专利名称：血管紧张素转化酶抑制剂及其制法的制作方法
技术领域：
本发明是关于血管紧张素转化酶抑制剂的，该抑制剂由以val-Pro-Pro作为有效成份的含特定数目氨基酸残基的肽组成。
血管紧张素转化酶(下面称作ACE)主要存在于肺或血管内皮细胞内，它作用于由高血压蛋白原酶分解的血管紧张素Ⅰ(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu)，从其C未端分离二肽(His-Leu)，产生出具有较强后叶加压剂作用的血管紧张素Ⅱ。此外，该酶具有分解血管舒缓激肽及使之失活的作用，这种肽可降低血压。由于ACE不仅产生升高血压的肽(血管紧张素Ⅱ)，而且可以分解降低血压的肽及使该肽(血管舒缓激肽)失活，所以表现出导致血压升高的作用。出于这种考虑，开发出一系列的通过抑制这种酶的活性来抑制血压升高的物质。
迄今为止，已报导了许多抑制ACE的天然和合成物质，包括蛇毒液。其中合成的物质如captopril(D-2-甲基-3-巯基-propanoyl-L-脯氨酸已作为口服血管减压剂作用。但在许多情况下，这种药表现出一些付作用，并且在安全用药方面需要给予特别的注意。为了得到一种血管减压剂，在许多领域内已研究了如何从食品中得到毒性小，安全度高的ACE抑制剂。例如，迄今已报导了通过蛋白如酪蛋白(SusumuMaruyamaet.alA.B.C.，51(9)，2557-2561-(1987))，或鱼肉蛋白(HiroyukiUkeda，NipponNogeiKagakuKaishi(J.ofJapanSocietyforBioscience，Biotechnology，andAgrochemistry)，66(1)，25-29(1992))的酶学水解法制备ACE抑制肽。
尽管如此，得到口服给药获得的有效数据支持的这些物质仍然廖廖无几。一直需要一种有效的血管减压剂，可以口服给药，剂量小而安全度高。
至今已知乳酸菌成份显示出抑制ACE的能力，或者是降低血压的作用，如SeiIto在“MedicineandBiology”，116(3)，159-161(1988)中所报导，并在日本特许公开2-247127中所公开。此外，已报导了一种大分子物质显示出降低血压的作用，该物质分子量不小于5000，从发酵牛奶中分离微生物和酪蛋白而得到，如日本特许公开61-53216中所公开的。但是，除了从微生物得到的ACE抑制剂外，关于ACE抑制剂的报导仍然很少。
其间，Rao等人已合成出作为胶原蛋白的部分成份的三肽val-pro-pro，并作为用于解释消旋作用的一种物质予以报导(RaoS.Rapaka，R.SBhatnagarandD.E.Nitecki，BIOPOLYMERS，15，317-324(1976))。不过，尚不了解该物质具有ACE抑制活性。另一方面，用化学合成法很难合成出三肽val-pro-pro。因此一直需要开发出一种易于工业化的生产这种三肽的方法。
本发明的目的是提供一种ACE抑制剂及其制法，该抑制剂通过口服给用较小剂量，就显示出安全度高且有效的ACE抑制活性，该抑制剂可用作具有药物或生理作用的食品。
本发明的另一个目的是提供一种简单和廉价生产ACE抑制剂的方法。
通过下面的说明，可使本发明的上述及其它目的更清楚。
本发明提供一种含有作为有效成份val-pro-pro并含有3-10个氨基酸残基的血管紧张素转化酶抑制剂。
本发明亦提供了一种制备上述血管紧张素转化酶抑制剂的方法，该法包括用乳酸菌使含有作为组成成份的val-pro-pro的食品发酵。
下面进一步详细说明本发明。
在本发明的ACE制剂中，只要作为其有效成份的肽是含val-pro-pro的并带有3-10个氨基酸残基的肽，就满足要求。也可以是这种肽的可药用的盐，如盐酸盐、硫酸盐，琥珀酸盐，柠檬酸盐或酒石酸盐。与val-pro-pro连接的氨基酸残基最好连到N末端侧。此外，最好氨基酸残基的数目较少。优选的肽包括由下列氨基酸顺序表示的肽及其盐加合物，如Val-Pro-Pro，Val-Val-Pro-Pro，Val-Val-Val-Pro-Pro，Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro，Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro，Leu-Val-Pro-Pro，Phe-Leu-Val-Pro-Pro，Pro-Val-Pro-ProandAla-Pro-Val-Pro-Pro，这些肽或其盐加合物可单独或组合使用。
用作本发明的ACE抑制剂含val-pro-pro的带3-10个氨基酸残基的肽不仅可用下面说明的本发明的方法制备，也可用酶水解牛奶蛋白成份，如全或脱脂动物乳或酪蛋白，玉米，玉米蛋白，小麦，小麦蛋白，大豆，脱脂大豆或大豆蛋白，制备，或用常规有机化学合成制备。
只要本发明ACE抑制剂含有上述特定的肽就足够了。此外，也可与可药用的添加剂，食品或饮料混合，并可以固体或液体形式口服。尽管其剂量随症状的发展而变，或取决于其是用于治疗或是用于预防，但如果该抑制剂用于成人的治疗或预防，以含上述特定的val-pro-pro的带3-10个氨基酸残基的肽的用量计，最好日用量0.1mg-100mg，更好1-30mg。
至于本发明制备ACE抑制剂的方法，可用乳酸菌使下面称作VPP食品材料的一种食品发酵，该食品材料中含有含val-pro-pro的肽。
VPP食品材料可优先例举出如乳蛋白成份，如全或脱脂动物乳或乳酪蛋白，玉米，玉米蛋白，小麦，小麦蛋白，大豆，脱脂大豆或大豆蛋白。上述乳酸菌优选例举出如属于乳杆菌属的乳酸菌，如瑞士乳酸杆菌，德氏乳杆菌亚种保加利亚乳杆菌等，属于genusLactococcus的乳酸菌，如LactococcusLactis，属于链球菌属的乳酸菌，如Streptococcussalivariussubsp，属于明串珠菌属的乳酸菌，如LeuconostocLactis和属于双歧杆菌属的乳酸菌，如BifidobacteriumLongumorBifidobacteriumbrcve。乳酸菌可与其它微生物酵母混合。这些酵母优选例举出如属于酵母菌属的酵母，如啤酒酵母，属于假丝菌属的酵母如产肮假丝酵母，属于克鲁维氏酵母菌属的酵母如KluyveromycesmarxianusvarLactis及它们的混合物。
本发明方法中，用乳酸菌在操作条件下使VPP食品材料发酵，这些条件随乳酸菌类型和/或组合形式而变化。不过，优选将VPP食品材料溶于水成为溶液，再与乳酸菌混合，利用发酵进行培养。最好，培养温度和时间分别为25-45℃和3-72hr。最重要的是，为了使乳酸菌发挥有效作用，培养中开始发酵时的PH最好调到6-7。培养的终点可确定在如当乳酸菌数目为不小于107/ml的那一刻或当PH值为5.5或低于5.5的那一刻。除此之外，发酵过程中，通过加碱性物如NaOH或KOH将溶液保持在中性PH。培养时乳酸菌的比例用细菌数目表示，在发酵开始时最好是1ml VPP食品材料溶液约5×106。也可以利用多次部分培养过程进行培养。
用本发明方法制出的发酵牛奶可直接用作ACE抑制剂的有效成份。但也可用柱色谱法或任何生物化学法提纯，除掉除有效成份外的其它成份如苦味成份。制出的发酵牛奶中含Val-Pro-Pro的肽(作为上述有效成份)的含量为1-4mg/100ml发酵牛奶。所以，如将发酵牛奶直接用作本发明的ACE抑制剂，成人口服用量为10-1000ml，最好50-300ml。
本发明的ACE抑制剂含有作为有效成份的确定的肽，只要口服很少量的该抑制剂，即显示出最好的ACE抑制活性。此外，本发明方法在工业上非常有效，因为用该方法可简单廉价地生产出该ACE抑制剂。
本发明可通过只作为举例说明的实施例得到进一步说明。
实例1制备发酵牛奶a将9g精制脱脂奶粉溶于100g水。在115℃消毒20min后，溶液冷却到发酵温度，用瑞士乳酸杆菌JCM-1004通过一铂环线接种。37℃培养24hr.，制备出含5×108个乳酸菌/ml溶液的初级促酵物(PH3.5)。将180g精制脱脂奶粉溶于2Kg水，形成溶液，在90℃升高温度下消毒。冷至发酵温度后，用上述初级促酵物对该发酵溶液接种。37℃下培养24hr。得到二级促酵物。将4.5Kg精制脱脂奶粉溶于50Kg水，在90℃升高温度下消毒。得到的溶液冷至发酵温度，用上述二级促酵物接种。37℃培养24hr.得到约56Kg发酵牛奶a。
发酵牛奶中肽b(Val-pro-pro)的定量分析5ml上述发酵牛奶a在10000rpm离心分离5min，将分离的上清液倒入装有1g“AMBERLITEXAD-7”(由ROHM&HAASCO.制备的一种树脂的商品名)的柱子。用5ml水洗涤柱内物料，并与非吸附馏份混合。混合物倒入由两根“SEPPAKC18”(由WATERSINC.生产的一种柱子的商品名)柱子组成的一组合柱，用5ml蒸馏水洗涤。用5ml甲醇洗脱吸附馏份后，用离心浓缩器(“MODELCC-101”，TOMYSEIKOCO.，LTD)浓缩得到的产物并在减压下冻干。将该冻干物溶于0.05mol的乙酸铵缓冲液(PH6.89)用“GS320HQ”柱(由ASAHICHEMICALINDUSTRYCO.，LTD.生产的该产品的商品名)进行HPLC分离，由同样缓冲液平衡。肽以0.6ml/min流速洗脱。将洗脱时间14.5-15.5min的峰分成几部分，在下列条件下测定其量定量分析的条件柱子μBONDASPHERE5μC18，由WATERSINC制备，
洗脱条件溶液A;0.1wt%TFA水溶液;溶液B含0.1wt%TFA的乙腈，递减洗脱(B/A+B)×100(%)0%-40%(60min)，流速1ml/min;检测在215nm处紫外线吸收。
用得到的肽作标准，计算出滤液中所含肽b的重量。发现56Kg发酵牛奶a中含1.65g肽b。
制备肽b为了提纯发酵牛奶a中所含肽。采用下列提纯方法。
用10N的NaOH溶液调61发酵牛奶a至PH约7.3，与大约11树脂(由ROHM&HAASCO制造，商品名“AMBERLITEXAD-2”)混合，再与蒸馏水混合，使总体积达到约20l。得到的产物搅动90min，通过漂白布过滤分离树脂。经20l蒸馏水洗涤后，将树脂加到11甲醇内，搅动30min。得到的产物用200筛目的绵纶绒过滤，再于减压下用硬滤纸过滤。55℃下，用蒸馏器减压下浓缩得到的滤液，使浓缩至200ml的液体，该液体再与250ml树脂(ROHM&HAASCO制造，商品名“AMBERLITEIRA-400”(OH型))混合，并用刮刀搅动使液体的黄色消失。得到的液体减压通过硬滤纸过滤，再用1N盐酸溶液调滤液至PH7，冻干。得到的冻干物溶于少量蒸馏水，倒入柱子(由PHARMACIAFINECHEMICALSCO.制造，商品名“SEPHADEXG-25”)。用蒸馏水洗脱后收集活性馏份，冻干得到50mg粉末。将干燥粉末溶于0.05M乙酸缓冲液(PH4.5)，倒入用同样缓冲液平衡的柱子(由PHARMACIAFINECHEMICALSCO.制造，商品名“SP-SEPHADEXG-25”)，用缓冲液洗脱。收集活性成份并冻干。将冻干物溶于少量0.1wt%TFA的水溶液，用高速高性能液相色谱法(HPLC)分离，进行HPLC分离时，用反相柱(由YAMAMURACHEMICALLAB.CO.，LTD.制造，商品名“YMS-PACKA-302”)，并在线性梯度0-40%(60min)，含0.1wt%TFA的2-丙醇/乙腈(两者比例7∶3)作溶剂的条件下进行分离，得到1mg只有单峰的肽b，该肽显示出ACE抑制活性。
用下列方法分析得到的肽b。
氨基酸组成将1μg得到的肽b溶于6N常恒盐酸，真空下110℃水解24hr.。用水合茚三酮着色法，在分析仪(由HITACHILTD.制造，商品名“HITACHIL-8500TYPEAMINOACIDANALYZER”)上分析得到的产物组成。Val-Pro摩尔比为1.00∶2.08。
氨基酸序列用分析仪(由SHIMADZUCO制造，商品名“SHIMADZUPROTEINSEQUENCERPSQ-1”)分析测定N末端的氨基酸顺序。发现N端氨基酸顺利为val-Pro-Pro。测定ACE抑制活性。
根据Cushman和Cheung在D.W.CushmanandH.S.Cheung，Biochem.Pharmacol.201637(1971)”中所述方法，测定ACE抑制活性。
将上述制备的肽b样品，用含0.3MNaCl，PH8.3的0.1M硼酸缓冲液调节浓度到12.5，25.0，50.0，100和200μg/ml，并以0.08ml的量装入每一试管。将0.2ml马尿酰基组氨酰基亮氨酸(Hip-His-Leu，由SIGMACHEMICALCO.制备)用含0.3MNaCl的0.1M硼酸缓冲液(PH8.3)调至5mM，与0.02ml酶水溶液(ACE，0.1μ/ml，由SIGMACHEMICALCO.制备)按该顺序作为基质加入到每一试管的物料中，反应在37℃进行30min.，再向每一试管加0.25ml的1N盐酸。反应终止后，向每一试管加1.7ml乙酸乙酯，继续搅动20秒。在3000rpm下离心分离10分钟后，分离出1.4ml乙酸乙酯层，120℃下加热40min除去溶剂。除去溶剂后加1ml蒸馏水，测出提取的马尿酸在228mn处的吸收，并用作ACE抑制活性。用下列方程计算抑制比抑制百分数＝[(A-B)/(A-C)]×100(%)式中A是无样品(肽b)的马尿酸在228nm处的吸收，B是混有样品(肽b)的马尿酸在228nm处的吸收，C是不含酶和样品(肽b)的马尿酸在228nm处的吸收。
由此得到抑制百分数为50%时抑制剂的浓度。肽b的IC50值为14μM。
测定对口服用药大鼠的血管减压剂作用用下列方法测定制出的发酵牛奶a和肽b的血管减压剂作用。
将由CHARLESRIBERJAPANINC提供的每只26周龄的自发性高血压患鼠(SHR)(每组4只)，于保持在温度23±2℃，湿度55±5%的动物房内随意喂食水和饲料(由CLEAJAPANINC制造，商品名“CE-2”)，加以驯服饲养。SHR自试验前一天禁食水过夜，试验时，用胃探针强迫性口喂生理盐水、发酵牛奶a和溶于生理盐水的肽b，口服量分别为每只鼠2ml和150μg。口服前直接及服后4和8小时测量患鼠血压。量血压时用尾根套箍法，使用程控的electrosphygomanometer(由NARCOBIO-SYSTEMSCO.，ITD制造，商品名“PE-300”)。表1示出口服前直接测量的血压与口服后4小时和8小时血压差别。
表1样品4hrs后8hrs后生理盐水(对照)-0.5mmHg-2.4mmHg发酵牛奶a-37.0mmHg-31.5mmHg肽b-32.0mmHg-26.5mmHg实施例2向例1制备的55Kg发酵牛奶a加入5Kg树脂(由ROHM&HAASCO.制备，商品名“AMBERLITEXAD-2”)。混合物室温下搅动90分钟，用漂白布过滤分离树脂。经10l水洗涤后，将树脂加到2.5l乙醇中，搅30分钟。产物经200筛目尼纶绒布过滤后，再于减压下用硬滤纸过滤。滤液在55℃用蒸发器减压浓缩并冻干，得到约3.1g肽粉。该肽粉定量分析的方法类似于例1发酵牛奶中肽b的定量分析法。分析后发现含0.4g肽b。
将40.0份重乳糖，34.8份重蔗糖，5.0份重黄蓍胶粉和0.2份重薄荷油混合。将20份重肽粉溶于20份重蒸馏水的溶液加到上述混合物中，充分捏和。得到的捏和物铺在喷洒了淀粉的玻璃板上形成薄片，然后将薄片与基质冲击成膜，干燥成为每个重1g的锭剂。
实例3合成Phe-Leu-Val-Pro-Pro将0.01mmolFmoc-Leu树脂和各0.1mmol的Fmoc-phe，Fmoc-Pro，Fmoc-Pro和Fmoc-Val装入肽合成器(由SHIMADZUCO制造，商品名“PSSM8”)，用缩合剂PyBOP(苯并三唑-1-基-氧-三(Pyrrolidino)鏻六氟磷酸盐)合成Fmoc-Phe-Leu-Val-Pro-Pro-Phe树脂。得到的树脂经1ml甲醇洗涤5次，1ml叔丁基甲基醚洗2次后干燥。
用苯甲醚-1，2-乙二硫醇-TFA(5∶1∶94)混合溶液从树脂上洗脱肽后，再将该肽用无水乙醚洗涤3次，溶于0.01MHCl。该溶液冷冻-干燥得到2.65ml白色粉末。
将这些粉末溶于1ml0.1M含0.9MKCl的三-HCl(PH7.5)。加入6毫单位的“(ARBOXY-PEPTIDASEA”.(得自牛胰腺，由SIGMACHEMICALCO制造)。反应在37℃下进行24hr.，从C末端侧分解出氨基酸Phe和Leu。反应完成后，由HPLC显示出在相当于洗脱时间35.2分钟的位置上，有一个肽的单峰。由HPLC的洗脱按与例1相同方式进行。将峰分成几部分，减压离心浓缩及冷冻-干燥后，得到891mg白色粉末。
氨基酸组成将一部分肽溶于恒沸6N盐酸，真空下，110℃水解24hr。分析得到的产物的组成，用OPA着色法在氨基酸分析仪(由JAPANSPECTROSCOPICCO.LTD，制造，商品名“PU980”)上进行分析。发现肽由Val∶Pro∶Leu∶Phe＝1.00∶2.00∶1.06∶1.08组成。
氨基酸顺序利用分析仪(由SHIMADZU制造，商品名“SHIMADZUPROTEINSEQUENCERPSQ-1”)分析结果是，肽的氨基酸顺序是Phe-Leu-Val-Pro-Pro。
化学合成含Val-Pro-Pro的其它肽。
根据上述Phe-Leu-Val-Pro-Pro的合成方法，合成Val-Pro-Pro，Val-Val-Pro-Pro，Val-Val-Val-Pro-Pro，Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro，Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro，Leu-Val-Pro-Pro，Phe-Leu-Val-Pro-Pro和Ala-Pro-Val-Pro-Pro测定ACE抑制活性对用上述化学合成方法合成的每一种肽，按与例1中测定ACE抑制活性的相同方法测出IC50值。结果示于表2。
表2合成的肽 IC50(μM)Phe-Leu-Val-Pro-Pro12Val-Pro-Pro9Val-Val-Pro-Pro285Val-Val-Val-Pro-Pro873Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro117Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro160Leu-Val-Pro-Pro125Pro-Val-Pro-Pro181Ala-Pro-Val-Pro-Pro62权利要求
1.一种含有作为有效成份的Val-Pro-Pro并且含有3-10个氨基酸残基的血管紧张素转化酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的抑制剂，其中有效成分是向其加入选自盐酸盐、硫酸盐、琥珀酸盐，柠檬酸盐和酒石酸盐的可药用盐的肽。
3.根据权利要求1所述的抑制剂，其中有效成份选自Val-Pro-Pro，Val-Val-Pro-Pro，Val-Val-Val-Pro-Pro，Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro，Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro，Leu-Val-Pro-Pro，Phe-Leu-Val-Pro-Pro，Pro-Val-Pro-ProandAla-Pro-Val-Pro-Pro，及它们的盐加合物
4.根据权利要求1所述抑制剂，抑制剂给成人的服用量是0.1-100mg/日(按有效成份计)。
5.一种制备权利要求1所述抑制剂的方法，包括用乳酸菌使含作为有效成份的Val-Pro-Pro的食品材料发酵。
6.根据权利要求5的方法，其中所说的食品材料选自全动物乳，脱脂动物乳，乳酪蛋白，玉米，玉米蛋白，小麦，小麦蛋白，大豆，脱脂大豆，大豆蛋白及它们的混合物。
7.根据权利要求5的方法，其中的食品材料在酵母存在下发酵。
全文摘要
一种含有作为有效成分的Val—Pro—Pro及含有3—10个氨基酸残基的血管紧张素转化酶抑制剂。制备上述血管紧张素转化酶抑制剂的方法包括用乳酸菌使含作为有效成分的Val—Pro—Pro的食品材料发酵。
文档编号A61P9/12GK1090201SQ93116559
公开日1994年8月3日 申请日期1993年7月23日 优先权日1992年7月23日
发明者中村康则, 高野俊明 申请人:可尔必思食品工业株式会社