合。
[0021]在另一优选例中，所述p2yl2基因的抑制剂为:P2yl2基因特异性的RNA1、p2yl2基因特异性的micr0RNA、p2yl2基因特异性的寡核苷酸或其衍生物、抑制p2yl2基因启动子的抑制剂、或其组合。
[0022]在另一优选例中，所述的p2yl2基因的抑制剂为吗啉基寡核苷酸(morpholino)。
[0023]在另一优选例中，所述的吗啉基寡核苷酸的结构如SEQ ID N0.:4所示。
[0024]在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组:乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、胃癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、宫颈癌、或其组合。
[0025]在另一优选例中 ，所述的肿瘤选自下组:乳腺癌、肺癌、结直肠癌、或其组合。
[0026]在本发明的第二方面，提供了一种p2yl2蛋白或p2yl2基因的激动剂或促进剂的用途，它们被用于制备促进血管生成的药物组合物。
[0027]在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量的活性成分，其中所述的活性成分为:P2yl2蛋白和/或p2yl2基因的抑制剂，或p2yl2蛋白或p2yl2基因的激动剂或促进剂。
[0028]在另一优选例中，活性成分为p2yl2蛋白和/或p2yl2基因的抑制剂的药物组合物用于预防或治疗肿瘤；和/或用于抑制血管生成。
[0029]在另一优选例中，活性成分为p2yl2蛋白或p2yl2基因的激动剂或促进剂的药物组合物用于促进血管生成。
[0030]在另一优选例中，所述p2yl2蛋白的抑制剂选自下组:p2yl2蛋白的抗体、p2yl2蛋白的结合蛋白、p2yl2蛋白拮抗剂、或其组合。
[0031]在另一优选例中，所述的p2yl2蛋白拮抗剂选自下组:MRS2395、clopidogrel (氯批格雷)、ticagrelor (替格瑞洛)、或其组合。
[0032]在另一优选例中，所述p2yl2基因的抑制剂为:P2yl2基因特异性的RNA1、p2yl2基因特异性的micr0RNA、p2yl2基因特异性的寡核苷酸或其衍生物、抑制p2yl2基因启动子的抑制剂、或其组合。
[0033]在另一优选例中，所述的p2yl2基因的抑制剂为吗啉基寡核苷酸(morpholino)。
[0034]在本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性调节血管生成的方法，包括步骤:
[0035](I)在p2yl2蛋白和/或p2yl2基因的抑制剂存在的条件下，培养细胞或组织，从而抑制血管生成；或[0036](2)在p2yl2蛋白和/或p2yl2基因的激动剂或促进剂存在的条件下，培养细胞或组织，从而促进血管生成。
[0037]在另一优选例中，与对照的细胞或组织相比，加入p2yl2蛋白和/或p2yl2基因的抑制剂的细胞或组织，血管生成降低10%以上，较佳地降低20%以上，更佳地降低30%以上，更佳地降低40%以上，更佳地降低50%以上，更佳地降低60%以上，更佳地降低70%以上，更佳地降低80%以上，更佳地降低90%以上，最佳地完全没有血管生成。
[0038]在另一优选例中，与对照的细胞或组织相比，加入p2y 12蛋白抑制剂的细胞或组织，p2yl2蛋白的活性或表达降低10%以上，较佳地降低20%以上，更佳地降低30%以上，更佳地降低40%以上，更佳地降低50%以上，更佳地降低60%以上，更佳地降低70%以上，更佳地降低80%以上，更佳地降低90%以上，最佳地完全没有p2yl2蛋白的活性或表达。
[0039]在另一优选例中，与对照的细胞或组织相比，加入p2y 12基因抑制剂的细胞或组织p2yl2基因的表达降低10%以上，较佳地降低20%以上，更佳地降低30%以上，更佳地降低40%以上，更佳地降低50%以上，更佳地降低60%以上，更佳地降低70%以上，更佳地降低80%以上，更佳地降低90%以上，最佳地完全没有p2yl2基因的表达。
[0040]在另一优选例中，与对照的细胞或组织相比，加入p2yl2蛋白和/或p2yl2基因的激动剂或促进剂的细胞或组织，血管生成提高10%以上，较佳地提高20%以上，更佳地提高30%以上，更佳地提高40%以上，更佳地提高50%以上。
[0041 ] 在另一优选例中，与对照的细胞或组织相比，加入p2y 12蛋白激动剂或促进剂的细胞或组织，p2yl2蛋白的活性或表达提高10%以上，较佳地提高20%以上，更佳地提高30%以上，更佳地提高40%以上，更佳地提高50%以上。
[0042]在另一优选例中，与对照的细胞或组织相比，加入P2yl2基因激动剂或促进剂的细胞或组织p2yl2基因的表达`提高10%以上，较佳地提高20%以上，更佳地提高30%以上，更佳地提高40%以上，更佳地提高50%以上。
[0043]在本发明的第五方面，提供了一种筛选用于制备调节血管生成的潜在物质的方法，包括步骤:
[0044](I)分别向检测体系中加入待检测的物质或阴性对照物，并且所述的阴性对照物对血管新生没有调节作用；和
[0045](2)分别检测加入了待检测的物质的样本和加入了阴性对照物的样本中P2yl2蛋白的表达水平或活性、和/或P2yl2基因的表达水平；如果与加入了阴性对照物的样本相t匕，加入了待检测的物质的样本的p2yl2蛋白的表达水平或活性、和/或p2yl2基因的表达水平发生显著变化，则是潜在的用于制备调节血管生成的物质。
[0046]在另一优选例中，所述的检测体系为人血管内皮细胞体系。
[0047]在另一优选例中，所述调节血管生成的潜在物质为抑制或促进血管生成的物质。
[0048]在另一优选例中，如果与加入了阴性对照物的样本相比，加入了待检测的物质的样本的p2yl2蛋白的表达水平或活性、和/或p2yl2基因的表达水平下降10%以上，较佳地下降20%以上，更佳地下降30%以上，更佳地下降40%以上，更佳地下降50%以上，则是潜在的抑制血管生成的物质。
[0049]在另一优选例中，如果与加入了阴性对照物的样本相比，加入了待检测的物质的样本的p2yl2蛋白的表达水平或活性、和/或p2yl2基因的表达水平提高20%以上，更佳地提高30%以上，更佳地提高40%以上，更佳地提高50%以上，则是潜在的促进血管生成的物质。
[0050]在另一优选例中，所述方法还包括步骤(3):用步骤(2)筛选的潜在的抑制血管生成的物质，处理肿瘤细胞或组织，如果与对照的肿瘤细胞或组织相比，肿瘤细胞或组织的生长或血管新生受到抑制(抑制程度大于10%，更佳地大于20%，更佳地大于30%，更佳地大于40%，更佳地大于50%)，则是潜在的抑制肿瘤的物质。
[0051]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0052]下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
[0053]图1显示ADP受体p2yl具有高度的种间保守性；图1A显示将斑马鱼p2yl2蛋白的氨基酸序列与人类和小鼠的同源基因蛋白序列进行比对结果，有45.326%(160个)相同的氨基酸，有66.86%(230个)相似的氨基酸，表现出很高的保守性，图中*表示在人，小鼠，斑马鱼该位点的氨基酸种类完全相同，.:表示人，小鼠，斑马鱼该位点的氨基酸种类不完全相同，但相似；图1B为p2yl2和它在人和小鼠上同源基因的同源树。
[0054]图2为ADP受体p2yl2在组织中的表达情况；图2A显示，p2yl2广泛表达于血管组织；图2B显示，头部血管表达p2yl2 ；图2C显示，胚胎背侧血管表达p2yl2 ；图2D显示，躯干血管表达P2yl2 ;图2E (冰冻切片胚胎断面)，显示p2y12表达于血管壁内侧，提示其表达于血管内皮细胞。
`[0055]图3显示针对p2yl2的morpholino (MO)能够有效地抑制胚胎p2yl2的表达:图3A-图3C，control MO不抑制p2yl2荧光报告基因的表达；图3D-图3F，p2yl2M0完全抑制了 p2yl2荧光报告基因的表达，红色荧光蛋白用作注射的内参。
[0056]图4显示p2yl2对血管发育是必要的；图4A-图4B，受精后24小时，p2yl2敲低的胚胎节间血管的发育与对照相比无明显异常；图4C-图4D，受精后30小时，p2yl2敲低的胚胎节间血管的发育与对照相比出现明显缺陷；图4E-图4F显示，P2yl2M0注射的胚胎，与对照相比，其长度明显变短。
[0057]图5显示ADP_p2yl2信号对血管发育是必要的；图5A-图5B显示，受精后24小时，阻断ADP激活p2yl2的胚胎节间血管的发育与对照相比无明显异常；图5C-图5D，受精后30小时，阻断ADP激活p2yl2的胚胎节间血管的发育与对照相比出现明显缺陷。
[0058]图6显示，ADP-p2yl2信号对内皮尖端细胞的迁移和增殖是必需的；图6A，连续共聚焦拍摄注射control MO的胚胎；图6B,连续共聚焦拍摄注射p2yl2M0的胚胎，p2yl2M0注射的胚胎，尖端细胞的迁移和增殖均出现明显异常。
[0059]图7显示ADP_p2yl2信号对内皮尖端细胞命运的获得是充分的；图7A-图7B显示，在内皮细胞过表达P2yl2的胚胎，受精后27小时，节间血管末端出现了过度分支，以及过度迁移的内皮细胞；图7C-图7D，在受精后30小时，在内皮细胞过表达p2yl2的胚胎，节间血管的内皮细胞数目明显增加，且出现了血管网络外的内皮细胞。[0060]图8显示ADP_p2yl2信号和notch信号之间的相互作用，图8A，用原位杂交检测到，注射p2yl2M0的胚胎，dll4和fltl的表达较对未注射的对照组高；图8B，用MRS2395特异阻断ADP对p2yl2的激活，检测到dll4和fltl表达的上调；图8C，定量PCR也显示相同的结果。
[0061]图 9 显示，分别用 control MO(A)、p2yl2M0(B)、dll4M0(C)以及 p2yl2M0 和 dll4M0的混合(D)注射胚胎，dll4的MO与p2yl2的MO混合注射，可以拯救节间血管的内皮细胞数目。
【具体实施方式】
[0062]本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外发现，进化上高度保守的ADP信号通路特别是ADP的受体p2y 12在血管新生过程中起着重要的靶点和调控作用，具体地，ADP的受体p2yl2特异地表达于血管内皮细胞，用p2yl2特异的拮抗剂抑制p2yl2的表达，体节间血管出现生长缺陷；P2yl2的配体ADP也同样参与血管新生，利用高选择性拮抗剂阻断ADP对p2yl2的激活，出现与上述相同的异常；并且ADP_p2yl2信号通过调控尖端细胞行为，即迁移和增殖参与血管新生过程；反之，过表达P2yl2可以促进尖端细胞命运的获得，表现为出现过度迁移的内皮细胞及参与体节间血管形成的内皮细胞数目显著增加；此外，ADP-p2yl2信号通过抑制notch通路，从而起到调节体内血管新生的作用。本发明为干预血管新生相关疾病提供了新的靶点。在此基础上完成了本发明。
[0063]p2yl2 蛋白、p2yl2 基因
[0064]p2yl2蛋白是ADP的特异受体之一。
[0065]如本文所用，术语“p2y 12蛋白”、“p2yl2多肽”、“ADP受体p2yl2”可以互换使用。本领域的普通技术人员可使用常规方法获得P2yl2蛋白的序列，如从NCBI获取。
[0066]如本文所用，术语“p2yl2基因”、“p2yl2编码基因”、“p2yl2蛋白的编码序列”可以互换使用，都是指编码P2yl2蛋白的多核苷酸序列。本领域的普通技术人员可使用常规方法获得p2yl2基因的序列，如从NCBI获取。
[0067]本发明的p2yl2蛋白可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。本发明的p2yl2蛋白可以是天然纯化的产物或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主中产生。
[0068]根据重组生产方案所用的宿主，本发明的p2yl2蛋白可以是糖基化的或非糖基化的。本发明的P2yl2蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括具有p2yl2蛋白或p2yl2蛋白活性的p2yl2蛋白多肽片段和类似物。
[0069]如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持天然p2yl2蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是:(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0070]本发明还包括与本发明的天然p2y 12蛋白具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。在蛋白质变体可以经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明包括天然P2yl2蛋白类似物与天然p2yl2蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性蛋白。
[0071]修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。
[0072]在本发明的一个优选例中，p2y 12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.:1所示(来源于人)，或如SEQ ID N0.: 3所示(来源于斑马鱼)。
[0073]本发明还提供了编码p2yl2蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括:DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。编码成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷`酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
[0074]在本发明优选例中，编码人p2yl2蛋白的DNA序列编码SEQ ID N0.:2所示的p2yl2蛋白。
[0075]根据本文所述的核苷酸序列，本【技术领域】人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于:PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。
[0076]p2yl2蛋白的抑制剂
[0077]如本文所用，术语“p2yl2蛋白的抑制剂”是指抑制p2yl2蛋白活性的物质。p2yl2蛋白的抑制剂选自下组:p2yl2蛋白的抗体、p2yl2蛋白的结合蛋白、p2yl2蛋白的拮抗剂、或其组合，优选地，所述p2yl2蛋白的抑制剂可以竞争性地和p2yl2结合，阻断ADP对p2yl2的激活。p2yl2蛋白拮抗剂优选:MRS2395、clopidogrel (氯吡格雷)、ticagrelor (替格瑞洛)。
[0078]p2yl2基因的抑制剂
[0079]如本文所用，术语“P2y 12基因的抑制剂”是指抑制p2yl2基因复制或转录的物质，或减少p2yl2基因表达(表达产物如mRNA等)的物质，p2yl2基因的抑制剂包括(但不限于):RNA1、micr0RNA、p2yl2基因特异性的寡核苷酸或其衍生物、抑制p2yl2基因启动子的抑制剂、抑制P2yl2基因的抑制剂、或其组合。
[0080]优选地，所述的p2yl2基因的抑制剂为吗啉基寡核苷酸(morpholineo);所述针对p2yl2 基因的 morpholino 序列如 SEQ ID N0.:4 所不。
[0081]药物组合物
[0082]本发明提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量的以下活性成分:P2yl2蛋白的抑制剂或p2y 12基因的抑制剂，或p2y 12蛋白或p2yl2基因的激动剂或促进剂。
[0083]活性成分为p2yl2蛋白和/或p2yl2基因的抑制剂的药物组合物用于预防或治疗肿瘤；和/或用于抑制血管生成；活性成分为P2yl2蛋白或p2yl2基因的激动剂或促进剂的药物组合物用于促进血管生成。
[0084]如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
[0085]如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变 态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
[0086]本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
[0087]本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的
0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予,能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
[0088]本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于):水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
[0089]应用
[0090]本发明提供了一种体 外非治疗性调节血管生成的方法，包括步骤:在p2yl2蛋白和/或p2yl2基因的抑制剂存在的条件下，培养细胞或组织，从而抑制血管生成；或在p2yl2蛋白和/或p2yl2基因的激动剂或促进剂存在的条件下，培养细胞或组织，从而促进血管生成。
[0091]优选地，与对照的细胞或组织相比，加入p2y 12蛋白和/或p2yl2基因的抑制剂的细胞或组织，血管生成降低10%以上，较佳地降低20%以上，更佳地降低30%以上，更佳地降低40%以上，更佳地降低50%以上，更佳地降低60%以上，更佳地降低70%以上，更佳地降低80%以上，更佳地降低90%以上，最佳地完全没有血管生成。
[0092]或优选地，与对照的细胞或组织相比，加入p2yl2蛋白抑制剂的细胞或组织，P2yl2蛋白的活性或表达降低10%以上，较佳地降低20%以上，更佳地降低30%以上，更佳地降低40%以上，更佳地降低50%以上，更佳地降低60%以上，更佳地降低70%以上，更佳地降低80%以上，更佳地降低90%以上，最佳地完全没有p2yl2蛋白的活性或表达。
[0093]或优选地，与对照的细胞或组织相比，加入p2yl2基因抑制剂的细胞或组织p2yl2基因的表达降低10%以上，较佳地降低20%以上，更佳地降低30%以上，更佳地降低40%以上，更佳地降低50%以上，更佳地降低60%以上，更佳地降低70%以上，更佳地降低80%以上，更佳地降低90%以上，最佳地完全没有p2yl2基因的表达。
[0094]或优选地，与对照的细胞或组织相比，加入p2yl2蛋白和/或p2yl2基因的激动剂或促进剂的细胞或组织，血管生成提高10%以上，较佳地提高20%以上，更佳地提高30%以上，更佳地提高40%以上，更佳地提高50%以上。
[0095]或优选地，与对照的细胞或组织相比，加入p2yl2蛋白激动剂或促进剂的细胞或组织，p2yl2蛋白的活性或表达提高10%以上，较佳地提高20%以上，更佳地提高30%以上，更佳地提高40%以上，更佳地提高50%以上。
`[0096]或优选地，与对照的细胞或组织相比，加入P2yl2基因激动剂或促进剂的细胞或组织p2yl2基因的表达提高10%以上，较佳地提高20%以上，更佳地提高30%以上，更佳地提高40%以上，更佳地提高50%以上。
[0097]本发明还提供了一种筛选用于制备调节血管生成的潜在物质的方法，包括步骤:分别向检测体系中加入待检测的物质或阴性对照物，并且所述的阴性对照物对血管新生没有调节作用；和分别检测加入了待检测的物质的样本和加入了阴性对照物的样本中P2yl2蛋白的表达水平或活性、和/或P2yl2基因的表达水平；如果与加入了阴性对照物的样本相t匕，加入了待检测的物质的样本的p2yl2蛋白的表达水平或活性、和/或p2yl2基因的表达水平发生显著变化，则是潜在的用于制备调节血管生成的物质。
[0098]所述的检测体系优选为人血管内皮细胞体系。
[0099]所述调节血管生成的潜在物质为抑制或促进血管生成的物质。
[0100]优选地，如果与加入了阴性对照物的样本相比，加入了待检测的物质的样本的p2y 12蛋白的表达水平或活性、和/或p2yl2基因的表达水平下降10%以上，较佳地下降20%以上，更佳地下降30%以上，更佳地下降40%以上，更佳地下降50%以上，则是潜在的抑制血管生成的物质。
[0101]或优选地，如果与加入了阴性对照物的样本相比，加入了待检测的物质的样本的p2y 12蛋白的表达水平或活性、和/或p2yl2基因的表达水平提高20%以上，更佳地提高30%以上，更佳地提高40%以上，更佳地提高50%以上，则是潜在的促进血管生成的物质。[0102]或优选地，所述方法还包括步骤(3):用步骤⑵筛选的潜在的抑制血管生成的物质，处理肿瘤细胞或组织，如果与对照的肿瘤细胞或组织相比，肿瘤细胞或组织的生长或血管新生受到抑制(抑制程度大于10%，更佳地大于20%，更佳地大于30%，更佳地大于40%，更佳地大于50%)，则是潜在的抑制肿瘤的物质。
[0103]本发明的主要优点在于:
[0104](I)ADP的受体P2yl2特异地表达于血管内皮细胞，且具有很强的物种间保守型；
[0105](2)抑制p2yl2的表达，出现体节间血管生长的缺陷；p2yl2的配体ADP也同样有此表现；
[0106](3)ADP-p2yl2信号通过调控尖端细胞行为，即迁移和增殖参与血管新生过程；过表达p2yl2可以促进尖端细胞命运的获得，表现为出现过度迁移的内皮细胞及参与体节间血管形成的内皮细胞数目显著增加；
[0107](4) ADP_p2yl2信号通过抑制notch通路,从而起到调节体内血管新生的作用；
[0108](5)本发明为干预血管新生相关疾病提供了新的靶点。
[0109]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册(New York: ColdSpring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0110]实验材料和通用方法
[0111]1.实验细胞和动物`
[0112]斑马鱼(野生型上海系(shanghai),为野生型上海系，Tg (kdrl: egfp),Tg(flil:negfp)，饲养于上海健康科学研究所斑马鱼平台。养殖条件:温度:28±1°C ；pH值:6.5~7.5 ;电导率:400~500 μ s/cm。斑马鱼胚胎用胚胎培养液(egg water)置于28.5°C的恒温箱中进行培养；发育阶段中如果需要阻止胚胎色素形成(方便原位杂交或免疫染色实验的信号不受干扰)，可在胚胎培养液加入0.003%(w/v)2-苯硫脲(2-phenylthiourea, PTU) ;5天后，当幼鱼从卵膜里孵化出来时，将胚胎移到鱼缸中用系统水养殖，开始喂食草履虫，和磨成细粉的干食；出生后20天左右将小鱼移到系统中，并可以用虾子代替草履虫，和磨成细粉干食一起喂养，直至其成为成鱼。人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肺癌细胞A549、人结直肠癌细胞SW620购自中科院上海生科院细胞资源中心。BALB/c裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
[0113]2.斑马鱼胚胎TRIzol法抽提总RNA
[0114]参照Invitrogen公司TRIzol试剂使用说明，具体地:⑴用酒精棉球擦拭台面、离心机、移液器，将离心机预冷到4 °C。使用无RNA酶室温离心管和吸头，带口罩和新的手套操作；(2)收集各时相胚胎，每个时相约40个胚胎，加入200 μ ITRIzol，用塑料杵于
1.5ml eppendorf管反复研磨使胚胎充分裂解，用300 μ I冲洗塑料杵；每管加入100 μ I氯仿，漩涡仪剧烈震荡15秒，室温放置2-3分钟，12000g，4 ° C离心15分钟；(3)小心转移上清相至新的无RNA酶的离心管中，每管加入250 μ I异丙醇，充分混匀后，室温放置10分钟，12000g，4 。C离心15分钟，沉淀RNA ； (4)弃上清，每管加入500 μ I 75%乙醇，洗涤RNA沉淀，7500g，4 ° C离心5分钟，重复洗涤一次；(5)弃上清，瞬时离心，尽量吸净上清，打开管盖，室温干燥5分钟，加入DEPC H2O充分溶解。1%琼脂糖胶凝胶电泳确定总RNA抽提质量。即刻使用或置-80 ° C冰箱保存。
[0115]3.NanoDrop方法检测抽提RNA浓度
[0116](I)开启操作软件NanoDrop,点击检测模式Nucleic Acid Measurement ； (2)仪器初始化:将1.5 μ I超纯水加在检测座上，轻轻摁下检测臂，点击“0Κ” ； (3)用干净的吸水纸擦去检测座山的水滴，将1.5μ I溶解RNA的同批DEPC H2O加在检测座上，轻轻摁下检测臂，在操作界面右侧的下拉菜单中选择“RNA”模式，并将波长选定在260nm，点击“BLANK”，将仪器调零；再用干净的吸水纸擦去检测座上残留的水滴；(4)样本测定:将1.5 μ I待测样本加在检测座上，轻轻摁下检测臂，点击“Measure”，记录读数；(5)全部样本检测结束后清洗仪器检测座，关闭机器。
[0117]4.反转录 PCR
[0118]将TRIzoI抽提的斑马鱼胚胎总RNA经过琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性及NanoDrop定量后,参照Promega公司M-MLV RT使用说明，按表1的反应体系作反转录反应:
[0119]表1
[0120]
【权利要求】
1.一种p2yl2蛋白的抑制剂、或p2yl2基因的抑制剂的用途，其特征在于，它们被用于制备预防或治疗肿瘤的药物组合物；和/或用于制备抑制血管生成的药物组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述p2yl2蛋白的抑制剂选自下组:P2yl2蛋白的抗体、p2yl2蛋白的结合蛋白、p2yl2蛋白拮抗剂、或其组合。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述P2yl2基因的抑制剂为:P2yl2基因特异性的RNA1、p2yl2基因特异性的mici^RNA、p2yl2基因特异性的寡核苷酸或其衍生物、抑制p2yl2基因启动子的抑制剂、或其组合。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自下组:乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、胃癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、宫颈癌、或其组合。
5.一种P2yl2蛋白或p2yl2基因的激动剂或促进剂的用途，其特征在于，它们被用于制备促进血管生成的药物组合物。
6.一种药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体和有效量的活性成分，其中所述的活性成分为:P2yl2蛋白和/或p2yl2基因的抑制剂，或p2yl2蛋白或p2yl2基因的激动剂或促进剂。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述p2yl2蛋白的抑制剂选自下组:p2yl2蛋白的抗体、p2yl2蛋白的结合蛋白、p2yl2蛋白拮抗剂、或其组合。
8.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述p2yl2基因的抑制剂为:P2yl2基因特异性的RNA1、p2y l2基因特异性的micr0RNA、p2yl2基因特异性的寡核苷酸或其衍生物、抑制p2yl2基因启动子的抑制剂、或其组合。
9.一种体外非治疗性调节血管生成的方法，其特征在于，包括步骤: (1)在p2yl2蛋白和/或p2yl2基因的抑制剂存在的条件下，培养细胞或组织，从而抑制血管生成；或 (2)在p2yl2蛋白和/或p2yl2基因的激动剂或促进剂存在的条件下，培养细胞或组织，从而促进血管生成。
10.一种筛选用于制备调节血管生成的潜在物质的方法，其特征在于，包括步骤: (1)分别向检测体系中加入待检测的物质或阴性对照物，并且所述的阴性对照物对血管新生没有调节作用；和 (2)分别检测加入了待检测的物质的样本和加入了阴性对照物的样本中p2yl2蛋白的表达水平或活性、和/或P2yl2基因的表达水平；如果与加入了阴性对照物的样本相比，加入了待检测的物质的样本的P2yl2蛋白的表达水平或活性、和/或p2yl2基因的表达水平发生显著变化，则是潜在的用于制备调节血管生成的物质； 较佳地,所述的检测体系为人血管内皮细胞体系。
【文档编号】A61K48/00GK103816541SQ201210470552
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年11月19日 优先权日:2012年11月19日
【发明者】荆清, 李文庆, 李方方, 谌健 申请人:中国科学院上海生命科学研究院