粘蛋白-1抗原性多肽及其作为肿瘤疫苗的用途
【专利摘要】本发明提供了人类粘蛋白-1肿瘤抗原性多肽或其连续10个氨基酸的片段，其可结合HLA?I并被CD8+T细胞识别。本发明还提供了编码上述多肽的核酸。本发明还提供了可在细胞表面呈递上述多肽的抗原呈递细胞，以及可识别上述多肽或抗原呈递细胞的免疫效应细胞。本发明还提供了所述多肽或其变体，核酸，抗原呈递细胞或免疫效应细胞在用于制备治疗或预防癌症的疫苗或药物组合物中的用途。本发明提供的肿瘤疫苗在较大的人群中有良好的治疗效果，尤其是适合亚洲人种，例如中国人。
【专利说明】粘蛋白-1抗原性多肽及其作为肿瘤疫苗的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及肿瘤和免疫预付和治疗领域。具体的，本发明涉及人类粘蛋白-1肿瘤多肽衍生物和其作为肿瘤疫苗的用途。
【背景技术】
[0002]目前临床上对于癌症的治疗是以手术为主,化疗和放疗为辅,但治疗的特异性不足，常常对正常组织和器官造成损伤，并且手术治疗仍存在术后高度复发及易转移的问题。肿瘤疫苗的免疫治疗可以产生针对肿瘤的特异性反应，甚至能清除残余的肿瘤病灶，并产生免疫记忆。现已成为继手术、化疗和放疗之后的第四种肿瘤治疗方式，且与三大常规疗法有明显的互补性。
[0003]作为预防或治疗性疫苗，肿瘤疫苗是免疫治疗的一种方式。其中利用多肽制作疫苗是利用肿瘤特异性抗原及其它免疫调节细胞来治疗和预防肿瘤。抗肿瘤免疫反应过程中先由抗原递呈细胞(APC)肿瘤抗原处理递呈给T细胞而激发的。树突状细胞(DendriticCell，DC)是人体内功能最强的专职APC。应用负载肿瘤抗原的DC，能够激发体内肿瘤特异性T细胞，从而能有效杀伤肿瘤细胞，并且能够建立起持久的抗肿瘤特异性免疫应答。
[0004]人粘蛋白I (MUCl)是一种高度O-糖基化和含有连续重复肽序列为特征的高分子量糖蛋白，存在于多种上皮组织，具有多种功能。粘蛋白在癌组织中异常表达，表达量丰富。人粘蛋白I(MUCl)是一种肿瘤相关抗原(Tumor associated antigen, TAA),存在于90%癌细胞表面的分子。健康的人体细胞中也含有粘蛋白1，但数量很少，无法触发免疫反应。免疫系统遭遇粘蛋白I浓度高的癌 细胞可能触发免疫反应，激活的毒性T淋巴细胞可攻击和杀死癌细胞。
[0005]细胞免疫，特别是细胞毒性T细胞(下文中称为CTL)在从活体中清除肿瘤细胞、病毒感染的细胞等中发挥重要作用。CTL识别肿瘤细胞上的抗原肽(肿瘤抗原肽)和MHC (主要组织相容性复合体)I类抗原(在人中其被称为HLA抗原)的复合物，并攻击和杀死肿瘤细胞。
[0006]当细胞内合成肿瘤特异性蛋白(即肿瘤抗原蛋白质)后，该肿瘤特异性蛋白通过蛋白酶的细胞内降解产生肿瘤抗原肽。得到的肿瘤抗原肽与内质网中的MHC I类抗原(HLA抗原)结合以形成复合物，其被运输至细胞表面并作为抗原呈递。当肿瘤特异性CTL识别了作为抗原呈递的复合物时通过细胞毒性作用或淋巴因子的产生展示抗肿瘤作用。对一系列这些作用的阐明使通过使用肿瘤抗原蛋白或肽作为所谓的癌症免疫治疗剂(癌症疫苗)在具有肿瘤的患者中提高肿瘤特异性CTL的疗法成为可能。在肿瘤免疫治疗中，清除肿瘤细胞依靠T细胞的免疫作用。T细胞对抗原的识别，并不是完整的抗原分子。在抗原递呈细胞(APC)中，肿瘤相关抗原被酶分解成多肽，然后再在肽链转运蛋白的参与下被转运到内质网腔与新合成的HLA分子(human leukocyte antigen,人类白细胞抗原,包括HLA I分子或HLA II分子)结合并移至APC表面，形成HLA/抗原肽复合物，T细胞通过其表面特异的TCR识别抗原呈递细胞表面的HLA/抗原肽复合物后，再收到协同刺激信号(B7分子与CD28分子相互作用)。在双信号刺激下，T细胞被激活并发生增殖，大部分进而分化成效应细胞。其中cd8+t细胞有杀伤力，使外源细胞破裂而死亡。cd8+t细胞分泌白介素等细胞因子使cd8+t
细胞、Μφ以及各种有吞噬能力的白细胞集中于肿瘤细胞周围，将肿瘤细胞消灭。其中一部分τ淋巴细胞，成为记忆细胞，再次遇到相同抗原刺激时，它将更迅速地增殖分化为效应细胞。少数记忆细胞再次分裂为记忆细胞,持久地执行特异性免疫功能。
[0007]1991年,Rotzschke等用X射线晶体衍射揭示,HLA I类分子顶部α I和α 2链组成的抗原肽结合区呈凹槽状结构，可容纳8~12个氨基酸残基组成的短肽。凹槽内氨基酸组成在不同型别的HLA I分子中高度保守，可与表位肽N端残基和C端残基形成稳定而强大的氢键，保证了 HLA I分子可以识别特殊表位。在不同基因型HLA I的凹槽内氨基酸可以有各种变化，这是形成HLA I多态性的基础。虽然抗原肽与HLA I类分子的结合有一定的选择性，但与抗体和抗原结合的机理不一样，只要被结合的多肽有2~3个关键的有相似化学性质的氨基酸残基(锚定位点)，就能恰当地连接到凹槽内的多肽结合基序(bindingmotif)的相应位置上。多肽与之结合后，并被运送到细胞表面递呈给⑶8+τ细胞。ra8+T细胞通过其表面的T细胞受体(TCR)特异性识别抗原呈递细胞表面的HLA/抗原肽复合物后，被激活化并增殖，进而分化成效应细胞。正是这一结构基础，所以每个HLA I分子能与一定数量的不同多肽结合。这为不同型别的分子结合肽的序列进行表位预测提供了理论基础，从而使计算机辅助手段进行CTL表位的分析乃至预测成为可能。
[0008]HLA-DP、DQ、DR等HLA II类分子是由HLA II类基因编码的α链和β链非共价连接的糖蛋白组成。α链和β链在内质网分别合成后，各自盘绕成一个α螺旋和β片层构成凹槽。凹槽内也有锚定位点，凹槽与抗原肽结合形成HLA/多肽复合体。由于它的末端是开放的，故可容纳较长的多肽(约12~20个氨基酸)。当HLA II的凹槽与抗原肽结合形成MHC/多肽复合体，并被运送到细胞表面递呈给ra4+T细胞。ra4+T细胞通过其表面TCR特异性识别抗原呈递细胞表面的HLA/抗原肽复合物后，被活化和发生增殖，进而分化成效应细胞。ra8+T细胞必须要有刺激cd4+t细胞的信号，才能产生有效的免疫反应。激活的ra4+T细胞能有效促进CD8+T细胞产生记忆细胞，从而使机体产生长期的抗肿瘤的CTL反应。除此之外，激活的cd4+t细胞也可直接杀伤肿瘤细胞。
[0009]HLA不同基因座位或同基因同一座位的不同等位基因之间结构上的差异，可形成不同的HLA分子凹槽的结构。由此造成不同HLA等位基因编码分子对各种抗原肽的结合具有选择性。而且，能够和同一类HLA分子结合的抗原肽，其锚定位点和锚定残基往往相同或相似。这表明，特定的HLA分子可凭借所需要的共同性基序选择性地结合抗原肽，在这个意义上，两者的结合具有一定的选择性。事实上，不同HLA分子可选择性地结合具有不同锚定位和残基的肽段，故不同HLA等位基因产物有可能提呈同一抗原分子的不同表位，造成不同个体(带有相异的MHC等位基因)对同一抗原的应答在强度上出现差异。这上是HLA以其多态性参与和调控免疫应答的一种重要机制。
[0010]深入研究还发现，HLA分子对抗原肽的识别并非呈现严格的一对一关系。这一可变通性可表现在不同方面:一，组成共同性基础序列的抗原肽，其顺序和结构可变；二，同一HLA分子(如HLA II分子)所要求的锚定残基往往不止一种氨基酸，结果是对应的特定共同基础序列的肽链数量可以相当地多，造成一种HLA分子可结合多种抗原肽，激活多个特异T细胞克隆；三，不同HLA分子接纳的抗原肽，可拥有相似的共同基序。例如，在HLA I类分子中至少已知A2、A3、B4、B44四个家族，这些家族中的成员(各种等位基因产物)可选择性地共同识别拥有相同或相似锚定残基的抗原肽。这意味着能够被某一 HLA分子所识别和提呈的抗原肽，也可能被其所属家族中的其它分子所提呈。这对应用多肽疫苗，体外致敏树突状细胞疫苗或T细胞疫苗进行免疫预防和免疫治疗提供了便利。同时也为鉴定和改造肿瘤疫苗的多肽顺序提供依据。
[0011]不仅每个HLA I分子能与一定数量的不同多肽结合，T细胞也具有交叉反应现象，即单一的T细胞能够识别两个或两个以上不同的多肽抗原与MHC的蛋白质复合体。这又在另一个层面上提供了鉴定和改造肿瘤疫苗的多肽序列的依据。[0012]研究表明，克服HLA多态性的障碍，寻找有效的覆盖大部分人群的肿瘤表位疫苗已成为肿瘤特异性多肽疫苗免疫治疗研究的重要前提。
[0013]据统计，仅仅HLA A2(包括 A*0201、A*0202、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207 和A*0208)与HLA A3 (包括A*0301、A*1101、A*3101和A*6801)两个大型在中国人的总平均
分布频率超过85%。同一大型识别的肽序列非常相似。
[0014]本领域还需要更有效的覆盖大部分人群的肿瘤疫苗。
【发明内容】
[0015]本发明提供了可被MHC (主要组织相容性复合体)抗原(在人中其被称为HLA抗原，包括HLA I和HLA II)识别并进而激发肿瘤相关T细胞的人类粘蛋白I的抗原决定簇。本发明提供的抗原决定簇在亚洲人，特别是中国人中占了大多数，即出现的频率较高。
[0016]本发明还提供根据这些人类粘蛋白I的抗原决定簇制备得到的多肽和相关肿瘤多肽疫苗。这些制备得到的肿瘤多肽疫苗在较大的人群中有良好的治疗效果。
[0017]具体的，本发明提供了一种分离的多肽或其变体，所述多肽包含与下列(a)或(b)的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列:
[0018](a) SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
[0019](b)所述(a)的氨基酸序列的片段。
[0020]SEQ ID NO:1 所示的氨基酸序列为 MTPGTQSPFFLLLLLTVLTV VTGS。
[0021]本发明的多肽或其变体可结合HLA I或HLA II分子并被OT8+T细胞或OT4+T细胞识别。在本发明的其中一个方面，本发明的多肽或其变体可结合HLA I分子并被CD8+T细胞识别。
[0022]本发明中，术语“分离”是指非天然的形式。
[0023]在本发明中，术语“变体”或“多肽的变体”是指与所述多肽在蛋白活性，例如抗原性上，表位上或免疫学上等同或具有更好活性的变体。在一些实施方案中，本领域技术人员可以通过改变所述多肽上不破坏其活性的部分，例如取代、缺失、插入、增加该多肽的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而得到所述变体。在一些实施方案中，可以通过鉴定相似多肽之间保守的分子的残基和部分而对所述多肽进行相关氨基酸的替换而得到所述变体。本领域技术人员还能分析与相似多肽中的结构相关的三维结构和氨基酸序列。根据这样的信息，本领域技术人员可以预测抗原三维结构的氨基酸序列比对，由此制备在各个期望的氨基酸残基处包含单一氨基酸取代作用的试验变体。然后可以应用本领域技术人员公知的活性测定来对这些变体进行筛选。[0024]在本发明中，表述“多肽包含某氨基酸序列”中的“包含”包括“具有”的含义。
[0025]本发明提供的多肽包括具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽的片段(免疫原性片段)，即具有所述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的一个连续部分，该部分能产生识别SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽的免疫应答。优选的片段包括，例如，具有SEQ IDNO:1的一部分连续的氨基酸序列的截短多肽。
[0026]在本发明的一个方面，提供了上述多肽，其中(b)中所述片段为包含或具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列中连续10个氨基酸的片段。
[0027]在本发明的又一个方面，提供了上述多肽，其具有FLLLLLTVLT (SEQ ID NO:2),LLLLLTVLTV (SEQ ID NO:3), LLLLTVLTVV (SEQ ID NO:4), FFLLLLLTVL (SEQ ID NO:5),GTQSPFFLLL (SEQ ID NO:6), TQSPFFLLLL (SEQ ID NO:7)的氨基酸序列。
[0028]在本发明的一个方面，上述多肽可结合HLA I分子并被ra8+T细胞识别。OT8+T细胞也被称为细胞毒性T细胞(CTL)。在本发明的又一个方面，其中所述HLA I为HLA A2或HLA A3型，优选为HLA A2，更优选为A*0201或A*0202。
[0029]在本文，“基本上相同的氨基酸序列”是指氨基酸序列中一个到几个(例如2、3、4或5个)氨基酸被置换、缺失、添加或插入，其与该氨基酸序列相比具有相同或相似或更好的活性。在本发明中，所述活性可以是指，例如，被HLA I和HLA II识别并进而激发肿瘤相关T细胞的活性。
[0030]可依照在常规肽化学中使用的方法合成本发明的多肽。这些已知方法包括例如在下列文献中描述的方法:Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966。
[0031]也可以通过常规的基因工程制备本发明的多肽。例如，可使用常规DNA合成和基因工程方法制备的编码所述多肽的核苷酸来制备所述多肽。即通过下述方法制备所述多肽:将上述多核苷酸插入常用的表达`载体；用得到的重组表达载体转化宿主细胞；培养得到的转化体；和从培养物中收集所述多肽。可参照例如以下文献中描述的方法进行:Molecular Cloning, Τ.Maniatis 等人，CSH Laboratory (1983)。
[0032]本发明还提供了由编码本发明的上述多肽的碱基序列组成的分离的核酸。本发明的核酸可为cDNA、mRNA或DNA/RNA嵌合体，优选DNA。所述核酸可以是双链或单链。当所述核酸是双链的，它可以是双链DNA、双链RNA或DNA: RNA杂合体。当本发明的多核苷酸为双链时，可将其插入表达载体以产生用于表达本发明的肽的重组表达载体。因此，本发明的核酸包含通过将本发明的双链多核苷酸插入表达载体得到的重组表达载体。
[0033]编码本发明的上述信号肽的碱基序列不受特别限制，只要它在翻译之后产生本发明的上述多肽的氨基酸序列的任何一个。编码所述氨基酸序列的碱基序列可以通过PCR方法等以含有粘蛋白序列的基因组DNA或RNA作为I旲板而获得。另一方面，考虑到在宿主细胞中的表达效率，通常优选选择非常经常用于所用宿主细胞的密码子。在各种生物品种中密码子的使用频率数据可以从遗传密码使用频率数据库获得。本发明的核酸的也可通过DNA/RNA自动合成仪进行化学合成。
[0034]在本发明的一个方面，提供了含有上述本发明的多肽或核酸的疫苗和药物组合物。在本发明提供的所述疫苗和药物组合物可用于治疗或预防癌症。上述本发明的多肽可用作治疗或预防癌症的疫苗和药物组合物。上述本发明的核酸也可用作治疗或预防癌症的疫苗和药物组合物。本发明的核酸可以通过惯用的方式表达从而得到本发明的多肽，进而用于上述用途。
[0035]本发明的多肽可被呈递至抗原呈递细胞的HLA抗原，因此可治疗或预防患者的肿瘤。本发明的多肽可被呈递至抗原呈递细胞的HLA，特异性激发能识别HLA抗原和呈递的多肽的结合的复合物的T细胞，特别是CD8+T细胞，可增殖从而杀死肿瘤细胞，因此可被用于治疗或预防患者的肿瘤。
[0036]包含本发明的多肽作为活性成分的用于诱导T细胞，特别是CD8+T细胞的试剂可与药学上可接受的载体例如合适的佐剂混合或组合施用，从而有效建立细胞免疫。可使用的佐剂的例子包括在文献Clin.Microbiol.Rev.,7:277-289, 1994 (其在此处引入作为参考)中描述的那些。
[0037]本发明的多肽能够在HLA A2与HLA A3两个大型中特别有效地被呈递和诱导特异性细胞毒性 T 细胞(CTL)。HLA A2 型包括 A*0201、A*0202、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207和A*0208。HLA A3包括A*0301、A*1101、A*3101和A*6801。这两个大型在中国人的总平均分布频率超过85%。因此，本发明的多肽和基于本发明的多肽的预防和治疗肿瘤的疫苗或药物组合物能够有效的覆盖大部分人群。优选的，本发明的多肽能够在HLA A2型中有效地被呈递和诱导特异性细胞毒性T细胞(CTL)。更优选的，本发明的多肽能够在A*0201、A*0202型中有效地被呈递和诱导特异性细胞毒性T细胞(CTL)。
[0038]包含本发明的多肽或衍生物作为活性成分的用于诱导预防或治疗性免疫反应的疫苗可与药学上可接受的载体例如合适的佐剂混合或组合施用，从而更有效建立免疫反应。
[0039]可使用的佐剂的实例包括，例如，微生物来源的成分或其衍生物，细胞因子，植物来源的成分或其衍生物，海洋生物来源的成分或其衍生物，矿物质凝胶例如氢氧化铝、溶血卵磷脂，表面活性剂例如多元醇，聚阴离子，肽，油性乳化剂(乳化剂制剂)等等。另外也可考虑脂质体制剂，与具有几微米直径的珠连接的纳米微粒制剂，具有连接的脂的制剂，微球制剂，微胶囊制剂等等。
[0040]本发明的上述疫苗或药物组合物的施用的方法包括皮内、皮下、肌肉内、静脉施用等等。在制剂中的本发明的肽的剂量可根据待治疗的疾病，患者的年龄和体重等适当地调整。通常，本发明的肽在制剂中的剂量为0.0001至lOOOmg，优选0.001至lOOOmg，更优选
0.1至10mg，优选地每几天或I至几个月施用I次。
[0041]上述本发明的疫苗和药物组合物也可通过体外方法用于治疗肿瘤患者。换句话说，本发明的多肽或核酸可在体外与抗原呈递细胞和/或免疫效应细胞接触，产生能够识别本发明抗原或抗原复合体的抗原呈递细胞，从而诱导特异性T细胞，特别是cd8+t细胞，然后返回患者体内以用于预防或治疗癌症。本发明提供了通过在体外将来源于肿瘤患者的外周血淋巴细胞和本发明的多肽或核酸接触而诱导的T细胞，特别是cd8+t细胞，以及产生上述细胞的方法。
[0042]在本发明的一个方面，提供了产生抗原呈递细胞的方法。在本发明的其中一个方面，所述方法包括将上述本发明的多肽与具有抗原呈递能力的细胞接触的步骤。在本发明的其中一个方面，所述 方法包括将上述本发明的核酸与具有抗原呈递能力的细胞接触的步骤。如上所述的本发明的多肽和核酸可与具有抗原呈递能力的细胞接触，可以产生抗原呈递细胞。将本发明的多肽或核酸与具有抗原呈递能力的细胞接触，可以产生抗原呈递细胞。本发明的多肽和核酸可在体外使用，用于预防或治疗肿瘤。例如，通过在体外将本发明的多肽或核酸与具有抗原呈递能力的细胞接触，可以产生抗原呈递细胞。本发明的多肽和核酸也可在体内使用，用于预防或治疗肿瘤。
[0043]在本发明中，具有抗原呈递能力的细胞是在所述细胞表面表达呈递多肽的HLA抗原的细胞。其中一种具有抗原呈递能力的细胞是树突细胞。
[0044]本发明提供了一种抗原呈递细胞，在所述细胞表面表达呈递本发明的多肽的HLA抗原的细胞。其中一种具有抗原呈递能力的细胞是树突细胞。本发明的抗原呈递细胞可以通过将本发明的多肽或核酸加入上述具有抗原呈递能力的细胞而制备。
[0045]本发明的抗原呈递细胞可通过下述方法获得:从肿瘤患者中分离具有抗原呈递能力的细胞，用本发明的多肽在体外刺激细胞，并允许抗原呈递细胞呈递HLA抗原和多肽的复合物。当使用树突细胞时，可从肿瘤患者的外周血中分离淋巴细胞、去除不能粘附培养皿的细胞、在GM-CSF和IL-4的存在下培养粘附细胞以诱导树突细胞、和培养并用本发明的肽刺激树突细胞而制备本发明的抗原呈递细胞。
[0046]在通过将本发明的核酸加入到具有抗原呈递能力的细胞中而制备本发明的抗原呈递细胞。所述核酸可为DNA或RNA形式。所述核酸可在具有抗原呈递能力的细胞中表达本发明的多肽。
[0047]本发明提供了一种免疫效应细胞，所述细胞能够特异性识别表面表达呈递了本发明的多肽和HLA抗原复合物的呈递细胞，并被激活并发生增殖，分化成效应细胞。效应细胞包括各种T细胞，例如CD8+T细胞和CD4+T细胞。在本发明的一个方面，本发明提供了一种免疫效应细胞，其为CD8+T细胞，对癌症细胞有杀伤力，使癌症细胞破裂而死亡，还成为记忆细胞，再次遇到相同抗原刺激时，它将更迅速地增殖分化为效应细胞。
[0048]本发明的免疫效应细胞可以通过将本发明的多肽或核酸加入具有抗原呈递能力的细胞，然后将呈递了本发明的多肽和HLA抗原复合物的呈递细胞与具有免疫效应能力的细胞接触而制备。
[0049]本发明提供的上述本发明的抗原呈递细胞可用作治疗或预防癌症的疫苗或药物组合物。本发明的抗原呈递细胞具有免疫诱导活性，可用于制备诱导抗原特异性效应细胞的试剂。被诱导的cd8+t细胞能够通过细胞毒性作用和淋巴因子的产生发挥抗肿瘤作用。因此，本发明的抗原呈递细胞可为用于治疗或预防肿瘤的疫苗或药物组合物的活性成分。包含抗原呈递细胞作为活性成分的用于诱导CTL的疫苗可包含盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)、培养基等等以稳定地维持抗原呈递细胞。施用的方法包括静脉内施用。可将包含抗原呈递细胞作为活性成分的用于诱导CD8+T细胞的试剂返回患者的体内，因此可在对本发明多肽有反应的患者体内有效诱导特异性CD8+T细胞，结果可治疗或预防肿瘤。
[0050]本发明的免疫效应细胞可用作治疗或预防癌症的疫苗或药物组合物。本发明的效应细胞包括各种T细胞，例如cd8+t细胞。本发明的cd8+t细胞能够通过细胞毒性作用和淋巴因子的产生发挥抗肿瘤作用。因此，本发明的免疫效应细胞可为用于治疗或预防肿瘤的疫苗或药物组合物的活性成分。包含抗原呈递细胞作为活性成分的免疫效应细胞的疫苗可包含盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)、培养基等等以稳定地维持免疫效应细胞。施用的方法包括静脉内施用。可将包含免疫效应细胞作为活性成分的试剂返回患者的体内，结果可治疗或预防肿瘤。[0051]在本发明的一个方面，提供了含有上述本发明的抗原呈递细胞或免疫效应细胞的疫苗和药物组合物。在本发明提供的所述疫苗和药物组合物可用于治疗或预防癌症。上述本发明的抗原呈递细胞或免疫效应细胞可用作治疗或预防癌症的疫苗和药物组合物。
[0052]上述本发明的含有抗原呈递细胞或免疫效应细胞的疫苗和药物组合物可通过体外方法用于治疗肿瘤患者。本发明的多肽或核酸可在体外与抗原呈递细胞和/或免疫效应细胞接触，产生能够识别本发明抗原或抗原复合体的抗原呈递细胞，从而诱导特异性效应细胞，例如T细胞(特别是CD8+T细胞)，然后将所述抗原呈递细胞和/或免疫效应细胞返回患者体内以用于预防或治疗癌症。在本发明的一个方面，所述患者为HLA I型，优选为HLAA2或HLA A3型，更优选为HLA A2型，最优选为A*0201或A*0202型。
[0053]本发明的免疫效应细胞，例如T细胞(特别是CD8+T细胞)，可用作用于治疗或预防肿瘤的疫苗或药物组合物的活性成分。
[0054]上述本发明的多肽或核酸，以及上述本发明的抗原呈递细胞或免疫效应细胞，可用于预防或治疗癌症。所述癌症包括血癌、实体瘤等，更具体地讲，包括肺癌、恶性淋巴瘤(例如网状细胞肉瘤、淋巴肉瘤、霍奇金病(Hodgkin’s disease)等)、消化器官癌(例如胃癌、胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、直肠癌等)、乳腺癌、卵巢癌、肌与骨骼肉瘤(musculoskeletal sarcoma)(例如骨肉瘤(osteosarcoma)等)、膀胱癌、白血病(例如急性白血病，包括慢性髓细胞性白血病急性发作)、肾癌、前列腺癌等，优选为消化器官癌，例如胃癌、胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、直肠癌等。优选的，为肝癌。
[0055]本发明还提供了如前所述的本发明的多肽或其变体，或如前所述的本发明的核酸，或如前所述的本 发明的抗原呈递细胞，或如前所述的本发明的免疫效应细胞在用于制备治疗或预防癌症的疫苗或药物组合物中的用途。所述癌症包括血癌、实体瘤等，更具体地讲，包括肺癌、恶性淋巴瘤(例如网状细胞肉瘤、淋巴肉瘤、霍奇金病(Hodgkin’s disease)等)、消化器官癌(例如胃癌、胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、直肠癌等)、乳腺癌、卵巢癌、肌与骨骼肉瘤(musculoskeletal sarcoma)(例如骨肉瘤(osteosarcoma)等)、膀胱癌、白血病(例如急性白血病，包括慢性髓细胞性白血病急性发作)、肾癌、前列腺癌等，优选为消化器官癌，例如胃癌、胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、直肠癌等。优选的，为肝癌。
【专利附图】
【附图说明】
[0056]图1a细胞系MUCl蛋白表达western免疫印迹检测；
[0057]图1b细胞系HLA-A2蛋白表达western免疫印迹检测；
[0058]图2a受呈递本发明多肽的树突细胞激发的T细胞增殖；
[0059]图2b对照组的T细胞形态；
[0060]图2c荷载了抗原肽的DCs刺激的T细胞形态；
[0061]图3T细胞杀伤肿瘤细胞效果；
[0062]图4T细胞杀伤肿瘤细胞效果；
[0063]图5T细胞杀伤肿瘤细胞效果；
[0064]图6T细胞杀伤肿瘤细胞效果；
[0065]图7T细胞杀伤肿瘤细胞效果；[0066]图8T细胞分泌细胞因子IFNy ；
[0067]图9成熟DC细胞表面标记；
[0068]图1OaT细胞杀伤肿瘤细胞效果；
[0069]图1ObT细胞杀伤肿瘤细胞效果；
[0070]图11细胞系MUCl蛋白表达western免疫印迹检测；
[0071]图12a抗原肽在小鼠体内治疗肿瘤效果；
[0072]图12b抗原肽在小鼠体内预防肿瘤效果。
【具体实施方式】
[0073]通过以下实施例进一步说明本发明，但这些实施例不在任何方面限制本发明。
[0074]实施例1抗原肽的合成
[0075]人工合成多肽MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGS (SEQ ID NO:1)，以下简称为抗原肽。合成的多肽纯化至97%。将冻干的抗原肽溶解于二甲亚砜(25mM)，储存于_80°C。
[0076]用同样方法合成多肽FLLLLLTVLT (SEQ ID NO:2), LLLLLTVLTV (SEQ ID NO:3),LLLLTVLTVV (SEQ ID NO:4), FFLLLLLTVL (SEQ ID NO:5), GTQSPFFLLL (SEQ ID NO:6),TQSPFFLLLL (SEQ ID NO:7)，分别简称为抗原肽1、抗原肽2、抗原肽3、抗原肽4、抗原肽5和抗原肽6。
[0077]实施例2树突细胞(Dendritic Cells，DCs)的制备
[0078]外周血中单个核细胞(PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状比重为
1.075左右。用比重为1.077的Ficol1-Hypaque分离液进行密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布，可将各种血细胞加以分离。
[0079]从香港红十字血液中心取得健康志愿者的白细胞浓缩液，用PBS将其稀释适当倍数，然后加入到Ficoll-Hypaque分离液表面上，18_20°C, 800g密度梯度离心30min,离心完毕，离心管内容物分为三层，上层为血浆(内含血小板)，中间层为分离液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液分界面处可见到乳白色浑浊的PBMC层。取出PBMC层，重悬于PBS中，400g离心lOmin，重复上步，将细胞沉淀重悬于含有10%胎牛血清的RPMI1640中，37°C培养2小时，取出非贴壁细胞，用于分离T细胞，向贴壁的细胞中加入含1000U/ml hGM-CSF和500U/ml hIL-4的RPMI1640培养基，37°C培养I周，诱导单核细胞分化为DCs，其中每两天换一次培养基和细胞因子，收获非吸附的及吸附较松的细胞，即为DCs。
[0080]实施例3T细胞的制备(尼龙棉法)
[0081]T细胞表面绒毛短而少，B细胞绒毛多而长，由于细胞表面光滑程度不同，B细胞在37°C时易戮附于尼龙棉纤维上，而T细胞则不具有此能力。利用这一特性，可分离T细胞和B细胞。
[0082]尼龙棉柱的制备:Ig尼龙棉/柱灭菌处理后，加入RPMI1640培养基，37 °C放置2小时，让RPMI1640流出。将上述的非贴壁细胞重悬于适当体积的RPMI1640中，使得细胞浓度为0.5-1.0x107ml，然后加入到所制备的尼龙棉柱中，2ml/柱，37°C保温I小时，向尼龙棉柱中加入RPMI1640，IOml/柱，洗脱未吸附到尼龙棉上的细胞，收集洗脱液，即为T细胞悬液。400g离心5min，将细胞沉淀重悬于细胞冻存液中，冻存备用。
[0083]实施例4T细胞增殖测定(3H-TdR掺入法)[0084]细胞增殖的前提是细胞质和细胞核的复制，一般一个细胞周期大致分为4个时期，即Gl期、S期、G2期、M期。其中，S期是DNA合成期，主要功能是进行DNA合成。3H_TdRSP (甲基-3H)胸腺嘧啶核苷酸是DNA合成的前体，将其加入细胞培养液中后，会被细胞摄取，可作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，所掺入的3H-TdR也越多，检测所掺入的3H-TdR就可反映出细胞增殖的程度。
[0085]向DCs的培养液中加入适当浓度的抗原如本实验的各抗原肽，37°C温育4小时，收获DCs，并用PBS洗一次，按照一定的细胞比例，将来自同一志愿者的DCs和T细胞加入到96孔平底培养板中，37°C共培养5天后，加入3H-TdR，IuCi/孔，37°C保温18小时，利用多头细胞收集器，将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，并依次用PBS、5%三氯乙酸和无水乙醇洗涤各三次，烘干滤纸，将滤纸放入到闪烁液中，在β液闪计数仪上测定cpm值。
[0086]实施例5细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)测定(LDH法)
[0087]乳酸脱氢酶(LDH)是活细胞的胞浆内含酶之一，正常情况下不能透过细胞膜，但当靶细胞受到效应细胞攻击而受损时，细胞膜的通透性改变，LDH就会释放到介质中。而LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，可使氧化辅酶I(NAD)变成还原辅酶I (NADH)，后者再通过递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化四氧唑(INT)，INT接受H2+被还原成紫红色的甲肷化合物，该化合物在490nm处有一高吸收峰，利用读取的A490nm作为指标，可知靶细胞被效应细胞杀伤的程度。
[0088]向DCs的培养液中加入适当浓度的抗原如本实验的各抗原肽，37°C温育4小时，收获DCs，并用PBS洗一次，按照一定的比例，将来自同一志愿者的DCs和T细胞加入到24孔培养板中，37°C共培养7-10天，其中培养液中加入20U/ml hIL_2，利用Ficoll-Hypaque密度梯度离心收集T细胞以作为效应细胞。5mM EDTA消化肿瘤细胞系(例如SMMC-7721或K562)细胞以作为靶细胞。
[0089]分别将效应细胞和靶细胞重悬于一定体积的分析培养基(含1%BSA的RPMI1640)中，按不同的比例，将效应细胞(IOOul)和靶细胞(IOOul)加入到96孔圆底培养板中，37°C保温5小时，取出上清IOOul/孔，并加入到96孔酶标板中，加入IOOul/孔LDH反应液，室温下暗处反映30min，加入IMHCL终止液，50ul/孔，测定A490nm，A630nm作为参照波长。计算细胞毒性:细胞毒性(%)=[(杀伤试验孔-靶细胞自发释放孔-效应细胞自发释放孔)/ (最大释放孔-靶细胞自发释放孔)]X100%。
[0090]注:杀伤实验孔为效应细胞+靶细胞；靶细胞自发释放孔为靶细胞+分析培养基；效应细胞自发释放孔为效应细胞+分析培养基；最大释放孔为靶细胞+2%TritionX100。
[0091]实施例6ELISA_spot (ELISPOT)法测定 IFNy
[0092]细胞因子ELISP0T法用于测定单细胞悬液中细胞因子分泌细胞的数量，它检测速度快，具有很高的灵敏度，且易于操作。其原理是先将高亲和力的抗细胞因子的抗体包被于ELISP0T板上，当将待测细胞加入到ELISP0T板中后，其所分泌的细胞因子就会被所包被的抗体捕捉到，这样在除掉待测细胞悬液后，加入标记的另一种抗细胞因子的抗体，然后加入相应的显色试剂后，就可以在ELISP0T板上产生表示细胞因子分泌数量和位置的斑点。
[0093]向DCs的培养液中加入适当浓度的抗原如本实验的各抗原肽，37°C温育4小时，收获DCs，并用PBS洗一次，按照一定的比例，将来自同一志愿者DCs和T细胞加入24孔培养板中，37°C共培养7-10天，其中培养液中加入20U/ml hIL_2，利用Ficol1-Hypaque密度梯度离心并收集T细胞以作为效应细胞，利用5mM EDTA消化SMMC-7721，并用Y射线辐射处理以作为靶细胞，分别将效应细胞和靶细胞重悬于一定体积的培养基中，按一定的比例，将效应细胞(IOOul)和靶细胞(IOOul)加入到预先包被了 IFNy抗体的96孔ELISPOT反应板中，37°C温育18小时，去除细胞悬液，PBST洗10次，加入生物素标记的IFNy抗体，37°C温育2小时，PBST洗10次，加入酶标记的抗生物素的抗体，37’ C温育2小时，PBST洗10次，加入底物溶液，室温下暗处反应15-30min，利用ELISPOT自动读数仪进行计数。
[0094]实施例7流式细胞测定(FACS)
[0095]制备单细胞悬液:收获待测细胞，并用冷的PBS洗涤细胞，将细胞重悬于50ul/管PBS中，加入相应的抗体，冰上放置I小时，用冷PBS洗涤2次，加入FITC标记的二抗，冰上放置30min，用冷PBS洗涤2次，将细胞重悬于2%多聚甲醛中，用于流式细胞测定。
[0096]实施例8Western法鉴定具有MUCl蛋白和HLA-A2蛋白的肿瘤细胞系
[0097]采用本领域通用的SDS-PAGE和Western免疫印迹法，即蛋白质经单向电泳后分离后被转移到硝酸纤维滤膜上，然后用放射性或酶标记的特异抗体来检测相应抗原的存在的方法，来鉴定肿瘤细胞含有的蛋白。
[0098]实验使用了肿瘤细胞系SMMC-7721和SMMC-7721-0201。SMMC-7721是上海细胞生物学研究所提供的可商购的肝癌肿瘤细胞系(参见Lu J.,Xu R.B.and Doung R.C.(1985)The glucocorticoid receptors and the induction of tyrosine aminotransferase byglucocorticoid in the human liver cancer cell line(SMMC-7721)in vitr0.Shi YanSheng Wu Xue Baol8:231-238)。SMMC-7721-0201 是通过在 SMMC-7721 转染和稳定表达人类HLA-0201基因的细胞系。
[0099]先用0.25%胰蛋白酶消化肿瘤细胞SMMC-7721和SMMC-7721-0201，然后用1640完全培养基(含10%FBS和1%青-链霉素)吹散细胞，收集于15ml离心管中。lOOOrpm，离心5min，弃去上清液。用80 μ I P`BS重悬细胞(细胞量多可以适当增加PBS体积)，再加入5 X SDS-PAGE上样Buffer，混匀后沸水浴煮5min。
[0100]样品处理后按常规方法进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和 Western 免疫印迹实验。Western 免疫印迹实验中的一抗分别为抗Mucl单抗和抗HLA-A2单抗(BB7.2细胞上清)，二抗为羊抗鼠 IgG-HRP。
[0101]图1a和图1b为SDS-PAGE和Western免疫印迹实验结果。
[0102]其中图1a的第I泳道为SMMC-7721-0201细胞株样品，第二泳道为SMMC-7721细胞株样品。
[0103]其中图1b的第一泳道为SMMC-7721-0201细胞株样品，第二泳道为SMMC-7721细胞株样品。
[0104]如图1a所示，肿瘤细胞株SMMC-7721和SMMC-7721-0201都表达了 MUCl蛋白。
[0105]如图1b 所示，肿瘤细胞株 SMMC-7721 为 HLA-A2 阴性；SMMC-7721-0201 为 HLA-A2阳性。
[0106]另外的实验还测试了 SMMC-7721和SMMC-7721-0201中MHC I的表达情况，证明细胞株 SMMC-7721 和 SMMC-7721-0201 是 MHC I 阳性。
[0107]实施例9荷载了各抗原肽的DCs刺激T细胞的增殖[0108]利用实施例1 中制备的抗原肽，即 MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGS (SEQ ID NO:1)来刺激DCs，然后利用得到的荷载了抗原肽的DCs来刺激自身的T细胞，测定荷载了抗原肽的DCs能否刺激自身T细胞的增殖。
[0109]用10ug/ml抗原肽来荷载DCs，荷载条件是37°C温育4小时，然后DCs与自身T细胞以不同的比例(DCs:T=1: 10和DCs:T=1:3)进行共培养，5天后，加入3H_TdR，18小时后测定3H-TdR的摄入，以测定T细胞的增殖状况。作为对照，T细胞与未荷载抗原肽的DCs共培养，或T细胞单独培养。如图2a所示，各组T细胞的增殖水平是明显不同的，在DCs:T=l: 10时，荷载了抗原肽的DCs所刺激的T细胞的增殖水平是未荷载DCs所刺激的T细胞增殖水平的10倍，及单独培养的T细胞的15倍；当将DCs:T提高到1:3时，T细胞的增殖水平也明显升高。这些实验结果表明:荷载了抗原肽的DCs能够有效的刺激自身T细胞的增殖，而未荷载抗原肽的DCs则不能刺激自身T细胞的增殖。
[0110]另外，如图2b和2c所示，在形态上，经荷载了抗原肽的DCs刺激的T细胞明显不同于对照组的T细胞，呈现明显的激活状态，如细胞体积增大、数目增多等。
[0111]对抗原肽1、抗原肽2、抗原肽3、抗原肽4、抗原肽5和抗原肽6进行相同测试，荷载了抗原肽的DCs能够有效的刺激自身T细胞的增殖。
[0112]实施例10荷载了各抗原肽的DCs能够激活肿瘤细胞特异性的CTLs
[0113]在机体抗肿瘤的免疫应答中，CTLs发挥着极其重要的作用。利用实施例1中制备的抗原肽来刺激DCs，然后利用制得的荷载了抗原肽的DCs来刺激自身的T细胞，测定荷载了抗原肽的DCs能否激活肿瘤细胞特异性的CTLs。
[0114]用不同浓度的抗原肽来荷载DCs,37°C温育4小时，然后DCs与T细胞以DCs: T=1: 5的比例进行共培养，7-10天后， 利用LDH法测定T细胞对表达MUCl蛋白的肝癌细胞SMMC-7721-0201的杀伤力。实验中，T细胞与荷载抗原肽的DCs共培养，作为对照，T细胞与未荷载抗原肽的DCs共培养、或T细胞单独培养。如图3所示，经荷载了抗原肽的DCs所刺激的T细胞能够有效的杀伤表达MUCl蛋白的肿瘤细胞，而与未荷载抗原肽的DCs共培养的T细胞及单独培养的T细胞则不能杀伤肿瘤细胞。如图4所示，当增加荷载DCs的抗原肽的浓度时，经此DCs所刺激的T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力也随之增强。
[0115]为了测定效应细胞对肿瘤细胞的杀伤力是由于激活了肿瘤细胞特异的CTLs而不是由于非特异性杀伤细胞NK细胞的存在，在细胞毒性测定中，利用可商购的NK细胞敏感性细胞系K562(ATCC.Cat.n0.:CCL_243)作为靶细胞，如图5所示，经荷载了抗原肽的DCs刺激的T细胞能够有效的杀伤表达MUCl蛋白的肝癌细胞SMMC-7721，而SMMC-7721正是抗原肽的来源细胞。但经荷载了抗原肽的DCs刺激的T细胞不能杀伤K562细胞。表明杀伤肝癌细胞的是特异性的CTLs而不是非特异的NK细胞。
[0116]为了进一步测定对肝癌细胞杀伤活性的特异性，在细胞毒性测定中，利用了人的肝癌细胞系SMMC-7721-0201和SMMC-7721作为靶细胞，另外，为了测定杀伤活性是否是MHCI限制性的，将靶细胞表面的MHC I用抗MHC I的抗体封闭，如实施例8的结果所述，其中SMMC-7721-0201和SMMC-7721都是MHC I和抗原肽阳性。如图6实验结果显示，CTLs对SMMC-7721-0201的杀伤活性明显高于对SMMC-7721的杀伤活性，当SMMC-7721-0201表面的MHC I被封闭后，CTLs对其的杀伤力也消失了，相反的，当SMMC-7721表面的MHC I被封闭后，CTLs对其的杀伤力却没有明显变化。这表明CTLs对SMMC-7721的杀伤力是MHC I限制性，从而说明了对SMMC-7721的杀伤活性是由CTLs介导的。
[0117]由于作为抗原来源的细胞SMMC-7721和作为效应细胞的T细胞不是来自同一个体，所以T细胞对SMMC-7721的杀伤活性可能是同种异型反应(allogeneic response)。为了排除这种同种异型反应的可能性，在细胞毒性测定中，利用荷载了抗原肽的DCs及未荷载的DCs作为靶细胞。如图7所示，由于DCs和T细胞是来自于同一个体，因此T细胞对未荷载的DCs没有杀伤活性，相反的，T细胞对荷载了抗原肽的DCs表现出明显的杀伤活性，这是由于荷载了抗原肽的DCs对抗原肽所结合的肿瘤多肽进行了加工呈递，在细胞表面表达肿瘤抗原，这表明CTLs对SMMC-7721的杀伤活性是特异于肿瘤抗原的抗肿瘤免疫应答而不是同种异型反应。 [0118]以上实验结果表明:抗原肽所结合肿瘤抗原被DCs成功的加工并呈递给T细胞，从而有效的激活了肿瘤细胞特异的CTLs。
[0119]对抗原肽1、抗原肽2、抗原肽3、抗原肽4、抗原肽5和抗原肽6进行相同测试，其能有效激活肿瘤细胞特异的CTLs。
[0120]实施例11荷载了抗原肽的DCs能够刺激T细胞分泌细胞因子IFN Y
[0121]在抗肿瘤的免疫应答中，细胞介导的抗肿瘤应答起着关键作用，其中，CTLs反应和IFNy的分泌是细胞应答的主要特征。
[0122]测定了荷载了抗原肽的DCs能否刺激自身T细胞分泌细胞因子IFNy。按实施例6描述的方法，用40ug/ml的抗原肽荷载DCs，37°C温育4小时，然后DCs与T细胞以DCs: T=1: 5的比例进行共培养，7-10天后，测定T细胞分泌IFN Y的状况。作为对照，T细胞与未荷载抗原肽的DCs共培养，或T细胞单独培养。刺激过的自身T细胞通过梯度离心收获，IFNy分泌用ELISPOT测定。自身T细胞和未荷载抗原肽DCs共培养及自身T细胞自身作为对照。如图8所示，经荷载了抗原肽的DCs所刺激的T细胞在遇到靶细胞SMMC-7721时，能够分泌高水平的IFN Y，而经未荷载抗原肽的DCs刺激的T细胞及单独培养的T细胞在遇到靶细胞SMMC-7721时，则没有明显的IFNy分泌。此实验结果与上述的CTLs实验结果相一致，表明荷载了抗原肽的DCs能够激活肿瘤细胞特异的T细胞，该T细胞能够分泌高水平的细胞因子IFNy。
[0123]实施例12抗原肽刺激DCs成熟
[0124]如上所述，荷载了抗原肽的DCs能够激活肿瘤细胞特异性的CTLs，这表明DCs已经加工呈递了抗原肽所结合的肿瘤抗原，并引发了特异性的抗肿瘤免疫应答。由于DCs的表型转变，即由不成熟DCs转变成成熟DCs，是DCs发挥作用的前提，所以可以推出荷载了抗原肽的DCs必定发生了表型转变。为了检测这一推论，测定了抗原肽能否刺激DCs的成熟。
[0125]DCs在与40ug/ml的抗原肽于37°C温育4小时后，继续培养48小时，然后利用流式细胞技术测定DCs表面的HLA-DR、⑶80、⑶86、⑶83和⑶40的表达状况。如图9所示，经抗原肽刺激后，DCs表面的HLA-DR、共刺激分子⑶80和⑶86、及细胞成熟标志分子⑶83和CD40的表达水平明显提高。这表明，抗原肽能够有效的刺激DCs成熟，是DCs的有效活化分子。
[0126]以上各实验结果表明，从肿瘤细胞中分离纯化的各抗原肽结合了肿瘤抗原，能够有效的刺激DCs的成熟；而且荷载了抗原肽的DCs能够有效的加工呈递肿瘤抗原，并激活肿瘤细胞特异性的抗肿瘤细胞免疫应答，其中包括刺激T细胞的增殖、激活肿瘤细胞特异的CTLs和刺激T细胞分泌细胞因子IFN Y等。
[0127]实施例13荷载了抗原肽的DCs能够激活肿瘤细胞特异性的CTLs并有效攻击肿瘤细胞
[0128]本实验测试了本发明的各抗原肽的HLA表型特异性。
[0129]实验采用了购自PerkinElmer (AD0116)的试剂盒进行细胞毒性T淋巴细胞的杀伤性测定:
[0130]用0.25%胰蛋白酶消化靶细胞(肿瘤细胞SMMC-7721和SMMC-7721-020，其中 SMMC-7721 和 SMMC-7721-0201 都为 MUCl 蛋白阳性；SMMC-7721 为 HLA-A2 阴性；SMMC-7721-0201为HLA-A2阳性)后用1640完全培养基(含10%FBS和1%青-链霉素)洗涤一次；再用1640完全培养基重悬细胞，调整细胞数到lX106cells/ml。取Iml细胞加入I μ I BATDA, 37°C，5%C02培养箱中放置15min。然后200g，离心5min，弃去上清，用含2%FBS的PBS洗涤5次，每次200g离心5min。最后用1640完全培养基重悬细胞，并调整细胞数为5 X 104cells/ml。
[0131]通过如实施例9描述的方法向DCs的培养液中分别加入适当浓度的抗原，包括抗原肽和抗原肽2来刺激DCs，然后利用得到的荷载了所述抗原肽的DCs来刺激自身的T细胞。
[0132]收集已被刺激的CD8+T细胞，1000rpm离心，弃上清，用1640完全培养基重悬CD8+T细胞，调整细胞数到lX106cells/ml。
[0133]取100 μ I CD8+T细胞和100 μ I肿瘤细胞(BATDA-loaded)加入至Ij 96孔板中。同时设立空白对照组(培养基对照)，肿瘤细胞自发释放组(100 μ I肿瘤细胞+100 μ I培养基)和肿瘤细胞最大释放组(10 μ I裂解液+90 μ I培养基+100 μ I肿瘤细胞)，τ细胞设立未刺
激组。实验组需要设立3个重复孔。
[0134]将96孔板放于37°C，5%C02培养箱中培养2h后，200g离心5min，吸取20 □ I上清到Elisa板中(试剂盒自带),并加入200 □ I Europium Solution,室温水平摇动15min。使用PerkinElmer公司的检测仪器(Victor2V multilabel counter)进行检测,激发滤光片(emission filter)选择 615nm。
[0135]实验结果的计算:
[0136]
实駿嫌—胂瘤細胞自犮释放組
攻击效果(%) = --- X 1001
肿瘤细胞最大释放組一I+瘤细胞自发释放组
[0137]结果如图1Oa和图1Ob所示。其中图1Oa中显示的是使用抗原肽荷载DCs后攻击肿瘤细胞的结果，图1Ob为使用抗原肽2荷载DCs后攻击肿瘤细胞的结果。
[0138]实验结果显示，负载抗原(包括抗原肽和抗原肽2)的DCs刺激的T细胞都可以杀伤MUCl 蛋白阳性的 SMMC-7721 和 SMMC-7721-0201。其中杀伤 SMMC-7721-0201 细胞(HLA-A2+，MUCl+)的能力要高于SMMC-7721细胞(HLA_A2_，MUC1+)。证明本发明的抗原肽更有效攻击HLA-A2阳性细胞。
[0139]实施例14动物实验:荷载了抗原肽的DCs在小鼠体内抑制肿瘤
[0140]1.构建稳定表达MUCl蛋白的B16 (用于动物实验)细胞系[0141]B16为可商购的小鼠黑色素瘤细胞株(ATCC CAT.N0.CRL-6322)。含MUCl基因的质粒购自 Origene 公司(Cat.N0.RC221390)。
[0142]用0.25%胰蛋白酶消化B16细胞，并用1640完全培养基(含10%FBS和1%青-链霉素)吹散细胞。然后取适量细胞铺在24孔板中(共接种三个孔)，36h后利用脂质体转染法转染含MUCl基因的质粒进入B16细胞中(质粒为0.5 μ g/孔)。第二天用0.25%胰蛋白酶消化转染后的细胞，分接到所有的24个孔中，继续培养。第三天换液，加入含1.2mg/mlG418的1640完全培养基继续培养。
[0143]每天观察细胞的死亡情况，隔天换液；四天后存活细胞逐渐稳定，对细胞进行有限稀释，接种到96孔板中，细胞量为0.5个细胞/孔(接10-20块96孔板)。观察96孔板中细胞的生长状况，寻找单克隆细胞，并做下标记。对已长满细胞孔的单克隆细胞进行扩大培养，收集细胞后采用如前所述的Western方法鉴定MUCl阳性的细胞。对鉴定阳性的细胞进行扩大培养并冻存。
[0144]图11中，第I泳道为未转染的B16细胞株，第2泳道为MUC1-4单克隆细胞，第3泳道为MUC1-6单克隆细胞。
[0145]从图11结果看，MUC1-4和MUC1-6 二株单克隆细胞有明显条带，检测为阳性。所以确定MUC1-4和MUC1-6 二株单克隆细胞为稳定表达MUCl蛋白的B16细胞系。
[0146]2.动物实验
[0147]实验小鼠(C57BL/6小鼠，6_8周龄)分为两组:治疗组和免疫保护组。其中治疗组为先给予小鼠肿瘤细胞，然后给予本发明的多肽(分别为抗原肽和抗原肽2)。其中免疫保护组为先给予小鼠本发明的多肽(分别为抗原肽和抗原肽2)，然后给予肿瘤细胞。
[0148]治疗组:实验小鼠共32只，分为4组，每组8只，并标记为A、B、C、D。其中A组8只小鼠注射B16细胞，剩余3组都注射B16-MUC1-4细胞。接种部位为前肢右腋皮下，每只小鼠注射I X IO4细胞，剂量为200 μ I。一周后开始注射多肽，A和B两组共16只小鼠注射PBS，C和D两组分别注射两种多肽:抗原肽和抗原肽2，每只小鼠注射40 μ g/100 μ I。以后二周各组每周再重复注射一次同样的多肽，剂量相同，每天观察小鼠肿瘤生长情况，并记录数据。
[0149]图12a为抗原肽在小鼠体内治疗肿瘤效果。
[0150]其中，
[0151]B16_g:A 组，注射 B16 细胞；
[0152]B16-mg:B 组，注射 B16-MUC1-4 细胞；
[0153]B16-mg53:C 组，注射 B16-MUC1-4 细胞和抗原肽 2 ；
[0154]B16-mg64:D 组，注射 B16-MUC1-4 细胞和抗原肽；
[0155]由于B16_g和B16_mg两组结果相同，所以线条重叠。
[0156]图12b为抗原肽2在小鼠体内免疫预防肿瘤效果。
[0157]其中
[0158]B16_g:E 组，注射 B16 细胞；
[0159]B16-mg:F 组，注射 B16-MUC1-4 细胞；
[0160]B16-mg53:G 组，注射 B16-MUC1-4 细胞和抗原肽 2 ；
[0161]B16-mg64:H 组，注射 B16-MUC1-4 细胞和抗原肽。[0162]从实验结果得出，和对照组比较，注射多肽组的小鼠能够延长寿命超过两周。给予抗原肽和抗原肽2之间的比较，以给予抗原肽组小鼠的存活率高。从实验分组上比较，注射多肽组中，免疫组小鼠的存活率比治疗组高。
[0163]以上各实验结果表明，本发明提供的多肽，包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的抗原肽和其片段，包括其连续8-10个氨基酸，特别是连续10个氨基酸的片段(例如多肽FLLLLLTVLT, LLLLLTVLTV, LLLLTVLTVV, FFLLLLLTVL, GTQSPFFLLL, TQSPFFLLLL),能够有效地刺激肿瘤特异性的DCs的成熟，而且荷载了抗原肽的DCs能够有效的加工呈递肿瘤抗原，并激活肿瘤细胞特异性的抗肿瘤细胞免疫应答，其中包括刺激T细胞的增殖、激活肿瘤细胞特异的CTLs和刺激T细胞分泌细胞因子IFN Y等。
[0164]不受任何理论限制的，发明人探讨了本发明的抗原多肽的治疗和预防作用。计算辅助方法在近年已经成为一种成熟的，有效的和高效的分析蛋白或多肽结构和功能的方法，已被广泛应用于包括分析抗原表位的蛋白分析和预测中。本领域技术人员能总结和根据蛋白的结构功能研究，鉴定对于活性或结构重要的相似多肽中的残基，从而预测蛋白质中氨基酸残基的作用，进而分析蛋白质氨基酸序列的活性和功能。计算辅助方法在近年已经成为一种比较成熟的，有效的和高效的确定抗原表位方法。计算辅助确定抗原表位通过对现有数据的整理、分析，根据得到的规律建立表位活性模型，通过计算机方法分析和预测具有抗原性的表位的序列和其与抗原或MHC的结合活性。
[0165]一般说来抗原性识别区域具备亲水、位于蛋白表面和结构上易变形性等特点。因为在大多数的天然(自然)环境中，亲水区域倾向于集中在蛋白表面，而疏水区域常常被包裹在蛋白内部，同样道理，抗体只能与在蛋白表面发现的识别区域相互作用，而当这些识别区域有足够的结构易变形性而转移到抗体可接触的位置时，将会与抗体间有很高的亲和性。连续的与不连续的 识别区域是由连续或不连续的氨基酸序列(残基)构成的识别区域。很多抗体是针对连续识别区域的表位，抗体能与这类表位以很高的亲和力相结合。不连续的识别区域是代表有一定折叠的一段多肽序列，或是将两段分离开的多肽连在一起的抗体的识别区域。在某些情况下，针对这样不连续识别区域的抗体也能产生，但这些抗原多肽具备与该不连续识别区域相似的二级结构，而序列的长度需要符合相关的要求。表位的长度通常在8-20个氨基酸残基之间。
[0166]应用生物信息学方法分析，用表位预测网站如http: //www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/ ；http://www.epitope-1nformatics.com/Links.htm ；http://bi0.dfc1.harvard.edu/Tools/index.html 等，以及 SYFPEITHI, BIMAS, IMMUNEEPITOPE, MHC2PRED等多种软件对本发明的抗原肽进行了分析。
[0167]通过上述手段分析了不同HLA-A，-B, -C与本发明的抗原肽或其片段及其表位序列变异体的结合力的差异，特别是HLA A2分子与HLA A3分子，发现在本发明的所述抗原肽(SEQ ID NO:1)中存在具有高效激活ra8+T细胞的表位，包括其连续8-10个氨基酸，特别是连续 10 个氨基酸的片段(例如多肽 FLLLLLTVLT，LLLLLTVLTV, LLLLTVLTVV, FFLLLLLTVL,GTQSPFFLLL, TQSPFFLLLL等)，以及在所述抗原肽中存在具有高效激活CD4+T细胞的表位，包括:MTPGTQSPFF LLLLLTVLTV VTGS、MTPGTQSPFF LLLLL 和 SPFF LLLLLTVLTV VTGS 等。这些表位在 HLA A2(包括 A*0201、A*0202、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207 和 A*0208)与 HLAA3(包括A*0301、A*1101、A*3101和A*6801)中与HLA分子的结合力较高。[0168]本发明出乎意料地发现了 SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的抗原肽和其片段，包括其连续8-10个氨基酸，特别是连续10个氨基酸的片段(例如多肽FLLLLLTVLT，LLLLLTVLTV, LLLLTVLTVV, FFLLLLLTVL, GTQSPFFLLL, TQSPFFLLLL)，能够有效地刺激肿瘤特异性的DCs的成熟，而且荷载了抗原肽的DCs能够有效的加工呈递肿瘤抗原，并激活肿瘤细胞特异性的抗肿瘤细胞免疫应答，在动物体内能有效地治疗或预防肿瘤。因此，本发明提供了肿瘤多肽抗原作为癌症疫苗的应用。同时，本发明提供了所述多肽有效地致敏树突状细胞得到的DC肿瘤疫苗，或用上述肿瘤多肽抗原致敏的树突状细胞激活T细胞而制成的T细胞肿瘤疫苗，以及直接应用这些多肽或组合物为肿瘤疫苗的制备方法及用途。[0169]除非另外指出，本发明的实践将使用生物技术、有机化学、无机化学等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。本文所提到的所有专利、专利申请与科技论文均据此通过引用结合到本文。
【权利要求】
1.一种分离的多肽或其变体，所述多肽包含与下列(a)或(b)的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列: (a)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列； (b)所述(a)的氨基酸序列的片段。
2.权利要求1的多肽或其变体，其中(b)中所述片段为包含SEQID NO:1所示的氨基酸序列中连续10个氨基酸的片段。
3.权利要求2的多肽或其变体，所述片段具有LLLLLTVLTV的氨基酸序列。
4.权利要求1-3中任一项的多肽或其变体，所述片段可结合HLAI分子并被CD8+T细胞识别。
5.权利要求4的多肽或其变体，其中所述HLAI为HLA A2或HLA A3型，优选为HLAA2,更优选为 A*0201 或 A*0202。
6.一种分离的核酸，其基本上由编码权利要求1-5中任一项的多肽的碱基序列组成。
7.抗原呈递细胞，其可在细胞表面呈递权利要求1-5中任一项的多肽或其变体，优选的，所述抗原呈递细胞为树突细胞。
8.免疫效应细胞，其可识别权利要求1-5中任一项的多肽或其变体或在细胞表面呈递权利要求1-5中任一项的多肽或其变体的抗原呈递细胞，优选的，所述免疫效应细胞为T细胞，例如CD8+T细胞。
9.产生抗原呈递细胞的方法，所述方法包括将权利要求1-5中任一项的多肽或其变体与具有抗原呈递能力的细胞接触的步骤，或是包括将权利要求6中的核酸在具有抗原呈递能力的细胞中表达的步骤，优选的，所述具有抗原呈递能力的细胞为树突细胞。
10.产生免疫效应细胞的方法，所述方法包括将权利要求7的抗原呈递细胞与具有免疫效应能力的细胞接触的步骤，优选的，所述抗原呈递细胞为树突细胞，以及，优选的，其中所述免疫效应细胞为T细胞，例如cd8+t细胞。
11.一种在患者中治疗或预防癌症的疫苗或药物组合物，其包括权利要求1-5中任一项的多肽或其变体，或包括权利要求6的核酸，或包括权利要求7的抗原呈递细胞，或包括权利要求8的免疫效应细胞。
12.权利要求11的疫苗或药物组合物，其中所述患者的HLA为HLAI型，优选为HLA A2或HLA A3型，优选为HLA A2型，更优选为A*0201或A*0202型。
13.权利要求11或12的疫苗或药物组合物，其中所述癌症为血癌、实体瘤等，优选为肺癌、恶性淋巴瘤(例如网状细胞肉瘤、淋巴肉瘤、霍奇金病等)、消化器官癌(例如胃癌、胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、直肠癌等)、乳腺癌、卵巢癌、肌与骨骼肉瘤(例如骨肉瘤等)、膀胱癌、白血病(例如急性白血病，包括慢性髓细胞性白血病急性发作)、肾癌、前列腺癌。
14.权利要求1-5中任一项的多肽或其变体,或权利要求6的核酸,或权利要求7的抗原呈递细胞，或权利要求8的免疫效应细胞在用于制备治疗或预防癌症的疫苗或药物组合物中的用途。
【文档编号】A61P35/00GK103570821SQ201310320478
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年7月27日 优先权日:2012年7月27日
【发明者】谢雍, 杜琳 申请人:北京智飞绿竹生物制药有限公司