专利名称：在自身免疫疾病的免疫治疗中应用的自身抗原及其结构上相关的蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及新颖的自身抗原及其相关蛋白，它们在治疗自身免疫疾病关节软骨慢性损伤中的用途，含有上述自身抗原和/或蛋白的药物组合物，在测试样品中测定自身反应T细胞的诊断方法和在上述方法中使用的测试试剂盒。
免疫系统是建立在区别外来抗原(非自身抗原)和自身抗原(自体抗原，来自个体自己的身体内)的原理上，这种区分通过对自身抗原的耐受性机制得到。
免疫系统针对外来抗原保护个体，并在与外来抗原接触时通过激活特异细胞(如T和B淋巴细胞)和产生可溶性因子(如白细胞介素，抗体和互补因子)应答。免疫系统所应答的抗原被抗原呈递细胞(APCs)降解并且在细胞表面表达了与主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类糖蛋白相结合的抗原片段。MHC-糖蛋白-抗原-片段复合物通过它的T细胞受体识别与MHCⅡ类蛋白连接的抗原片段呈递给T细胞并与其结合。T细胞活化，即增生和/或合成白细胞介素，导致活化的淋巴细胞扩散到发病的抗原(Grey等，美国科学，261:38-46,1989)。
自身抗原也不断地加工并作为抗原片段由MHC糖蛋白呈递到T细胞(Jardetsky等，自然353:326-329,1991)。因此自身识别是免疫系统固有的，在正常情况下，免疫系统对自身抗原是有耐受性的，而避免了它们的自身抗原激活免疫应答。
当对自身抗原的耐受性丧失时，免疫系统由一个或多个自身抗原激活，导致自身反应T细胞的活化并产生抗体，这种现象称为自身免疫性。因为免疫反应一般是破坏性的，即意味着破坏入侵的外来抗原，所以自身免疫反应可以引起构成身体本身的组织的破坏。
T细胞在自身免疫疾病中所起的作用已由几项研究证实。在小鼠中，实验的自身免疫脑脊髓炎(EAE)是由高限制性T细胞群介导，通过它们对髓磷脂基础蛋白(MBP)复合物的单一抗原决定基的特异性与MHCⅡ类分子连接。在Lewis鼠(对各种自身免疫疾病有高度敏感性的品种)中，已表明疾病由T细胞介导。人类自身免疫疾病也被认为与自身攻击T细胞的发育有关。
在不同的疾病，如类风湿关节炎(RA)中牵涉到破坏性自身免疫反应，类风湿性关节炎中，由于大量的活化的淋巴细胞和MHCⅡ类表达细胞的存在导致慢性炎症过程，破坏了关节软骨的完整。仅仅软骨的存在看来是维持局部的炎症反应必须的已证明软骨的降解是与类风湿性关节炎中对软骨敏感的自身反应T细胞的活性相联系的(Sigall等，Clin.Exp.Rheumat.6:59,1988；Glant等，Biochem.Soc.Trans.18:796,1990；Burmester等，Rheumatoid arthritis Smolen,Kalden,Maini(Eds)Springer-Verlag Berlin Heidelberg,1992)。而且通过外科手术从RA病人中去除软骨已证明可减少炎症过程(G.S.Panayi等，Clin.ExD.Rheumatol.11(suppl.8):S1-S8,1993)。因此软骨蛋白被认为是靶自身抗原，能够刺激T细胞。这些自身反应T细胞的活化导致自身免疫疾病的发生。然而，在类风湿性关节炎发病时起作用的自身抗原的成分的鉴定至今仍难以捉摸。
导致软骨损伤的炎症反应可用几种药物治疗，如类固醇药物。但是，这些药常常是免疫抑制性药物，是非特异的，并有毒副作用。非特异性免疫抑制的缺点使之成为高度不受欢迎的治疗方法。
抗原特异的，非毒性的免疫抑制治疗方法提供了非常有吸引力的对非特异免疫抑制的改进方案。这种抗原特异性治疗方法涉及了用靶自身抗原或其氨基酸序列表现了与靶自身抗原的氨基酸酸序列同源性的抗原，或由上述自身抗原或由上述抗原派生的合成的T细胞反应性肽来治疗病人。这些合成的肽对应于自身抗原的T细胞抗原决定基，并可以用于诱导对它们自身和对自身抗原特异的T细胞耐受性。尽管用负责活化免疫系统的很相同的抗原来使免疫系统脱敏看起来反常，但是靶(自身)抗原的控制用药在免疫系统的脱敏中可以是非常有效的。免疫系统的脱敏或免疫耐受性是基于此长期观察的现象已喂养或吸入抗原或抗原决定基的动物当通过系统路径导入该抗原或抗原决定基时对该抗原或抗原决定基产生系统免疫应答的能力更低。
为了有效地使用耐受性治疗方法来治疗T细胞介导的软骨损伤，就非常需要鉴定负责的自身抗原或其氨基酸序列表现了与靶自身抗原氨基酸序列序列同源性的抗原，并使病人对激活导致炎症过程的T细胞的自身抗原脱敏。
本发明的目的是提供自身抗原，和其氨基酸序列表现了与自身抗原的氨基酸序列足够同源性的蛋白，上述自身抗原和/或蛋白适合在患有T细胞介导的软骨损伤的病人中诱导对负责的软骨抗原特异的T细胞耐受性。本发明进一步的目的是提供关节炎动物测试模型，此模型适合用于筛选抑制关节炎症状的新药。本发明的另一个目的是提供测定涉及关节软骨损伤的自身反应T细胞的方法和在上述方法中使用的测试试剂盒。
令人吃惊地发现人类软骨糖蛋白39(下文中称为HC gp-39)是类风湿性关节炎病人中的靶自身抗原，它激活特异T细胞，结果导致或介导炎症过程。HC gp-39的关节炎发生性质在Balb/c小鼠中得到证明。单独的皮下注射上述蛋白到Balb/c小鼠中能在动物中引发关节炎症状。HC gp-39诱导疾病过程的特征在于通过在前足和/或反足中周期性出现的复发和从温和的关节炎逐渐地发展到更严重的症状。而且，观察到的受损关节的对称性分布，与观察到的周期性发生的复发和结节的形成一起，与关节炎，尤其是类风湿性关节炎中的疾病进程相像。
甚至更令人吃惊地发现施用HC gp-39导致了免疫耐受性，并且更重要的是导致延迟和/或抑制了关节炎的发生。
更令人吃惊地发现包含的氨基酸序列表现了与HC gp-39的氨基酸序列至少50％同源性的蛋白能够在注射入动物时诱导关节炎。尤其是包含的 氨 基 酸 列 表 现 了 与 氨 基 酸 序 列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％同源性的蛋白能在动物中以如所描述的HCgp-39一样的方式诱导关节炎。
优选地，这些关节炎发生蛋白包含的氨基酸表现了与HC gp-39的氨基 酸 序 列，更 特 别 地 与 氨 基 酸 序 列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少70％，更优选地80％，最优选地90％的同源性。
根据本发明的关节炎发生蛋白与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的序列同源性的百分比应理解为由广泛使用的序列比较程序比如FASTA(W.R.Pearson和D.J.Lipman，美国国家科学院院报USA,85,2444-2448,1988)测定。
根据本发明的适当的关节炎发生蛋白是例如猪肝素结合38kDa蛋白牛39kDa乳清蛋白，人YKL-39蛋白，鼠乳房退化39kDa蛋白，人输卵管特异糖蛋白，鼠输卵管特异糖蛋白，仓鼠输卵管特异糖蛋白，牛输卵管特异糖蛋白，人壳三糖酶前体蛋白和鼠分泌蛋白YM-1前体。根据本发明，关节炎发生蛋白非常适合诱导免疫系统对同源自身抗原的系统耐受性，可以用于推迟和/或抑制哺乳动物中关节炎的发生。
HC gp-39存在于病人和健康成年人的血清中，但是蛋白在病人血清中的浓度是健康成年人的大约2倍。而且，从类风湿性关节炎病人中得到的滑膜样品或软骨中发现编码HC gp-39的mRNA，同时外科手术时得到的健康成年人的软骨中不包含明显数量的上述mRNA。培养关节软骨细胞和滑膜细胞时，它们的主要分泌产品变成HC gp-39(Hakala等，生物化学杂志，Vol.268,34:25803,1993),HC gp-39的关节炎发生性质既没有在Hakala等的发表文章中描述或暗示，也没有在任何其它发表文章中描述或暗示。
一些蛋白已有描述，它们的氨基酸序列表现了与HC gp-39的氨基酸序 列，更 特 别 地 与 氨 基 酸 序 列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％的同源性。猪肝素结合38kDa蛋白的鉴定在Shackelton等(1995)，生物化学杂志Vol.270,No.22,13076-13083中描述，然而蛋白质的功能没有鉴定。牛39kDa乳清蛋白的分离鉴定在J.J.Rejman等(1988)，生物化学生物物理研究通讯Vol.150,No.1,329-334中描述。鼠乳房退化39kDa蛋白(brp 39)的分离鉴定在Morrison和Leder,1994，癌基因9,3417中描述。编码人输卵管特异糖蛋白和相应氨基酸序列的cDNA克隆在Arias等(1994),Biology of Reproduction51,685-694中描述。其它哺乳动物输卵管特异的糖蛋白比如鼠和仓鼠输卵管特异的糖蛋白在JP-A-07107979,Kinosei Peptide KenkyushoKK中公开。牛输卵管特异糖蛋白的纯化和分子克隆在Y.Sendai等，1994,Biol.of Reprod.50,927-934中描述。在Boot等(1995)，生物化学杂志Vol.270,No.44,26252-26256中描述了人壳三糖酶前体蛋白由活化的人巨噬细胞分泌及其相应cDNA的克隆和其氨基酸序列。鼠分泌蛋白YM-1前体的氨基酸序列已被Chang等送入EMBL数据库(1992年6月，录入号M94584，未发表)。人软骨细胞蛋白YKL-39的氨基酸序列在Hu等(1996)，生物化学杂志Vol 271,No.32,19415-19420中描述。然而上述发表文章中没有任何线索或暗示提到根据本发明的蛋白的关节炎发生性质，而且也没有提到这些蛋白可以治疗中用作药物在患有T细胞介导的关节损伤，比如关节炎，更特异地类风湿性关节炎的哺乳动物，更特异地人中诱导对HC gp-39特异的T细胞耐受性。
因此，根据本发明，HC gp-39，和包含的氨基酸序列表现了与HCgp-39的氨基酸序列，更特别地与氨基酸序列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％同源性的蛋白质非常适合在治疗中用来在患有T细胞介导的关节损伤，比如关节炎，更特异地类风湿性关节炎的病人中诱导对HC gp-39特异的T细胞耐受性。HC gp-39和根据本发明所述的关节炎发生蛋白的片段在本发明的范围内，它们能在侵袭时在软骨中诱导对HC gp-39自身抗原特异的T细胞耐受性。
WO 95/01995和WO 95/02188描述了HC gp-39作为标志在对类风湿性关节炎的诊断中的用途，然而没有公开或暗示HC gp-39的关节炎发生性质。他们没有在任何地方提示或暗示HC gp-39，或其片段或根据本发明所述的T细胞反应性肽在抗原特异治疗中在侵袭时于软骨中诱导对HC gp-39特异的T细胞耐受性的用途。
HC gp-39，包含的氨基酸序列表现了与HC gp-39氨基酸序列，更特 别 地 与 氨 基 酸 序 列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％同源性的关节炎发生蛋白，和来自根据本发明的上述关节炎发生蛋白的片段可以借助重组DNA技术制备。为此，将编码HC gp-39，包含的氨基酸序列表现了与HC gp-39的氨基酸序列，更特 别 地 与 氨 基 酸 序 列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％同源性的蛋白或来自根据本发明的这些蛋白的片段或上述片段的多聚体的核酸序列插入到表达载体中。适当的载体是包含了复制和表达必须的控制区域的质粒，粘粒，病毒和YAC(酵母人工载体)，等等。表达载体可用来在宿主细胞中表达。适当的宿主细胞是，例如细菌，酵母细胞和哺乳动物细胞。这种技术在本领域内熟知(Sambrook等，分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，1989)。
使用这些重组DNA技术，牛乳清蛋白(其序列已在本说明书中公开)可以在宿主细胞中制备。
因此，本发明也提供了由SEQ ID NO:3表示的编码牛乳清蛋白的分离的cDNA和根据SEQ ID NO:2所述的牛乳清蛋白。很清楚一旦给予本发明的说明，片段也可以制备。术语“片段”是指蛋白的一部分任何氨基酸序列，并具有在本发明范围内的共同的起始元件，结构或作用机制。
适当的来自根据本发明的关节炎发生蛋白的片段可以通过一种已知的蛋白合成有机化学方法的制备。考虑的蛋白合成有机化学方法包括通过缩合反应，或在均相中或借助所谓的固相，连接所需的氨基酸。上述缩合反应最常用的方法是碳化二亚胺方法，叠氮化合物方法，混合酐方法和使用活化酯的方法，如在The Peptides,Analysis,Biology Vol.1-3(Ed.Gross,E.和Meienhofer,J.)1979,1980,1981(Academic Press,Inc.)中描述的。
使用“固相”制备上述HC gp-39和根据本发明所述的关节炎发生蛋白的适当的片段举例来说在美国化学学会杂志85:2149(1963)和Int.J.Peptide Protein Res.35:161-219(1990)中描述。
特别适合的固相是，例如，对-烷氧基苯基醇树脂(4-羟基-甲基-苯氧基-甲基-共聚苯乙烯-1％二乙烯基苯树脂)，由Wang(1974)美国化学学会杂志95:1328描述。合成后，肽可以在温和条件下从固相分离出来。
合成所需的氨基酸序列后，接着用三氟乙酸，包含清除剂，例如三异丙烯基硅烷，苯胺或乙二硫醇，苯硫基甲烷从树脂上分离肽。
不参与缩合反应的反应基团，一般被一些基团有效地保护起来，而这些基团可以很容易地通过借助酸、碱的水解作用或还原作用再去除。更多种类的可能的保护基团可以在The Peptides,Analysis,Synthesis,Biology,vol.1-9(Eds.Gross,Udenfriend和Meienhofer)1979-1987(AcademicPress,Inc.)中找到，保护基团可以根据特定基团的性质通过各种传统方法，例如借助三氟乙酸或通过温和的还原作用，例如用氢和催化剂，如钯，或冰乙酸中的HBr，分离下来。
尽管使用与负责激活免疫系统的抗原非常相同的抗原来使免疫系统脱敏看似自相矛盾，但是这种脱敏是基于长期观察的现象已喂养或吸入抗原或抗原决定基的动物当通过系统路径导入该抗原或抗原决定基时对该抗原或抗原决定基引发系统免疫应答的能力更低。因此，使用HC gp-39，和/或包含的氨基酸序列表现了与HC gp-39的氨基酸序列，更特别地 与 氨 基 酸 序 列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％同源性的蛋白控制用药对免疫系统的脱敏非常有效，能使病人对HC gp-39脱敏的根据本发明所述的蛋白的片段也在本发明的范围之内。
根据本发明，软骨处于发病状态的病人的自身应答T细胞可以用包含HC gp-39，包含的氨基酸序列表现了与HC gp39的氨基酸序列，更特别 地 与 氨 基 酸 序 列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％同源性的一种或多种蛋白或来自根据本发明所述的蛋白的一个或多个片段的药物组合物和药学上可接受的载体来治疗使病人的发病软骨中的特异的自身反应T细胞产生对HC gp-39的耐受性并且减少炎症反应。
在根据本发明所述的药物组合物中使用的适合的蛋白是包含的氨基酸序列表现了与HC gp-39的氨基酸序列，更特别地与氨基酸序列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少70％，优选地80％，更优选地90％同源性的蛋白。
在根据本发明所述的药物组合物中使用的非常适合的蛋白是例如猪肝素结合38kDa蛋白，牛39kDa乳清蛋白，鼠乳房退化39kDa蛋白(brp39)，鼠输卵管特异糖蛋白，仓鼠输卵管特异糖蛋白，牛输卵管特异糖蛋白，人YKL-39蛋白，人输卵管特异糖蛋白，人壳三糖酶前体蛋白和鼠分泌蛋白YM-1前体。
而且，非常适合在根据本发明所述的药物组合物中使用的是含有编码HC gp-39，或包含的氨基酸序列表现了与HC gp-39的氨基酸序列，更特 别 地 与 氨 基 酸 序 列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％同源性的蛋白质或来自根据本发明所述的蛋白的一个或多个片段的DNA的DNA(表达)载体。当提供DNA(表达)载体时，可以通过表达提供一定水平的重组HC gp-39或包含的氨基酸序列表现了与HC gp-39的氨基酸序列，更特别地与氨基酸序列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％同源性的蛋白质或根据本发明所述的片段，其与通过直接施用包含HC gp-39蛋白或肽的药物组合物得到的水平相同。
自身抗原HC gp-39，包含的氨基酸序列表现了与HC gp-39的氨基酸 序 列，更 特 别 地 与 氨 基 酸 序 列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％同源性的关节炎发生蛋白和来自根据本发明所述的该关节炎发生蛋白的片段与免疫抑制类固醇药物的非特异的抑制效应相比有其优点，它们对自身反应T细胞有特异的耐受效应，因此使免疫系统的其他成分保持完整。用自身抗原或包含的氨基酸序列表现了与HC gp-39的氨基酸序列，更特别地与氨基酸序列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％同源性的蛋白或根据本发明所述的片段进行治疗将是安全的，没有毒副作用出现。
耐受性可以通过施用高或低剂量的根据本发明所述的自身抗原或蛋白得到。自身抗原或蛋白的量将依赖于施用路径，施用时间，病人的年龄和一般的健康状况及饮食。
一般地，每kg体重可以使用0.01到1000μg蛋白剂量，优选地0.5到500μg，更优选地0.1到100μg蛋白。
药学上可接受的载体为本领域技术人员熟知，包括例如无菌盐水，乳糖，蔗糖，磷酸钙，白明胶，糊精，琼脂糖，果胶，花生油，橄榄油，芝麻油和水。其它载体可以是，例如MHCⅡ类分子，如果需要包被在脂质体中。
另外，根据本发明的药物组合物可以包含一种或多种佐剂。适当的佐剂包括氢氧化铝，磷酸铝，白榴石，维生素E，单苯膦基脂A，胞壁酰二肽和皂角苷如QuillA。佐剂的量依赖于佐剂本身的性质。
而且根据本发明的药物组合物可以包括一种或多种稳定剂比如碳水化合物包括山梨糖醇，甘露糖醇，淀粉，蔗糖糊精和葡萄糖，蛋白如白蛋白或酪蛋白，和缓冲液如碱性磷酸缓冲液。
适当的给药路径是肌肉注射，皮下注射，静脉注射或腹膜内注射，口腔和鼻内给药。口腔和鼻内用药为优选的用药方式。
由于它的关节炎发生性质，HC gp-39和包含的氨基酸序列表现了与HC gp-39的氨基酸序列，更特别地与氨基酸序列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％同源性的蛋白可以用于在动物中诱导临床关节炎。当施用小量HC gp-39或包含的氨基酸序列表现了与HC gp-39的氨基 酸 序 列，更 特 别 地 与 氨 基 酸 序 列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％同源性的一种或多种蛋白质或一个或多个根据本发明所述的蛋白的片段时，在上述动物中将发生关节炎症状，导致与在关节炎尤其是类风湿性关节炎中疾病进展相像的疾病模式。当用HC gp-39蛋白，或包含的氨基酸序列表现了与HC gp-39的氨基酸序列，更特别地 与 氨 基 酸 序 列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％同源性的蛋白质皮下注射Balb/c小鼠时，动物发生了关节炎症状。HC gp-39诱导的疾病和由包含的氨基酸序列表现了与HC gp-39的氨基酸序列，更特别地与氨基酸序列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％同源性的蛋白质诱导疾病的过程的特征在于在前足和/或后足上周期性出现的复发和从温和的关节炎逐渐地发展到更严重症状。而且，观察到的受损关节的对称性分布，与观察到的周期性发生的复发和结节的形成一起，与关节炎，尤其是类风湿关节炎中的疾病进程相像。
因此，这些患病的动物提供了研究引起关节炎发作和发展的机理的适当的动物模型。另外，上述患病的动物可以用于研究治疗关节炎的新药和研究这些药对关节炎发生的影响，任选地小鼠用来作为关节炎，尤其是类风湿性关节炎的动物模型。
为在上述动物中诱导关节炎，施用适当数量的HC gp-39或一种或多种根据本发明所述的蛋白。适当的用量是每kg体重0.01到100μg，优选地1到100μg，更优选地10到50μg。HC gp-39，或包含的氨基酸序列表现了与HC gp-39的氨基酸序列，更特别地与氨基酸序列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％同源性的蛋白质或其片段的用量将依赖于给药路径，用药时间和所用动物的类型。适当的给药路径与前述的相同。为促进关节炎诱导的效果，HC gp-39蛋白，或包含的氨基酸序列表现了与HC gp-39的氨基酸序列，更特别地与氨基酸序列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％同源性的蛋白质或根据本发明所述的肽可以包括一种或多种如前述的稳定剂或佐剂。
HC gp-39，包含的氨基酸序列表现了与HC gp-39的氨基酸序列，更 特 别 地 与 氨 基 酸 序 列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％同源性的蛋白或根据本发明所述的其片段也非常适合在检测涉及关节软骨慢性炎症的活化自身反应T细胞存在的诊断方法中使用。
根据本发明所述的诊断方法包括以下步骤a)从个体的血样中分离外周单核血细胞(PBMC)，b)在适当的条件下培养上述PBMC，c)在自身抗原或根据本发明所述的蛋白和其片段存在的情况下，温育上述PBMC培养物，和d)检测T细胞应答，例如增殖反应，证明个体中活化的自身反应T细胞的存在。
以通过测定自身反应T细胞的增殖反应来测定应答为例，掺入放射性同位素例如3H-胸腺嘧啶脱氧核苷是对增殖的测定方法。在PBMC中存在的自身反应T细胞的应答也可以通过使用细胞因子特异的ELISA来测定细胞因子的释放检测。另一种检测方法是通过FACS分析测定活化标志的表达，例如Ⅱ-2R。因此，包括一种或多种根据本发明所述的肽和适当的测试试剂的诊断组合物构成了本发明的一部分。根据测试的类型，测试试剂可以是放射性同位素，酶，或对细胞表面或活化标志特异的抗体。
而且测试试剂盒也在本发明的范围内，包括一种或多种根据本发明所述的肽。这些测试试剂盒适合于在根据本发明所述的诊断方法中使用。
因此，本发明提供了在患有T细胞介导的关节损伤比如关节炎，尤其是类风湿性关节炎的病人中测试是否存在对HC gp-39应答的自身攻击T细胞的方法。如果HC gp-39特异的T细胞存在，用含有HC gp-39或包含的氨基酸序列表现了与HC gp-39的氨基酸序列，更特别地与氨基酸序列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％同源性的一种或多种关节炎发生蛋白或根据本发明所述的肽或它们的组合的药物组合物使这些T细胞耐受，能推迟或抑制关节炎发生。
以下实施例是用来作为本发明的例证，并且不应以任何方式理解为限制本发明的范围。
图解
图1在HC gp-39耐受的和非耐受的Balb/c小鼠中关节炎的发作和发展。AS=敏化后每天患病动物的总关节炎评分。N=敏化后每天患病动物的数目。
图2当分别施用0.2μg,1μg,5μg和25μg牛39kDa乳清蛋白时，Balb/c小鼠中关节炎的发作和发展。发作/发展表示为敏化后每天的渐增评分(患病动物的总的关节炎评分)。
实施例1方法从MG 63骨肉瘤细胞系中提纯HC gp-39MG 63细胞(人类骨肉瘤ATCC CRL 1427)用DMEM/HAM’s F12无血清培养基在细胞培养器中培养。HC gp-39通过肝素亲和层析，再通过Superdex 75层析从培养物上清中纯化。纯度用SDS-PAGE检测。另外，N-端氨基酸测序确定了提纯的蛋白与Hakala等所述的蛋白相同。Balb/c小鼠中HC gp-39的关节炎发生性在100μl体积PBS(0.5M NaCl,0.01M磷酸钠缓冲液，pH7.5)中10或50μg的纯化HC gp-39以1∶1的比例混合到不完全弗氏佐剂(IFA)中，然后在2×4只雌性Balb/c小鼠中进行胸部区域的皮下注射(HarlanCPB,Zeist,The Netherlands)，同时4个对照用PBS(1∶1于IFA中)注射。每天检查小鼠的关节炎临床症状。关节炎的严重性通过对每一个足从0-3评分得到(根据Glant等的文章)。简短地，分数0=没有变化，分数1=红斑和肿胀，分数2=肿胀和出现变形，分数3=由于不能曲伸导致不能运动。通过鼻部施用HC gp-39诱导耐受性使用PT 45微导管和Hamilton注射器将28μg蛋白鼻部用药(2×10μl)于10只雌性Balb/c小鼠(用恩氟烷轻微麻醉)中。抗原施用时间为关节炎诱导前-15,-10和-5天。对照(n=10)采用同样的程序，但只施用载体(PBS)(表1)。
通过使用10μg蛋白，继在0天如上所述敏化后测量迟发型过敏反应(DTH)应答来评估免疫耐受性。0天敏化后接着在第8天于左后足垫注射10μg HC gp-39(50μl体积中)(激发)。在足垫中的DTH反应以增量测定(〔左边肿胀(mm×10-3)-右边肿胀(mm×10-3)〕/右边肿胀(mm×10-3)×100％)。足垫肿胀使用内部设计的微米计量在激发后0,24和48小时测定。表1．耐受图解
DTH=迟发型过敏反应。PBS=0.5M NaCl。0.01M磷酸钠缓冲液，pH7.5在这些同样的小鼠中对关节炎诱导的耐受性进一步得到监控，直到敏化后第31天，并且每天检查小鼠的临床症状，关节炎的严重性如上所述的得到。结果HC gp-39的关节炎发生性在用50μg HC gp-39与IFA的混合物一次注射后，所有小鼠逐渐发生严重的关节炎(表2)。关节炎症状最初在敏化后15-20天在4只动物的3只的前足中观察到。在前足中不表现任何症状的小鼠直到敏化后34天才在后足中发生关节炎。HC gp-39诱导疾病的过程的特征在于在前足或后足上周期性出现的复发和从温和的关节炎逐渐发展到更严重的关节炎(疾病进展持续62天)。经常(＞50％)观察到的受损关节的对称性分布，意味着两个前足或两个后足同时表现了关节炎症状。
使用10μg HC gp-39，而不是50μg，与IFA混合，同样地获得了关节炎的诱导。然而，关节炎评分有时更低(未表示数据)。4只小鼠中的3只发生了严重的关节炎。一只小鼠在实验过程中表现了温和的症状。在整个实验中，对照小鼠未表现任何关节炎症状。
总之，10和50μg蛋白足以在Balb/c小鼠中诱导进行性的关节炎。特征为周期性发生的复发和关节对称性损伤的HC gp-39诱导关节炎的慢性性质与在类风湿性关节炎(RA)中的疾病进程相像。表2．在HC gp-39敏化的Balb/c小鼠中关节炎的发作和发展
FP=前足。HP=后足。Contr.=对照。关节炎症状无分数=0，温和每个动物分数不超过2，严重每个动物分数≥3。在DTH实验中测定的免疫耐受性对照小鼠在0天用HC gp-39注射，表现了很强的，抗原特异的DTH应答，这表明在敏化基础上引发了对HC gp-39的细胞内免疫应答(表3)。然而，鼻部施用HC gp-39，在用自身抗原激发时完全消除了DTH应答，因此表明HC gp-39特异的T细胞已真正地耐受化。
显著地，非耐受群体中的10只动物中的4只在接近激发位置的脚踝处发生了关节炎。相反，耐受群在邻近激发位置的关节中没有发生关节炎，因此表明对HC gp-39的免疫耐受性导致了对关节炎发生的抵抗。表3．通过鼻部用药耐受后对HC gp-39的DTH应答
对关节炎诱导或进程的耐受性进一步监测HC gp-39耐受的和非耐受的Balb/c小鼠中关节炎的发作和发展。
在所有的对照(非耐受的)小鼠群中，疾病在用HC gp-39敏化的情况下发作(表4)。7只小鼠发展到严重的关节炎，而三只小鼠仅表现温和的症状(最高分数2)。相反，HC gp-39耐受群中5只小鼠在实验过程中抵抗了疾病发生。而且，耐受群中的两只动物一只在短时期内表现温和的症状。三只动物发展到更严重的关节炎，分数为4。表4．在HC gp-39耐受的和非耐受的Balb/c小鼠中关节炎的发作和发展
关节炎发作首次症状出现-侵袭动物的最高数目。关节炎症状无症状分数=0，温和每个动物分数不超过2，严重每个动物分数≥4。
有趣地，在耐受的动物中，关节炎在前和后足中的发作都分别推迟了最少7-9天(图1)。尽管在耐受群中更少的动物受到侵袭，但每个动物前足的关节炎评分比得上非耐受的动物中关节炎评分。然而对于每个动物后足的关节炎评分，有时耐受的动物中更低(图1)。
上述实验证明了HC gp-39在Balb/c小鼠中的关节炎发生性质。HCgp-39诱导疾病的过程的特征在于在前足和/或后足上周期性出现的复发和从温和的关节炎逐渐地发展到更严重症状。而且，观察到的受损关节的对称性分布，与观察到的周期性发生的复发一起，与类风湿性关节炎的疾病进程相像。HC gp-39强烈的关节炎发生性质通过单一的皮下注射10或50μg蛋白，在所有动物中发生了关节炎症状来说明。通过HC gp-39特异的DTH应答的诱导，表明HC gp-39特异的T细胞实际上是在HCgp-39敏化的情况下得到的。通过证明在用HC gp-39足垫免疫的动物中HC gp-39特异的体外增殖反应，这些数据进一步得到确认。
肽抗原的鼻部用药已用于诱导抗原特异的免疫耐受性。实验表明HCgp-39鼻部用药导致免疫的非敏感性。敏化后DTH应答在HC gp-39耐受的小鼠中完全消除，同时对照小鼠表现了抗原特异的肿胀。这些观察结果暗示了施用HC gp-39导致外周的免疫耐受性。
在非耐受的动物中，DTH应答在10只小鼠中的4只的脚踝(接近激发位置)中伴随有关节炎。相反，HC gp-39耐受的动物的脚踝真正的受到了完全的保护，由此暗示已有效地使自身反应T细胞沉默。用HCgp-39耐受化抵抗疾病发生的这一观点进一步由以下观察现象得到在耐受群中10只动物中的5只在整个实验过程中完全得到保护。尽管在此群体中的其它五只动物确实逐渐地发展了临床症状，但是关节炎的发作得到相当程度地延迟。因此可以得出结论在关节炎发生过程中牵涉到了HCgp-39特异的T细胞，并且更重要地，通过用根据本发明所述的药物组合物使这些T细胞耐受，可以推迟或抑制关节炎发生。实施例2方法在Balb/c小鼠中牛39kDa乳清蛋白的关节炎发生性在100μl体积(0.5M NaCl,0.01M磷酸钠缓冲液，pH7.5)中0.2,1,5或25μg的纯化的牛39kDa乳清蛋白以1∶1的比例混合到不完全弗氏佐剂(IFA)中，然后在4×100只雌性Balb/c小鼠中进行胸部区域的皮下注射(Charles River,Sulzfeld,德国)，同时10个对照用PBS(1∶1于IFA中)注射。每隔一天检测小鼠的关节炎临床症状。关节炎的严重性通过对每一个足以0-3评分得到(根据Glant等的文章)。简短地，分数0=没有变化，分数1=红斑和/或温和肿胀，分数2=严重肿胀和/或出现变形，分数3=由于不能曲伸导致不能运动。牛乳清gp39 cDNA的克隆牛乳腺λ-Bluemid(-)cDNA文库(寡聚dT和随机引物的，由Clontech实验室Inc.定做)使用XL-1 Blue MRF菌株为宿主扩增，文库铺平板和影印滤膜的制备根据制造厂商的说明书进行。来自HC gp-39cDNA的PvuⅡ片段用寡核苷酸标记试剂盒(Pharmacia)进行32p标记，然后用以杂交滤膜。阳性克隆得到扩增，并再筛选，相应噬菌体的插入DNA用耐热测序酶试剂盒(Amersham)进行序列测定。序列表示于SEQID NO:3中。在954位核苷酸上，一个克隆包含了C，同时另一个克隆包含了T。结果牛39kDa乳清蛋白的关节炎发生性。
在用25μg牛39kDa乳清蛋白与IFA的混合物注射后，所有小鼠逐渐发生严重的关节炎(表5)。在前足或后足中，关节炎的症状最初在敏化后8-20天观察到。牛39kDa乳清蛋白诱导关节炎的过程的特征在于后足上周期性出现的复发和从温和的关节炎逐渐发展到更严重的关节炎(疾病进展持续70天)。经常观察到受损关节的对称性分布，意味着两个前足或两个后足同时表现了关节炎症状。
使用5,1或0.2μg牛39kDa乳清蛋白与IFA混合，而不是25μg，同样地得到了关节炎的诱导。
用或1或0.2μg牛39kDa乳清蛋白诱导的小鼠发生了更温和的关节炎症状7和6只小鼠分别发生温和的关节炎，同时仅3和4只发生了严重的关节炎。
实验结束时，每一群小鼠的每个评分日的渐增评分得到计算(图2)，用25μg牛39kDa乳清蛋白免疫接种，在30天后达到最大分数27(25μg)，并伴有明显的复发。当更低剂量的牛39kDa乳清蛋白用于免疫接种时，动物有时表现了与用25μg剂量诱导的小鼠相比更低的关节炎评分。尽管得到更低的评分，但是在所有群体中都发现了关节炎的复发情况。
对照中，有时观察到PBS处理的小鼠有轻微的和短暂的后足肿胀。这个现象也在新的，未注射动物中观察到。这意味着这些小鼠群体每个评分日渐增的肿胀有一个平均值3.4应看作生物变异的背景。表5.牛39kDa乳清蛋白敏化的Balb/c小鼠中关节炎的发作和发
FP=前足，HP=后足。关节炎症状无分数=0，温和每个动物的分数不超过2，严重每个动物的分数≥3。
总之，牛39kDa乳清蛋白(25,5,1和0.2μg)能够在雌性Balb/c小鼠中诱导进行性的关节炎。以周期性复发和关节的对称性损伤为特征的牛39kDa乳清蛋白诱导关节炎的慢性性质，与在类风湿性关节炎(RA)中的疾病进展相像。
序列表(1)基本信息(ⅰ)申请人(A)名称AKZO NOBEL N.V.
(B)街名Velperweg 76(C)城市Arnhem(E)国家荷兰(F)邮政编码(ZIP)6824 BM(G)电话0412 666376(H)传真0412 650592(I)电报37503 akpha nl(ⅱ)发明名称在自身免疫疾病的免疫治疗中应用的自身抗原及其结构上相关的蛋白(ⅲ)序列数目3(ⅳ)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(2)关于SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度42个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:Tyr Lys Leu Val Cys Tyr Tyr Thr Ser Trp Ser Gln Tyr Arg Glu Gly1 5 10 15Asp Gly Ser Cys Phe Pro Asp Ala Leu Asp Arg Phe Leu Cys Thr His20 25 30Ile Ile Tyr Ser Phe Ala Asn Ile Ser Asn Asp35 40(2)关于SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度383个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型双链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Gly Leu Arg Ala Ala Gln Thr Gly Phe Val Val Leu Val Leu Leu1 5 10 15Gln Ser Cys Ala Ala Tyr Lys Leu Ile Cys Tyr Tyr Thr Ser Trp Ser20 25 30Gln Tyr Arg Glu Gly Asp Gly Ser Cys Phe Pro Asp Ala Ile Asp Pro35 40 45Phe Leu Cys Thr His Val Ile Tyr Ser Phe Ala Asn Ile Ser Asn Asn50 55 60Glu Ile Asp Thr Trp Glu Trp Asn Asp Val Thr Leu Tyr Asp Thr Leu65 70 75 80Asn Thr Leu Lys Asn Arg Asn Pro Asn Leu Lys Thr Leu Leu Ser Val85 90 95Gly Gly Trp Asn Phe Gly Ser Gln Arg Phe Ser Lys Ile Ala Ser Lys100 105 110Thr Arg Ser Arg Arg Thr Phe Ile Lys Ser Val Pro Pro Phe Leu Arg115 120 125Thr His Gly Phe Asp Gly Leu Asp Leu Ala Trp Leu Tyr Pro Gly Trp130 135 140Arg Asp Lys Arg His Leu Thr Thr Leu Val Lys Glu Met Lys Ala Glu145 150 155 160Phe Val Arg Glu Ala Gln Ala Gly Thr Glu Gln Leu Leu Leu Ser Ala165 170 175Ala Val Pro Ala Gly Lys Ile Ala Ile Asp Arg Gly Tyr Asp Ile Ala180 185 190Gln Ile Ser Arg Mis Leu Asp Phe Ile Ser Leu Leu Thr Tyr Asp Phe195 200 205His Gly Ala Trp Arg Gln Thr Val Gly His His Ser Pro Leu Phe Arg210 215 220Gly Gln Glu Asp Ala Ser Ser Asp Arg Phe Ser Asn Ala Asp Tyr Ala225 230 235 240Val Ser Tyr Met Leu Arg Leu Gly Ala Pro Ala Asn Lys Leu Val Met245 250 255Gly Ile Pro Thr Phe Gly Arg Ser Tyr Thr Leu Ala Ser Ser Lys Thr260 265 270Asp Val Gly Ala Pro Ile Ser Gly Pro Gly Ile Pro Gly Gln Phe Thr275 280 285Lys Glu Lys Gly Ile Leu Ala Tyr Tyr Glu Ile Cys Asp Phe Leu His290 295 300Gly Ala Thr Thr His Arg Phe Arg Asp Gln Gln Val Pro Tyr Ala Thr305 310 315 320Lys Gly Asn Gln Trp Val Ala Tyr Asp Asp Gln Glu Ser Val Lys Asn325 330 335Lys Ala Arg Tyr Leu Lys Asn Arg Gln Leu Ala Gly Ala Met Val Trp340 345 350Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Arg Gly Thr Phe Cys Gly Gln Asn Leu355 360 365Ala Phe Pro Leu Thr Ser Ala Ile Lys Asp Val Leu Ala Glu Val370 375 380(2)关于SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1152个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:ATGGGGCTGA GGGCGGCTCA GACAGGTTTT GTGGTCCTGG TGCTGCTCCA GAGCTGTGCT60GCATACAAGC TGATCTGCTA CTACACCAGC TGGTCCCAGT ACCGGGAGGG TGATGGGAGC120TGCTTCCCAG ACGCCATCGA CCCCTTCCTG TGCACCCATG TCATCTACAG CTTTGCCAAC180ATAAGCAACA ATGAGATCGA CACCTGGGAG TGGAATGACG TGACGCTCTA TGACACACTG240AACACACTCA AGAACAGGAA CCCCAACCTG AAGACCCTCC TATCTGTTGG AGGATGGAAC300TTCGGTTCTC AAAGATTTTC CAAGATAGCT TCCAAGACCC GGAGTCGCAG GACTTTCATC360AAGTCGGTGC CACCATTTCT GCGGACCCAT GGCTTTGATG GACTGGACCT AGCATGGCTC420TACCCCGGGT GGAGAGACAA GCGGCATCTC ACCACTCTGG TCAAGGAAAT GAAGGCTGAG480TTTGTAAGGG AAGCCCAAGC AGGCACAGAG CAGCTTCTGC TCAGTGCAGC AGTACCTGCA540GGGAAGATTG CTATTGACAG AGGCTATGAC ATCGCCCAGA TATCCCGACA CCTGGACTTC 600ATCAGCCTTT TGACCTATGA CTTTCACGGA GCCTGGCGCC AGACAGTCGG ACACCACAGC 660CCCCTGTTTC GAGGCCAGGA AGATGCAAGT TCTGACAGAT TCAGTAACGC TGACTACGCT 720GTGAGCTACA TGCTGAGGCT GGGGGCTCCA GCCAATAAGC TGGTGATGGG TATCCCCACT 780TTTGGGAGGA GCTACACTCT GGCCTCTTCC AAGACAGATG TGGGAGCCCC CATCTCAGGG 840CCAGGAATTC CAGGCCAGTT CACCAAGGAG AAAGGGATCC TTGCCTATTA TGAGATCTGT 900GACTTCCTCC ACGGAGCCAC CACCCACAGA TTCCGTGACC AGCAGGTCCC CTATGCCACC 960AAGGGCAACC AGTGGGTGGC GTATGACGAC CAGGAGAGTG TCAAAAACAA GGCACGGTAC 1020CTGAAGAACA GGCAGCTGGC TGGCGCCATG GTGTGGGCCC TGGACTTGGA TGACTTCCGG 1080GGCACCTTCT GTGGGCAGAA CCTGGCCTTT CCTCTCACAA GTGCCATCAA AGATGTGCTT 1140GCTGAGGTGT AG 115权利要求
1．一种用作治疗物质的蛋白，该蛋白包含的氨基酸序列表现了与氨基酸 序 列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％的同源性。
2．根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述蛋白是牛39kDa乳清蛋白或人YKL-39蛋白。
3．一种药物组合物，该药物组合物包含1种或多种包含的氨基酸序列 表 现 了 与 氨 基 酸 序 列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％同源性的蛋白质和药学上可接受的载体。
4．根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述蛋白是牛39kDa乳清蛋白或人YKL-39蛋白。
5．一种蛋白在制备药物制品中的用途，该蛋白包含的氨基酸序列表现 了 与 氨 基 酸 序 列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％的同源性；该药物制品用于在患有T细胞介导的软骨损伤的哺乳动物中诱导对同源自身抗原特异的T细胞耐受性。
6．根据权利要求5所述的用途，其特征在于该蛋白是39kDa乳清蛋白或人YKL-39蛋白。
7．在动物，优选地小鼠中诱导关节炎的方法中使用的一种或多种蛋白，该蛋白包含的氨基酸序列表现了与氨基酸序列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50％的同源性。
8．根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述蛋白是牛39kDa乳清蛋白或人YKL-39蛋白。
9．患有关节炎的动物，其中所述的关节炎通过根据权利要求7或8所述的方法诱导。
10．根据权利要求9所述的动物的用途，是在筛选用于治疗关节炎，尤其是类风湿性关节炎的新药中使用。
11．具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的蛋白。
12．编码根据权利要求11所述的氨基酸序列的分离的DNA。
13．根据权利要求12所述的分离的DNA具有SEQ ID NO:3的DNA序列。
全文摘要
本发明涉及自身抗原HC gp－39,和包含的氨基酸序列表现了与HC gp－39的氨基酸序列,更特别地与氨基酸序列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50%同源性的蛋白在哺乳动物自身免疫疾病关节软骨损伤的抗原特异治疗中诱导免疫系统耐受性的用途。自身抗原HC gp－39,和包含的氨基酸序列表现了与氨基酸序列YKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISND(SEQ ID NO:1)至少50%同源性的关节炎发生蛋白也适合在动物,优选地在小鼠中引发关节炎。本发明进一步涉及包含上述自身抗原和/或上述关节炎发生蛋白的药物组合物,在测试样品中测定自身反应T细胞的诊断方法和在上述方法中使用的测试试剂盒。
文档编号A61K38/00GK1216582SQ97193881
公开日1999年5月12日 申请日期1997年4月15日 优先权日1996年4月18日
发明者A·M·H·布茨, G·F·M·威荷登, E·S·伯斯 申请人:阿克佐诺贝尔公司