本发明涉及医用生物材料技术领域，具体涉及一种医用脱细胞真皮基质及其制备方法。
背景技术：
对于大面积烧伤或者创伤的病人来说，皮肤移植是最好的治疗方法，但是对于烧伤面积特别巨大的创面采用自体全厚皮移植几乎不可能，而自体微粒皮或薄皮片移植需要真皮支架。来源于人的尸体皮制作的无细胞真皮作为真皮替代物最为理想，但是由于伦理和hiv等病毒的原因，大大限制了其应用。目前，根据实践和临床的使用证实脱细胞真皮基质是一种新型的创伤修复材料，其应用领域从最初的深度烧伤创面的治疗逐渐扩展到整形、美容、口腔、耳鼻喉、普外科等领域。
脱细胞真皮基质制备的目的是尽可能的去除皮肤组织中免疫原性很强的细胞成分（表皮细胞、毛囊、皮脂腺、汗腺及真皮中的血管内皮细胞、成纤维细胞等），保留免疫原性较弱的细胞外基质成分以及真皮组织完整的三维空间结构。这样能提供引导组织再生的生物支架，达到最大限度修复组织缺损的目的。目前脱细胞真皮基质的制备方法主要有一下几种：1、dispaseii-triton法：该方法细胞脱除彻底，但是对基底膜破坏大，不利于上皮细胞的粘附与生长；2、高渗盐-sds法：该方法基底膜保留完整，但真皮中纤维结合素、弹力素等含量较高，因此可能会有较高的免疫原性；3、高渗盐-氢氧化钠销蚀法：该方法利用高渗盐去除表皮，同时利用氢氧化钠中碱离子的吸水作用，夺去组织细胞中的水分，使细胞脱水，该方法胶原纤维结构完整，排列较正常疏松，但是对于细胞的去除效果仍有待提高；4、反复冻融法，由于全部都是物理操作过程，时间久、周期长，现在基本已经不用。
以上方法中，作用手段单一，处理时间过短，无法将免疫原性物质全面清除，如果作用时间过长，又会造成基底膜破坏，并有可能造成完整细胞骨架的缺失。同时，人工物理手法去除猪毛，费时费力，占用生产者大量工时。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种医用脱细胞真皮基质的制备方法，既能够有效降低真皮基质的免疫原性，又保留了真皮基质正常的胶原结构，同时使用无毒化学试剂，有效去除动物毛发，处理过程省时省力，节约生产成本，又不会造成环境污染。
同时，本发明还在于提供一种采用本发明制备方法制备的医用脱细胞真皮基质。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种医用脱细胞真皮基质的制备方法，包括以下操作步骤：
1）将新鲜动物皮肤去肉后，依次进行消毒、清洗、高渗盐处理，撕去表皮，得待处理真皮皮片；
2）将步骤1）制得的真皮皮片放入碱液和过氧化氢的混合溶液中浸泡3~24小时；
3）将步骤2）处理后的真皮皮片进行裁切、剖片后浸泡在含有胰蛋白酶的溶液中，在35~40℃温度下，ph7~9，浸泡1~12小时；
4）将步骤3）处理后的真皮皮片清洗后，冷冻存放，即完成。
步骤1）中所述动物皮肤为猪皮、羊皮或牛皮。
上述制备方法还包括将步骤3）处理后的真皮皮片浸泡在交联剂中进行室温交联1~24小时。酶消化后进行交联处理，避免胶原蛋白在胰蛋白酶溶液中降解过度，造成的胶原蛋白网络结构和排列方式的损坏，确保真皮基质结构的完整性，在降低产品的硬度，使产品更加柔软贴合皮肤的同时，使产品具有一定的抗张强度，满足医用敷料的要求。而且交联剂的使用还会进一步的封闭抗原，减少免疫反应，还可以提高产品的收缩温度。
可选的，所使用的交联剂的配制方法是将碳化二亚胺盐酸盐和琥珀酰亚胺加入到含有体积百分含量为40%的乙醇水溶液中，ph5.5，搅拌均匀。
可选的，所使用的交联剂中各组分的质量浓度为：碳化二亚胺盐酸盐为0.15%-2.0%，琥珀酰亚胺浓度为0.05%-0.5%。
优选的，所使用的交联剂中各组分的质量浓度为：碳化二亚胺为0.5%，琥珀酰亚胺为0.2%。
可选的，步骤2）中混合溶液中碱的浓度为2~6%；过氧化氢的浓度为0.5~5%。
可选的，所述碱为氢氧化钠和/或氢氧化钾。
为了确保碱液和过氧化氢溶液对真皮皮片上的毛发的去除效果，以及对皮片中蛋白纤维的膨胀疏松效果，同时避免对皮片胶原空间结构和排列方式的破坏，优选的，步骤2）中混合溶液中氢氧化钠的浓度为4%，过氧化氢的浓度为2%，在混合溶液中的浸泡时间为18小时。
可选的，步骤3）中胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的浓度为0.05~0.5%。
可选的，所述胰蛋白酶为医药级胰蛋白酶。
为了在确保胰蛋白酶对多余的脂肪和免疫活性杂蛋白进行消解的同时，避免胰蛋白酶对皮片中胶原蛋白空间结构的破坏，避免胶原蛋白发生分解或溶解在胰蛋白酶溶液中，进一步优选的，所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的浓度为0.1%，在胰蛋白酶溶液中的浸泡时间为2小时。
可选的，步骤3）中裁切为将真皮皮片裁切成长*宽*厚=10cm~80cm*10cm~80cm*0.2mm~1.0mm大小的皮片。
可选的，步骤1）中消毒的具体方法为：将新鲜动物皮肤去肉后，浸泡入浓度为0.5~1.0%的消毒液中消毒处理30~60分钟。
可选的，所述消毒液为苯扎溴铵或过氧乙酸。
进一步，优选的，所述消毒液为浓度为0.5%的苯扎溴铵，浸泡在消毒液中的处理时间为30分钟。采用消毒液对皮肤表面进行病毒灭活和杀菌处理。
可选的，步骤1）中所述清洗的具体方法为：采用浓度为0.1~2%的表面活性剂溶液对消毒处理后的动物皮肤清洗2~3次，每次0.5~2小时。通过表面活性剂的作用，去除皮肤表面的油污和脂肪。
可选的，所述表面活性剂为烷基聚氧乙烯醚、十二烷基硫酸钠、烷基糖苷中的一种或多种。
优选的，所述表面活性剂为apg1214或apg1216。
进一步优选的，所述表面活性剂溶液为浓度为1%的apg1214溶液。
可选的，步骤1）中高渗盐处理的具体方法为：将待处理动物皮肤浸泡在浓度为0.8~2.0mol/l的氯化钠溶液中4~24小时。
优选的，步骤1）中高渗盐处理过程中采用的氯化钠的浓度为1.0mol/l，浸泡时间为24小时。通过高浓度盐水打断上皮细胞和结缔组织之间的半桥粒结构。
可选的，步骤4）中所述清洗为采用无菌纯水对步骤3）处理后的真皮皮片进行冲洗4~12小时。
可选的，步骤4）中所述的冷冻存放为冻存在-80℃的环境下。
本发明医用脱细胞真皮基质的制备方法，通过创造性将碱液和过氧化氢形成混合溶液对高渗盐处理后的真皮皮片进行处理，在采用碱液使皮片中纤维膨胀和疏松的同时，采用化学浸泡的方式通过碱液和过氧化氢的协同作用直接去除毛发，省去人工去除毛发的过程，简化工艺流程，提升生产效率，节约生产成本，同时使用的试剂无毒，不会造成环境污染；
同时，本发明制备方法在碱液和过氧化氢对皮片进行去毛和纤维膨胀、疏松处理后，再进行胰蛋白酶消化处理，进一步去除多余的脂肪和具有免疫活性的杂蛋白，去除皮片中残留的细胞，同时通过酶消化后进行交联处理，避免胶原蛋白在胰蛋白酶溶液中降解过度，造成的胶原蛋白空间网络结构和排列方式的损坏，确保真皮基质结构的完整性，在降低产品的硬度，使产品更加柔软贴合皮肤的同时，使产品具有一定的抗张强度，满足医用敷料的要求。而且交联剂的使用还会进一步的封闭抗原，减少免疫反应，还可以提高产品的收缩温度。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种医用脱细胞真皮基质的制备方法，包括以下操作步骤：
1）将新鲜猪皮皮肤去肉后，浸泡入浓度为0.5%的苯扎溴铵溶液中消毒处理30分钟；
2）将步骤1）消毒处理后的动物皮肤浸泡入浓度为1%的apg1214溶液中，清洗3次，每次清洗2小时；
3）将步骤2）清洗后的动物皮肤浸泡入浓度为1mol/l的氯化钠溶液中，浸泡24小时，打断上皮细胞和结缔组织之间的半桥粒，撕去表皮，得待处理真皮皮片；
4）将步骤3）制得的待处理真皮皮片放入含有4%的氢氧化钠和2%过氧化氢的混合溶液中，浸泡18小时；
5）将步骤4）处理后的真皮皮片裁切成长*宽*厚=10cm~80cm*10cm~80cm*0.2mm~1.0mm大小的皮片；
6）将步骤5）裁切后的皮片浸泡在含有0.1%胰蛋白酶的溶液中，在37℃温度下，ph7~9，浸泡2小时；
7）将碳化二亚胺盐酸盐和琥珀酰亚胺加入到含有40%（v/v）乙醇的水溶液中，ph5.5，搅拌均匀，得含有0.5%的碳化二亚胺和0.1%的琥珀酰亚胺的交联剂溶液，然后将步骤6）处理后的皮片浸泡在交联剂溶液中，室温交联处理6小时；
8）将步骤7）处理后的皮片采用无菌纯水冲洗7小时后，排放整齐，冻存在-80℃的冰箱中。
实施例2
一种医用脱细胞真皮基质的制备方法，包括以下操作步骤：
1）将新鲜猪皮皮肤去肉后，浸泡入浓度为0.8%的过氧乙酸溶液中消毒处理45分钟；
2）将步骤1）消毒处理后的动物皮肤浸泡入浓度为0.1%的apg1216溶液中，清洗3次，每次清洗1小时；
3）将步骤2）清洗后的动物皮肤浸泡入浓度为0.8mol/l的氯化钠溶液中，浸泡12小时，打断上皮细胞和结缔组织之间的半桥粒，撕去表皮，得待处理真皮皮片；
4）将步骤3）制得的待处理真皮皮片放入含有2%的氢氧化钠和0.5%过氧化氢的混合溶液中，浸泡24小时；
5）将步骤4）处理后的真皮皮片裁切成长*宽*厚=10cm~80cm*10cm~80cm*0.2mm~1.0mm大小的皮片；
6）将步骤5）裁切后的皮片浸泡在含有0.05%胰蛋白酶的溶液中，在40℃温度下，ph7~9，浸泡12小时；
7）将碳化二亚胺盐酸盐和琥珀酰亚胺加入到含有40%（v/v）乙醇的水溶液中，ph5.5，搅拌均匀，得含有0.15%的碳化二亚胺和0.05%的琥珀酰亚胺的交联剂溶液，然后将步骤6）处理后的皮片浸泡在交联剂溶液中，室温交联处理24小时；
8）将步骤6）处理后的皮片采用无菌纯水冲洗12小时后，排放整齐，冻存在-80℃的冰箱中。
实施例3
一种医用脱细胞真皮基质的制备方法，包括以下操作步骤：
1）将新鲜猪皮皮肤去肉后，浸泡入浓度为1.0%的苯扎溴铵溶液中消毒处理60分钟；
2）将步骤1）消毒处理后的动物皮肤浸泡入浓度为2.0%的十二烷基硫酸钠溶液中，清洗2次，每次清洗0.5小时；
3）将步骤2）清洗后的动物皮肤浸泡入浓度为2.0mol/l的氯化钠溶液中，浸泡4小时，打断上皮细胞和结缔组织之间的半桥粒，撕去表皮，得待处理真皮皮片；
4）将步骤3）制得的待处理真皮皮片放入含有6%的氢氧化钾和5%过氧化氢的混合溶液中，浸泡3小时；
5）将步骤4）处理后的真皮皮片裁切成长*宽*厚=10cm~80cm*10cm~80cm*0.2mm~1.0mm大小的皮片；
6）将步骤5）裁切后的皮片浸泡在含有0.5%胰蛋白酶的溶液中，在35℃温度下，ph7~9，浸泡1小时；
7）将碳化二亚胺盐酸盐和琥珀酰亚胺加入到含有40%（v/v）乙醇的水溶液中，ph5.5，搅拌均匀，得含有2.0%的碳化二亚胺和0.5%的琥珀酰亚胺的交联剂溶液，然后将步骤6）处理后的皮片浸泡在交联剂溶液中，室温交联处理1小时；
8）将步骤6）处理后的皮片采用无菌纯水冲洗4小时后，排放整齐，冻存在-80℃的冰箱中。
对上述实施例1~3制备的真皮基质的使用性能进行检测，结果显示，实施例1~3制备的真皮基质在自然干燥后，质地柔软，能够很好的与皮肤贴合，抗张强度高，在人工徒手拉扯过程中不易断裂，能够很好的满足临床的使用要求。
对比例1
一种医用脱细胞真皮基质的制备方法，包括以下操作步骤：
1）将新鲜猪皮皮肤去肉后，浸泡入浓度为0.5%的苯扎溴铵溶液中消毒处理30分钟；
2）将步骤1）消毒处理后的动物皮肤浸泡入浓度为1%的apg1214溶液中，清洗3次，每次清洗2小时；
3）将步骤2）清洗后的动物皮肤浸泡入含有4%的氢氧化钠和2%过氧化氢的混合溶液中，浸泡12小时；
4）将步骤3）清洗后的动物皮肤浸泡入浓度为1mol/l的氯化钠溶液中，浸泡24小时，打断上皮细胞和结缔组织之间的半桥粒，撕去表皮，得待处理真皮皮片；
5）将步骤4）制得的待处理真皮皮片放入含有4%的氢氧化钠的碱液中，浸泡12小时；
5）将步骤4）处理后的真皮皮片裁切成长*宽*厚=10cm~80cm*10cm~80cm*0.2mm~1.0mm大小的皮片；
6）将步骤5）裁切后的皮片浸泡在含有0.1%胰蛋白酶的溶液中，在37℃温度下，ph7~9，浸泡2小时；
7）将碳化二亚胺盐酸盐和琥珀酰亚胺加入到含有40%（v/v）乙醇的水溶液中，ph5.5，搅拌均匀，得含有0.5%的碳化二亚胺和0.1%的琥珀酰亚胺的交联剂溶液，然后将步骤6）处理后的皮片浸泡在交联剂溶液中，室温交联处理6小时；
8）将步骤7）处理后的皮片采用无菌纯水冲洗7小时后，排放整齐，冻存在-80℃的冰箱中。
本对比例相比实施例1在高渗盐处理前将皮肤浸泡在碱液和过氧化氢组成的混合溶液中，观察结果显示，这种操作方式不能很好的去除毛发，尤其是真皮毛孔中残留的毛发，需要另外进行人工去除毛发的过程。
对比例2
一种医用脱细胞真皮基质的制备方法，包括以下操作步骤：
1）将新鲜猪皮皮肤去肉后，浸泡入浓度为0.5%的苯扎溴铵溶液中消毒处理30分钟；
2）将步骤1）消毒处理后的动物皮肤浸泡入浓度为1%的apg1214溶液中，清洗3次，每次清洗2小时；
3）将步骤2）清洗后的动物皮肤浸泡入浓度为1mol/l的氯化钠溶液中，浸泡24小时，打断上皮细胞和结缔组织之间的半桥粒，撕去表皮，得待处理真皮皮片；
4）将步骤3）制得的待处理真皮皮片放入含有4%的氢氧化钠的碱液中浸泡12小时后，再在2%过氧化氢溶液中，浸泡12小时；
5）将步骤4）处理后的真皮皮片裁切成长*宽*厚=10cm~80cm*10cm~80cm*0.2mm~1.0mm大小的皮片；
6）将步骤5）裁切后的皮片浸泡在含有0.1%胰蛋白酶的溶液中，在37℃温度下，ph7~9，浸泡2小时；
7）将碳化二亚胺盐酸盐和琥珀酰亚胺加入到含有40%（v/v）乙醇的水溶液中，ph5.5，搅拌均匀，得含有0.5%的碳化二亚胺和0.1%的琥珀酰亚胺的交联剂溶液，然后将步骤6）处理后的皮片浸泡在交联剂溶液中，室温交联处理6小时；
8）将步骤7）处理后的皮片采用无菌纯水冲洗7小时后，排放整齐，冻存在-80℃的冰箱中。
本对比例与实施例1不同的是，将高渗盐处理后的真皮皮片分别浸泡在碱液中进行膨胀疏松处理之后，再浸泡在过氧化氢溶液中，观察结果显示，这种操作方式不能很好的去除毛发，需要进行额外的人工去毛发的操作步骤。
对比例3
一种医用脱细胞真皮基质的制备方法，包括以下操作步骤：
1）将新鲜猪皮皮肤去肉后，浸泡入浓度为0.5%的苯扎溴铵溶液中消毒处理30分钟；
2）将步骤1）消毒处理后的动物皮肤浸泡入浓度为1%的apg1214溶液中，清洗3次，每次清洗2小时；
3）将步骤2）清洗后的动物皮肤浸泡入浓度为1mol/l的氯化钠溶液中，浸泡24小时，打断上皮细胞和结缔组织之间的半桥粒，撕去表皮，得待处理真皮皮片；
4）将步骤3）制得的待处理真皮皮片放入含有4%的氢氧化钠和2%过氧化氢的混合溶液中，浸泡18小时；
5）将步骤4）处理后的真皮皮片裁切成长*宽*厚=10cm~80cm*10cm~80cm*0.2mm~1.0mm大小的皮片；
6）将步骤5）裁切后的皮片浸泡在含有0.1%胰蛋白酶的溶液中，在37℃温度下，ph7~9，浸泡2小时；
7）将步骤6）处理后的皮片采用无菌纯水冲洗7小时后，排放整齐，冻存在-80℃的冰箱中。
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例制备方法中酶消化处理后未进行交联处理，比较两种产品性能的结果显示，本对比例制备的产品抗张强度低，很容易扯断，无法正常满足临床的需要，产品自然干燥后会变硬，使用过程中也会给患者带来不舒服的感觉。