特异性靶向的磁共振‑光学双模成像探针及其制备方法与流程

本发明属于纳米材料加工应用技术领域，更具体地涉及一种特异性靶向的磁共振-光学双模成像探针及其制备方法。

背景技术：

目前临床上常用的诊断肝癌的影像手段主要有多层螺旋CT(MDCT)、磁共振成像(MRI)、正电子发射计算机断层显像(PET-CT)成像和超声(US)等，它们各有优劣势。PET-CT成本高、普及面窄；US成像深度不足；CT成像较为快捷、相对便宜和无深度限制，但它的软组织分辨率不高且有电离辐射的风险；MRI相对于CT的优势在于它良好的软组织分辨率和无电离辐射，对于微小肿瘤的辨别能力电优于CT。MRI是临床上术前诊断肝癌的较为理想的影像手段，但是它无法术中实时导航手术。荧光成像是近年新兴的成像手段，有可能给肿瘤外科带来突破性进展，它的优点是成本低，方便快捷，敏感性高，能够实时导航外科手术，缺点是组织穿透深度不够。事实上，不论是MRI和CT，还是荧光和PET成像，单一模态都各有优劣，无法全面精准获取肿瘤诊断信息。为了能够同时获取诊治肿瘤的整体与局部影像信息，实现术前与术中诊疗一体化，两种或两种以上成像模态结合即多模成像因其能整合各成像模态的优势正成为科学家们研究的热点，也是未来的发展方向。据文献报道，近年来在探索恶性肿瘤精准诊疗时发现，关键环节是成像靶点的选择和高效特异性分子探针的合成。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种特异性靶向的磁共振-光学双模成像探针及其制备方法，以期至少解决上述现有技术中存在的问题之一。

根据本发明的一方面，提供一种特异性靶向的磁共振-光学双模成像纳米探针，单位纳米探针包括：

脂质体包覆纳米四氧化三铁形成的第一结构；

第一结构负载ICG后形成的第二结构；

第二结构由聚乙二醇修饰后与RGD靶点链接形成的终态结构。

根据本发明的另一方面，提供一种特异性靶向的磁共振-光学双模成像纳米探针的制备方法，包括：

步骤一：制备羧化的四氧化三铁纳米粒子；

步骤二：制备空白脂质体；

步骤三：将羧化的四氧化三铁纳米粒子加热至脂质体的相变温度，与空白脂质体混合，得到磁性脂质体溶液；

步骤四：利用聚乙二醇溶液修饰磁性脂质体溶液，加入靶点RGD，形成混合溶液；

步骤五：在步骤四的混合溶液中加入ICG溶液。

进一步的，步骤一中，制备羧化的四氧化三铁纳米粒子包括：在N₂保护环境下，利用FeSO₄·7H₂O和FeCL₃·6H₂O为原料，采用氧化沉淀法在溶液中合成油酸化的四氧化三铁，采用DMSA取代油酸合成水溶性的羧化四氧化三铁纳米粒子。

进一步的，所述FeSO₄·7H₂O和FeCL₃·6H₂O的摩尔比为1∶2，氧化沉淀法的温度为120～150℃。

进一步的，步骤二中，制备空白脂质体包括：利用胆固醇和卵磷脂为原料，采用真空旋转蒸发的方法，得到布满一容器底部的空白脂质体。

进一步的，所述真空旋转蒸发的旋转速度为40～60转/分钟、蒸发温度40～60℃。

进一步的，步骤三和步骤四之间还具有中间步骤：将磁性脂质体溶液经脂质体挤压器挤压后，利用光谱分析法测量磁性脂质体内四氧化三铁的浓度，离心浓缩后要求设定浓度以上。

进一步的，步骤四具体包括：利用聚乙二醇DSPE-PEG-NH₂溶液修饰磁性脂质体溶液中，加入靶点RGD，利用RGD与NH₂之间的共价耦合作用将其紧密连接。

进一步的，步骤五中，所述聚乙二醇溶液的用量为每mg磁性脂质体纳米粒子加入1mL聚乙二醇溶液中。

进一步的，，步骤五具体包括：在步骤四的混合溶液中加入ICG溶液0.5-3mg/mL，被动吸附后，旋转离心，除去游离的ICG分子。

通过上述技术方案，本发明的成像探针及其制备方法至少具有下述有益效果之一：

1、本发明所涉及的制备方法简便容易操作，纳米粒子具有粒径小，稳定性好，生物相容性好，单分散性良好等优点；

2、本发明所制备的双模成像纳米粒子具有稳定的磁性和荧光特性、具有良好的主动靶向性；

3、本发明所用原材料ICG是经美国FDA(食品药品监督管理局)官方认证可直接适用于人体的近红外染料。SPIO经美国FDA官方认证已作为T2(加权成像)造影剂应用于临床实践。Liposome合成的原料主要为卵磷脂和胆固醇，生物相容性好。RGD是一种生物多肽，原料安全系数高；在探针合成过程中，无有毒、腐蚀性制剂的添加；综上所述，新合成的特异性靶向的MRI-光学双模探针SPIO@Liposome-ICG-RGD具有良好的生物相容性和广阔的临床转化前景；

4.影像诊断是临床上辅助肿瘤患者手术治疗的最重要的手段，本发明特异性靶向的MRI-光学双模成像探针具有双重应用功能。。

附图说明

图1为根据本发明的具体实施方式的一种磁共振-光学双模成像探针的制备方法流程图；

图2A-2C为实施例2靶向肝脏肿瘤的一种磁共振-光学双模成像探针(SPIO@Liposome-ICG-RGD)在裸鼠体内的荧光信号检测图的患有皮下肝癌裸鼠图、双模成像纳米探针的近红外荧光信号峰与裸鼠本身的背景信号峰分离图、以及以及探针注入后成像图；

图3A-3C分别为实施例2的无靶向功能的磁共振-光学双模成像纳米探针(SPIO@Liposome-ICG)制剂在裸鼠体内的荧光信号检测图中的患有皮下肝癌裸鼠图、双模成像纳米探针的近红外荧光信号峰与裸鼠本身的背景信号峰分离图、以及探针注入后成像图；

图4A-4D分别为实施例3的靶向肿瘤的SPIO@Liposome-ICG-RGD纳米探针结合1T的小动物核磁共振和近红外荧光手术导航仪，术者在为皮下肝癌裸鼠完成荧光导航手术的探针注入前的MRI成像图、探针注入后的MRI成像图、探针荧光导航发现微小病灶残留图、和荧光导航下根治手术图。

具体实施方式

本发明实施例的一方面提供一种特异性靶向的磁共振-光学双模成像纳米探针，其中单位纳米探针包括：

脂质体包覆纳米四氧化三铁形成的第一结构(参见图1中A所示)；

第一结构负载ICG(吲哚菁绿，Indocyanine Green)后形成的第二结构。(参见图1中B所示)；

第二结构由聚乙二醇修饰后与RGD靶点链接形成的终态结构(参见图1中C所示)。

第一结构中包含有脂质体和纳米四氧化三铁，其中，超顺磁性的纳米氧化铁(SPIO)因其高灵敏性核磁信号，无毒性及良好的生物相容性在MRI的T2成像中得到了良好的应用。脂质体Liposome合成的原料主要为卵磷脂和胆固醇，生物相容性好。

第一结构负载ICG后形成的第二结构。ICG是经美国FDA认证的可直接用于人体的近红外荧光染料，激发波长805nm，发射835nm，能够很好的排除自身荧光的干扰，常被用来荧光成像，且ICG与脂质体(liposome)结合后荧光量子产率增加。

第二结构由聚乙二醇修饰后与RGD靶点链接形成的终态结构。由于整合素αvβ3受体在正常肝细胞中阴性表达，在Hep-G2肝癌细胞中是高表达。环状RGD多肽是一种含有精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸序列的小肽，可以特异性识别整合素αvβ3受体。

所以，该实施例提供的特异性靶向的磁共振-光学双模探针SPIO@Liposome-ICG-RGD具有良好的生物相容性和显影性。

本发明实施例的另一方面还提供一种特异性靶向的磁共振-光学双模成像纳米探针的制备方法，包括：

步骤一：制备羧化的四氧化三铁纳米粒子；

步骤二：制备空白脂质体；

步骤三：将羧化的四氧化三铁纳米粒子加热至脂质体的相变温度，与空白脂质体混合，得到磁性脂质体溶液；

步骤四：利用聚乙二醇溶液修饰磁性脂质体溶液，加入靶点RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽，Arg-Gly-Asp(RGD)sequence)，形成混合溶液；

步骤五：最后在步骤四的混合溶液中加入ICG溶液，。

优选的，制备羧化的四氧化三铁纳米粒子包括：在N₂保护环境下，利用FeSO4·7H₂O和FeCL3·6H₂O为原料，采用氧化沉淀法在溶液中合成油酸化的四氧化三铁，采用DMSA(二巯丁二酸，dimercaptosuccinic acid)取代油酸合成水溶性的羧化四氧化三铁纳米粒子。

进一步优选的，所述FeSO₄·7H₂O和FeCL₃·6H₂O的摩尔比为1∶2，氧化沉淀法的温度为120～150℃。

优选的，步骤二中，制备空白脂质体包括：利用胆固醇和卵磷脂为原料，采用真空旋转蒸发的方法，得到布满一容器底部的空白脂质体。

进一步优选的，所述真空旋转蒸发的旋转速度为40-60转/分钟、蒸发温度40-60℃。

优选的，步骤三和步骤四之间还具有中间步骤：

将磁性脂质体溶液经脂质体挤压器挤压后，利用光谱分析法测量磁性脂质体内四氧化三铁的浓度，离心浓缩后要求设定浓度(例如1mg/mL)以上。

优选的，步骤四具体包括：利用聚乙二醇DSPE-PEG-NH₂(WM3500)溶液修饰磁性脂质体溶液中，加入靶点RGD，利用RGD与NH₂之间的共价耦合作用将其紧密连接。

优选的，步骤五中，所述聚乙二醇溶液的用量为每mg磁性脂质体纳米粒子加入1mL聚乙二醇溶液中。

优选的，在步骤四的混合溶液中加入ICG溶液0.5-3mg/mL，被动吸附后，旋转离心，除去游离的ICG分子。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

请参考图1，为本发明靶向肿瘤的一种特异性靶向的MRI-光学双模成像探针的制备方法流程图，具体地，其步骤如下：

步骤1：在N₂保护环境下，利用FeSO₄·7H₂O和FeCL₃为原料，采用氧化沉淀法在135℃溶液中合成油酸化的四氧化三铁，采用DMSA取代油酸合成水溶性的羧化四氧化三铁纳米粒子；配制浓度为2mg/mL，备用；

步骤2：利用胆固醇和卵磷脂为原料，采用真空旋转蒸发的方法(转速：40转/分钟、温度：40℃)，得到布满圆底烧瓶底部的空白脂质体；

步骤3：将羧化的四氧化三铁纳米粒子加热至脂质体的相变温度(约60℃)，加入空白脂质体的圆底烧瓶内，水化脂质体，得到磁性脂质体溶液；

步骤4：将磁性脂质体溶液经1ml容量的脂质体挤压器挤压后，利用光谱分析法测量磁性脂质体内四氧化三铁的浓度，离心浓缩后要求达到1mg/mL；

步骤5：利用聚乙二醇DSPE-PEG5000-NH₂溶液修饰磁性脂质体溶液中，加入靶点RGD，利用RGD与NH2之间的共价耦合作用将其紧密连接；

步骤6：最后在步骤5的混合溶液中加入ICG溶液，被动吸附后，旋转离心(转速)，除去游离的ICG分子。

实施例2

将实施例1制备得到的特异性靶向的MRI-光学双模成像纳米探针，用10Kd的超滤管将上述溶液进行超滤，然后用超纯水洗涤3次，然后用PBS液稀释得到浓度为1mg/mL近红外主动靶向探针制剂。此纳米制剂中的纳米颗粒的平均粒径为150纳米。

将浓度为1mg/mL的上述近红外双模成像探针荧光纳米探针制剂注射入患有皮下肝癌裸鼠体内(参见图2A所示)进行核磁和荧光检测，检测结果如图2B和图2C所示。从图2B中可以看出，该双模成像纳米探针的近红外荧光信号峰与裸鼠本身的背景信号峰分离的很好，肿瘤区域和肿瘤周围正常组织的对比度达到近3倍，这样背景干扰就小，可以给术者提供清晰的肿瘤位置和精确的肿瘤边界，调肿瘤的检测率、切除率。从右图中可以看出，该探针注入后，肿瘤区域明显变暗，说明核磁T2相成像效果好，有助于术前诊断

将浓度为1mg/mL的上述不带靶点的近红外双模成像探针荧光纳米探针制剂注射入患有皮下肝癌裸鼠体(参见图3A所示)内进行核磁和荧光检测，检测结果如图3所示。从图3B中可以看出，该双模成像纳米探针的近红外荧光信号峰与裸鼠本身的的背景信号峰依旧有区别，但不及带靶点RGD的探针组，肿瘤区域和肿瘤周围正常组织的对比度达到才1倍，这样背景干扰大，导航手术效果差。从图3C中可以看出，该探针注入后，肿瘤区域明显变暗不明显。

实施例3

将上述实施例2中得到的浓度为1mg/mL的双模成像纳米探针制剂注射入患有原位肝癌裸鼠体内进行诊疗一体化研究，并在MRI和近红外荧光手术导航仪辅助下，术者完成实时术前诊断和术中荧光导航手术切除肿瘤，在术前诊断评估，通过术前MRI扫描获取肿瘤的宏观信息，主要包括肿瘤的部位、大小、数目，肿瘤与肝脏内血管、胆管的关系，明确肿瘤的分期，制定适合该患者的个体化治疗方案；在术中实时导航，通过术中荧光成像，能够探查出肉眼不能确定和不能识别的微小残余病灶，血管浸润病灶，增加手术的彻底性，减少复发概率，改善患者的预后。该探针的研发有望整合术前成像和术中导航，实现肝癌患者的诊疗一体化。手术实施过程如图4A-4D所示(其中，图4A为MRI成像前，图4B为MRI成像后，图4C为探针荧光导航发现微小病灶残留；图4D为荧光导航下根治手术)，在主动靶向双模成像探针、MRI和荧光手术导航仪的辅助下，术者术前可以精准明确肿瘤的大小和位置，术中荧光可以辅助精确的定位肿瘤边界，并参考客观的荧光肿瘤边界进行肿瘤的完全切除，即使是对于亚毫米的残余病灶，术者依靠近红外荧光信号，同样的能够进行精准的手术切除，减少手术残癌率和手术切缘阳性率，整体上实现了诊疗一体化的效果。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。