制备聚合物的方法

专利名称：制备聚合物的方法
技术领域：
本发明涉及新的可生物降解聚合物的制备方法。
背景技术：
EP-A-0839525公开了一种由生理活性肽或其盐和可生物降解聚合物组成的持续释放制剂，和其制备方法，在该公开内容中所述的可生物降解聚合物通过把由已知开环聚合法制备的可生物降解聚合物进行水解方法来制备，该水解方法本身是已知的。
开环聚合法通过加热时添加催化剂来使用乳酸的环状二聚体，该方法介绍在J.H.R Woodland等人的药物化学杂志(J.Med.Chem.)，第16卷，897页(1973)。另外，从环状二酯化合物如环二酯或糖脂开始用催化剂来进行的方法介绍在生物材料和生物工程百科全书，A部分材料，卷2，Marcel Dekker，Inc.(1995)。
另外，通过聚合柠檬酸三苄基酯和环二酯通过柠檬酸来把一个聚交酯和三个右旋糖酐结合在一起的嵌段共聚物的制备方法也介绍在WO95/03356中。
由于由上述已知开环聚合方法制备的聚合物不总是在生成的聚合物的ω端具有游离的羧基，因此难以有效地把生理活性物质加入到持续释放的制剂中。另外，在原材料加入阶段难以调节目标可生物降解聚合物的分子量。
因此，有必要开发一种有效地把生理活性物质加入到持续释放的制剂中并容易调节目标可生物降解聚合物的分子量的制备可生理降解聚合物的方法。
另外，也有必要开发一种适宜于用在至少约6个月或更长的长时间内持续释放生理活性物质的持续释放制剂中的可生物降解聚合物的制备方法。

发明内容
通过深入研究，结果解决了上述问题，本发明人发现了一种制备在ω-端具有游离羧基的可生物降解聚合物的方法，包括在羧基被保护起来的羟基单羧酸衍生物或羧酸基被保护起来的羟基二羧酸衍生物的存在下把环酯化合物进行聚合反应，并把生成的在ω-端具有被保护起来的羧基的聚合物进行脱保护反应。本发明人进行了进一步研究，由此，完成了本发明。
即，本发明涉及下面内容(1)一种制备在ω-端具有游离羧基的可生物降解聚合物的方法，包括在羧基被保护起来的羟基单羧酸衍生物或两个羧酸被保护起来的羟基二羧酸衍生物的存在下把环酯化合物进行聚合反应，和，把生成的在ω-端具有被保护起来的羧基的聚合物进行脱保护反应；(2)(1)中所述的方法，其中羧基被保护的羟基单羧酸衍生物是羧基被保护的乙醇酸，羧基被保护的L-乳酸、羧基被保护的D-乳酸或羧基被保护的DL-乳酸；(3)(1)中所述的方法，其中羧基被保护的羟基单羧酸的保护基是叔丁基或苄基；(4)(1)中所述的方法，其中羧基被保护的羟基二羧酸衍生物是丙醇二酸二苄酯或2-羟乙基丙二酸二-叔-丁酯；(5)(1)中所述的制备方法，其中环酯化合物是环单酯化合物或环双酯化合物；(6)(1)中所述的制备方法，其中脱保护反应是酸解反应；(7)一种制备在ω-端具有游离羧基的可生物降解聚合物的方法，包括在羧基被保护起来的羟基单羧酸衍生物的存在下把环酯化合物进行聚合反应，和，把生成的在ω-端具有被保护起来的羧基的聚合物进行脱保护反应；(8)(7)中所述的方法，其中在脱保护反应后进行酸水解反应；(9)(1)或(7)中所述的方法，其中可生物降解聚合物是用在至少约6个月长时间内持续释放生理活性物质的持续释放制剂中的可生物降解聚合物；(10)由(1)或(7)中所述的方法制备的可生物降解聚合物；(11)包括(10)中所述的可生物降解聚合物的持续释放制剂；(12)(11)中所述的持续释放制剂，还包括生理活性物质；和(13)(12)中所述的持续释放制剂，其中生理活性物质是LH-RH衍生物或其盐。
实施本发明的最佳实施方案对用在本发明的生理活性物质没有特别限制，只要药理学上可用；它可以是非肽化合物或肽化合物。非肽化合物的例子包括激动剂、拮抗剂和具有酶抑制作用的化合物。另外，肽化合物的例子优选包括分子量为约300-约400,000、优选为约400-约30,000、更优选为约500-约25,000、特别优选为约500-约20,000的生理活性肽。
生理活性肽的例子包括促黄体生成激素释放激素(LH-RH)、胰岛素、促生长素抑制素、生长激素、生长激素释放激素(GH-RH)、催乳激素、红细胞生成素、肾上腺皮质激素、促黑激素、甲状腺激素释放激素、甲状腺刺激激素、促黄体生成激素、促卵泡成熟激素、后叶加压素、催产素、降钙素、胃泌素、促胰液素、促胰酶素、cholestokinin、血管紧张素、人胎盘生乳素、人类绒毛膜促性腺激素、脑啡肽、内啡肽、kyotorphin、增免疫苏精肽、胸腺生成素、胸腺素、thymosthymlin、胸腺体液因子、血清胸腺因子、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、胃动素、强啡肽、铃蟾肽、神经降压素、caerulein、缓激肽、心钠素、神经生长因子、细胞生长因子、神经营养因子和具有内丝氨酸拮抗作用的肽、其衍生物和其片段或其片段的衍生物。
用于本发明的生理活性肽本身可是药物可接受的盐。在生理活性肽具有如氨基的碱性基团的情况中，这些盐的例子包括无机酸(如碳酸、酸式碳酸、氢氯酸、硫酸、硝酸和硼酸)和有机酸(如琥珀酸、乙酸、丙酸和三氟乙酸)的盐。
在生理活性肽具有如羧基的酸性基团的情况中，这些盐的例子包括无机碱(如碱金属如钠和钾、碱土金属如钙和镁)和有机碱(如有机胺如三乙胺和碱性氨基酸如精氨酸)的盐。另外，生理活性肽可形成金属复合物(如铜复合物或锌复合物)。
上述生理活性肽的优选例子是LH-RH衍生物，其例子包括有效用于避孕和抗性激素依赖疾病如前列腺癌、前列腺肥大、子宫内膜异位、子宫肌瘤、青春期早熟和乳房癌的LH-RH衍生物及其盐。
LH-RH衍生物或其盐的具体例子包括例如在Treatment with GnRHAnalogsControversies and Perspectives(The Parthenon Publishing Group Ltd.，1996)，JP 3-503165 A，JP 3-101695，JP 7-97334A和JP 8-259460A中所述的肽。
LH-RH衍生物的例子还包括LH-RH激动剂和LH-RH拮抗剂。LH-RH拮抗剂的优选例子是由通式(I)表示的生理活性肽或其盐X-D2Nal-D4ClPhe-D3Pal-Ser-A-B-Leu-C-Pro-DAlaNH2(其中，X表示N(4H2-糠酰)Gly或NAc，A表示选自NMeTyr，Tyr，Aph(Atz)和NMeAph(Atz)的残基，B表示选自DLys(Nic)，DCit，DLys(AzaglyNic)，DLys(AzaglyFur)，DhArg(Et2)，DAph(Atz)和DhCi的残基，C表示Lys(Nisp)，Arg或Arg(Et2))。
使用的LH-RH激动剂的优选例子是由通式(II)表示的生理活性肽或其盐5-氧代-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z(其中，Y表示选自DLeu，DAla，DTrp，DSer(tBu)，D2Nal和DHis(ImBzl)的残基，Z表示NH-C2H5或Gly-NH2)。特别地，优选其中Y是DLeu、Z是NH-C2H5的肽(即由5-氧代-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5表示的肽，特别是其乙酸盐)。
这些肽可用前述参考文献或专利中所述的方法、或根据这些方法的一些方法来制备。
本发明中所用的缩写的意思定义如下缩写 名称N(4H2-糠酰)GlyN-四氢糠酰甘氨酸残基NAc N-乙酰基D2Nal D-3-(2-萘基)丙氨酸残基D4ClPhe D-3-(4-氯)苯基丙氨酸残基D3Pal D-3-(3-吡啶基)丙氨酸残基
NMeTyr N-甲基酪氨酸残基Aph(Atz) N-[5′-(3′-氨基-1′H-1′，2′，4′-三唑基)]-苯基丙氨酸残基NMeAph(Atz)N-甲基-[5′-(3′-氨基-1′H-1′，2′，4′-三唑基)]-苯基丙氨酸残基DLys(Nic) D-(e-N-烟酰基)赖氨酸残基Dcit D-瓜氨酸残基DLys(AzaglyNic)D-(氮杂甘氨酰基烟酰基)赖氨酸残基DLys(AzaglyFur)D-(氮杂甘氨酰基呋喃酰基)赖氨酸残基DhArg(Et2)D-(N，N′-二乙基)高精氨酸残基DAph(Atz) D-N-[5′-(3′-氨基-1′H-1′，2′，4′-三唑基)]-苯基丙氨酸残基DhCi D-高瓜氨酸残基Lys(Nisp) (e-N-异丙基)赖氨酯残基hArg(Et2) (N，N′-二乙基)高精氨酸残基Dser(tBu) D-O-(叔-丁基)丝氨酸残基DHis(ImBzl)N1-苄基组氨酸残基在用缩写表示其它氨基酸的情形中，缩写是根椐IUPAC-IUBCommission on Biochemical Nomenclature(European Journal of Biochemistry，Vol.138，pp.9-37(1984))的缩写，或根椐相关领域常用的缩写。另外，在有可能存在氨基酸的光学异构体的情况下，除非另有说明，指的是L-型。
除了生理活性物质，本发明持续释放制剂还可包括如分散剂(包括表面活性剂如Tween 80和HCO-60；多糖如羧甲基纤维素、藻酸钠和透明质酸钠；硫酸鱼精蛋白和聚乙二醇400)、防腐剂(例如羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯)、等渗剂(如硫酸钠、甘露糖醇、山梨醇和葡萄糖)、脂肪和油(如芝麻油和玉米油)、磷脂类(如卵磷脂)、赋形剂(如乳糖、玉米淀粉、甘露糖醇和纤维素)、粘合剂(如蔗糖、阿拉伯胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素和糊精)、崩解剂(如羧甲基纤维素钙)和药物保持剂(如明胶、羟萘甲酸和水杨酸)。
用于本发明的可生物降解聚合物的例子包括在ω端具有游离羧基的聚合物、共聚物或其混合物(如ω残基是乙醇酸的多羟基羧酸、ω残基是DL-乳酸的多羟基羧酸、ω残基是D-乳酸的多羟基羧酸、ω残基是L-乳酸的多羟基羧酸、ω残基是丙醇二酸的多羟基羧酸、ω残基是2-羟乙基丙二酸的多羟基羧酸)，这些聚合物可从一种或多种其中羟基单羧酸(如乙醇酸或乳酸)的羧基被保护起来的衍生物(如羧基被保护起来的乙醇酸、羧基被保护起来的L-乳酸、羧基被保护起来的D-乳酸)、和其中羧基被保护起来的DL-乳酸(保护基的例子包括叔丁基和苄基)，更具体地是，D-乳酸叔丁酯和L-乳酸苄酯)、羟基二羧酸(如羟基丙二酸或2-羟乙基丙二酸)的羧基被保护起来的衍生物(如羟基丙二酸二苄酯和2-羟乙基丙二酸二-叔-丁酯)等、和一种或多种环酯化合物(如环二酯化合物(交酯)和环单酯化合物(内酯))来制备。
除ω残基外的“多羟基羧酸”的部分优选是聚-α-羟基羧酸。
用作“聚-α-羟基羧酸”的最小重复单元的α-羟基羧酸的优选实例包括乳酸和乙醇酸，以及其共聚物(其可称为聚(丙交酯-共聚-乙交酯)、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)或乳酸-乙醇酸聚合物，除非特别指明，一般称为乳酸和乙醇酸的均聚物(也称为聚合物，聚丙交酯或聚乙交酯)和共聚物)。
虽然对组成比(“乳酸-乙醇酸聚合物”的乳酸/乙醇酸)(mol/mol％)没有特别限制，只要达到本发明的目的，但所用的组成比为约100/0-约30/70。组成比的优选例是约100/0-约40/60，特别常用的组成比为约100/0-约45/55。
在作为“聚α-羟基羧酸”的最小重复单元的α-羟基羧酸在分子内具有光学活性中心的情况下，虽然其可以呈任何形式的D型、L型或D，L-型，但D-型与L-型之比(D-型/L-型)(mol/mol％)优选在约75/25-约25/75内。D-型/L-型的比例(mol/mol％)特别常用的在约60/40-约30/70内。
通常，上述可生物降解聚合物的重均分子量优选为约3,000-约500,000，更优选为约3,000-约200,000，特别优选3,000-约100,000。另外，通常分散度(重均分子量/数均分子量)优选为约1.2-约4.0，特别优选为约1.5-3.5。
在上述可生物降解聚合物的ω残基是单羧基的情形下，通常每单位质量的聚合物的端羧基的量优选为约40-约90μmol/g，特别优选为约50-约90μmol/g。
在上述可生物降解聚合物的ω残基是二羧基的情形下，通常每单位质量的聚合物的端羧基的量优选为约30-约800μmol/g，特别优选为约60-约400μmol/g。
上述重均分子量、数均分子量和分散度指的是根椐聚苯乙烯、用凝胶渗透色谱法(GPC)使用11种重均分子量455645，354000，98900，66437，37200，17100，9830，5870，2500，1303和504的单分散聚苯乙烯作为参考物质测定的分子量、和计算出的分散度。用高速GPC系统(TosohHLC-8120GPC)，GPC柱KF804L×2(Showa Denko)、并用氯仿作为流动相来进行测量。
端羧基的上述量指的是根椐标记法由端基分析所测定的量。更具体地，在ω残基是乳酸的聚合物的情形中，把可生物降解聚合物Wmg溶解在2ml5N HCl/乙腈(v/v＝4/96)的混合液中，接着加入2ml 0.01M邻硝基苯基肼(ONPH)溶液(5N HCl/乙腈/乙醇＝1.02/35/15)和2ml 0.15M EDC溶液(吡啶/乙醇＝4v/96v)，在40℃下反应30分钟后蒸掉溶剂。用水洗涤残余物后(4次)，把由此处理的残余物溶解在2ml乙腈中，接着加入0.5mol/l乙醇氢氧化钾水溶液，使反应在60℃下进行30分钟。用1.5N NaOH稀释该反应液，得到Yml，用1.5N NaOH作为参照物测定544nm处的吸光度A(/cm)。另一方面，当使用DL-乳酸溶液作为标准物通过NaOH滴定来测量游离羧基的量C mol/L，并且把用ONPH标记法用DL-乳酸肼在544nm处的吸光度作为B(/cm)时，在ω残基是乳酸的聚合物中的游离羧基[COOH]的量用下面等式测定。
(mol/g)＝(AYC)/(WB)另外，端羧基的量可通过把可生物降解聚合物溶解在甲苯、丙酮和甲醇的混合溶剂中，并用酚酞作为指示剂、用氢氧化钾含水醇溶液滴定该溶液来计算。
虽然可生物降解聚合物的降解和消失速率根椐共聚组成、分子量或游离羧基的量而相应变化，但通常，通过增加分子量和减少游离羧基的量可延长释放时间。然而，需要游离羧基的最小预定量，因为这对把生理活性物质加入到制剂中的效率有影响。由于这个原因，为了提供用于长期持续释放制剂(如至少约6个月或更长，优选约6个月(26周)至约8个月(约35周)，更优选约6个月(26周)至约7个月(30周)，特别优选约6个月(26周)至约6.5个月(约28周))中的可生物降解聚合物，优选ω端是聚DL乳酸、单羧基，上述重均分子量为约20,000-50,000，游离羧基的量为约50-90μmol/g。
下面提供本发明可生物降解聚合物的制备方法的详细介绍。
(1)首先，用聚合催化剂在上述羧基被保护起来的羟基单羧酸衍生物(如D-乳酸叔丁酯或L-乳酸苄基酯)、或羧基被保护起来的羟基二羧酸衍生物(如丙醇二酸二苄酯或2-羟基乙基丙二酸二叔丁酯)存在下，把环酯化合物进行聚合反应。
上述“羧基被保护起来的羟基单羧酸衍生物”或“两个羧基被保护起来的羟基二羧酸衍生物”的例子包括羧基(-COOH)被酰胺化(-CONH2)或酯化(-COOR)的羟基羧酸衍生物，优选羧基(-COOH)被酯化(-COOR)的羟基羧酸衍生物。
这里酯中R的例子包括C1-6烷基如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、或叔丁基；C3-8环烷基如环戊基或环己基；C6-12芳基如苯基或α-萘基；苯基-C1-2烷基如苄基或苯乙基；和C7-14芳烷基如α-萘基甲基或其它α-萘基-C1-2烷基。特别优选叔丁基和苄基。
“环酯化合物”指的是例如在环中具有至少一个酯键的环状化合物。具体的例子包括环单酯化合物(内酯)和环二酯化合物(交酯)。
“环单酯化合物”的例子包括4元环内酯(如β-丙醇酸内酯、β-丁内酯、β-异戊内酯、β-己内酯、β-异己内酯和β-甲基-β-戊内酯)、5元环内酯(如γ-丁内酯和γ-戊内酯)、6元环内酯(如δ-戊内酯)、7元环内酯(如ε-己内酯)、对-二噁烷酮(dioxanone)和1，5-dioxepan-2-one。
“环二酯化合物”的例子包括由下式表示的化合物 (其中，R1和R2可相同或不同，每一个表示氢原子或C1-6烷基如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基或叔丁基)，特别优选的例子是其中R1是氢原子、R2是甲基或R1和R2每一个都是氢原子的交酯。
具体的例子包括乙交酯、L-丙交酯、D-丙交酯、DL-丙交酯、内消旋丙交酯和3-甲基-1，4-二噁烷-2，5-二酮(包括旋光形式)。
“聚合催化剂”的例子包括有机锡催化剂(如辛酸锡、二月桂酸二正丁基锡和四苯基锡)，铝催化剂(如三乙基铝)和锌催化剂(如二乙基锌)。
从反应后易于除去的角度看，优选铝催化剂和锌催化剂，从剩余物质的安全性角度看，更优选锌催化剂。可用的聚合催化剂的溶剂的例子包括苯、己烷和甲苯，优选己烷和甲苯。
关于“聚合方法”，应使用用熔化状态的反应剂进行的嵌段聚合方法或反应剂溶解在适宜溶剂(如苯、甲苯、二甲苯、萘烷或二甲基甲酰胺)中的溶液聚合法。甲苯和二甲苯是优选的溶剂的例子。对聚合温度没有特别限制，在本体聚合中，聚合温度等于或高于在开始反应时反应剂达到熔化状态的温度，并通常为100-300℃。在溶液聚合中，聚合温度通常为室温至150℃。当反应温度超过反应溶液的沸点时，应安装冷凝器来回流反应溶液，或反应应该在防压容器中进行。聚合时间在考虑了聚合温度、其它反应条件和目标聚合物的物理性质等来适当地确定，并例如为10分至72小时。在反应后，把反应混合物溶解在适当的溶剂中(例如丙酮、二氯甲烷或氯仿)，并在用酸(如氢氯酸、乙酸酐或三氟乙酸)终止聚合后，根椐常规方法把反应混合物混合在不溶于目标产品中的溶剂(如醇、水、醚或异丙醚)中以沉淀下来，并分离在其ω端具有被保护羧基的聚合物。
代之以用常规的所谓质子链转移剂如甲醇，本发明的聚合方法用其中羧基被保护的羟羧酸衍生物(如D-乳酸叔丁基酯或L-乳酸苄基酯)或其中两个羧基被保护的羟基二羧酸衍生物(如丙醇二酸二苄酯或2-羟乙基丙二酸叔丁酯)。
作为用这类质子链转移剂如其中羧基被保护的羟羧酸衍生物(如D-乳酸叔丁酯或L-乳酸苄基酯)或其中两个羧基被保护的羟基二羧酸衍生物(如丙醇二酸二苄酯或2-羟乙基丙二酸二叔丁酯)的结果，(1)根椐加入的组合物，可控制分子量；和(2)在聚合后进行脱保护反应可释放在生成的可生物降解聚合物的ω端的羧基。
(2)接着，把在上述(1)聚合反应中得到的在ω端具有被保护羧基的聚合物进行脱保护反应，可得到在ω端具有游离羧基的目标可生物降解聚合物。
通过本身已知的方法可去除保护基。虽然可使用任何方法来进行该方法，只要该方法去除保护基并对聚(羟基羧酸)的酯键没有影响，但这种方法的具体例子包括还原和酸解(反应)。
还原方法的例子包括用催化剂(如钯碳、钯黑和氧化铂)的催化还原法、在液体氨中的钠还原法、和由二硫苏糖醇的还原法。例如，在催化还原在ω端具有用苄基保护的羧基的聚合物中，脱保护具体如下进行把钯碳加入到聚合物溶解在乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿的溶液中，接着在室温下充入氢约20分钟至约4小时，同时强力搅拌。
酸解方法的例子包括用无机酸(如氢氟酸、氢溴酸和氢氯酸)、有机酸(如三氟乙酸、甲磺酸和三氟甲磺酸)或其混合物的水解。另外，若必要，在酸解过程中可适当地加入阳离子清除剂(如茴香醚、苯酚和茴香硫醚)。例如，在酸解在ω端具有用叔丁基保护的羧基的聚合物中，脱保护具体如下进行把适当量的三氟乙酸加入到聚合物溶解在二氯甲烷、氯仿或甲苯的溶液中，或把聚合物溶解在三氟乙酸中，接着在室温下搅拌约1小时。
优选在聚合反应后马上进行酸解，在这种情况下，也把其用作终止聚合的反应。
另外，若必要，把上述脱保护反应得到的聚合物进行酸解反应，可根椐目的，调节聚合物的重均分子量、数均分子量或端羧基的量。更具体地，这可用如在EP-A-0839525中所述的方法或按照该方法的方法来进行。
以上述方式制备的可生物降解聚合物可用作制备持续释放制剂的基础材料。
在肽的情形下，生理活性物质与本发明基础材料的重量比例如为约0.001-50％(w/w)，优选为约0.02-40％(w/w)，更优选为约0.1-30％(w/w)，在非肽的情形下，为约0.01-80％(w/w)，优选为约0.1-50％(w/w)。
(3)通过例如水干燥、相分离、喷雾干燥或按照这些方法的方法，可制备含有由本发明制备方法得到的可生物降解聚合物的持续释放制剂。
下面介绍制备呈如微胶囊(也称为微球)状的持续释放制剂的制备方法。
若必要，根椐本身已知的方法，在下面制备过程中，也可加入药物保持剂(如明胶、羟萘甲酸和水杨酸)。
(I)水干燥法(i)O/W法在该方法中，首先制备可生物降解聚合物的有机溶剂溶液。当制备本发明的持续释放制剂时所用的有机溶剂优选的沸点为120℃或更低。
可用的有机溶剂的例子包括卤代烃(如二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、三氯乙烷和四氯化碳)、醚(如乙醚和异丙醚)、脂肪酸酯(如乙酸乙酯和乙酸丁酯)、芳香烃(如苯、甲苯和二甲苯)、醇类(如乙醇和甲醇)和乙腈。优选卤代烃，并特别优选二氯甲烷。另外，也可把这些溶剂以适当比例混合。在这种情况下，优选卤代烃和醇的混合液，并特别优选二氯甲烷和乙醇的混合液。
尽管可生物降解聚合物在有机溶液中的浓度根椐可生物降解聚合物的分子量和有机溶剂的类型而改变，例如，在用二氯甲烷作为有机溶剂的情况下，该浓度通常选自约0.5-70％重量，更优选约1-60％重量，特别优选约2-50％重量。
在用乙醇作为有机溶剂并混有二氯甲烷的情形下，两种溶剂之比通常选自约0.01-50％(v/v)、更优选约0.05-40％(v/v)、特别优选约0.1-30％(v/v)。
然后加入生理活性物质，溶解或分散在以这种方式得到的可生物降解聚合物的有机溶剂溶液中。此时，所加的生理活性物质的量使得生理活性物质可生物降解聚合物的重量比的上限最高为约1∶1，优选最高为约1∶2。
接着，把生成的含有由生理活性物质或其盐和可生物降解聚合物组成的组合物的有机溶剂溶液加入到水相中，在形成油(油相)/水(水相)乳液后，蒸发油相中的溶剂来制备微胶囊。此时水相的体积通常选自油相体积的约1-10,000倍、优选约5-5,000倍，并特别优选约10-2,000倍。
也可向外层水相中加入乳化剂。可使用任何乳化剂，只要形成稳定的O/W乳液。可用的乳化剂的具体例子包括阴离子表面活性剂(如油酸钠、硬脂酸钠和月桂酸钠)、非离子表面活性剂(如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(如购自Atlas Powder的Tween 80，Tween 60))、聚氧乙烯蓖麻油衍生物(购自Nikko Chemicals的HCO-60和HCO-50)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羧甲基纤维素、卵磷脂、明胶和透明质酸。可使用这些中的一种或数种的组合。使用时的浓度优选在约0.01-10％重量、更优选在约0.05-5％重量范围内。
另外，也可向上述外水相中加入渗透压调节剂。渗透压调节剂应是在呈水溶液状具有渗透压的渗透压调节剂。
渗透压调节剂的例子包括多元醇、一元醇、单糖、二糖、寡聚糖和氨基酸或其衍生物。
可用的上述多元醇的例子包括三元醇如甘油、五元醇如阿糖醇、木糖醇和福寿糖醇、和六元醇如甘露糖醇、山梨醇和己六醇。其中，优选六元醇，特别优选甘露糖醇。
上述一元醇的例子包括甲醇、乙醇和异丙醇，其中优选乙醇。
上述可用的单糖的例子包括戊糖类如阿糖、木糖、核糖和2-脱氧核糖，和己糖类如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖和岩藻糖，其中优选己糖。
上述可用寡聚糖的例子包括三糖类如麦芽三糖和棉子糖，和四糖类如水苏糖，优选三糖类。
上述可用的单糖、二糖和寡聚糖衍生物的例子包括葡糖胺、半乳糖胺、葡糖醛酸和半乳糖醛酸。
可使用任何氨基酸，只要它们是L-形式，其例子包括甘氨酸、亮氨酸和精氨酸，优选L-精氨酸。
这些渗透压调节剂可单独或组合使用。
这些渗透压调节剂的使用浓度使得外水相的渗透压为生理盐水的约1/50-5倍、优选约1/25-3倍。
用本身已知的方法或按照已知方法的方法来除去有机溶剂。这些方法的例子包括在常压或逐渐降压下用螺旋桨式搅拌机或磁力搅拌器搅拌下蒸发有机溶剂的方法、和用旋转蒸发器等在调节真空时蒸发有机溶剂的方法。
通过离心分离或过滤来分离按这种方法得到的微胶囊后，粘附到微胶囊表面上的游离生理活性物质、乳化剂等用蒸馏水重复洗涤数次来洗掉，再次分散在蒸馏水等中，然后冷冻干燥。
在制备过程中可加入抗凝剂以防止颗粒凝结。可用的抗凝剂的例子包括水溶性的多糖如甘露糖醇、乳糖、葡萄糖和淀粉(如玉米淀粉)、氨基酸如甘氨酸、蛋白质如纤维蛋白和胶原。其中，特别优选甘露糖醇。
另外，若必要，在冷冻干燥后，在微胶囊不熔化和在减压下彼此不粘附到一起的条件下通过加热来除去微胶囊内的水分和有机溶剂。优选在稍高于可生物降解聚合物的平均玻璃化转变温度的温度下加热微胶囊，该玻璃化转变温度用差示扫描量热法在以每分钟10-20℃的速率加热的条件下测定的。更优选，高于可生物降解聚合物的平均玻璃化转变温度的约30℃的温度下加热微胶囊。在具体地用乳酸-乙醇酸聚合物作为可生物降解聚合物的情形下，优选在平均玻璃化转变温度至高于平均玻璃化温度约10℃的温度范围内、更优选在平均玻璃化转变温度至高于平均玻璃化转变温度约5℃的温度范围内加热微胶囊。
虽然加热时间根椐微胶囊的量等而改变，但在微胶囊本身达到预定的温度之后，通常进行加热约12至168小时，优选约24至120小时，特别优选约48至96小时。
对加热方法没有特别限制，只要大批微胶囊均匀加热就行。
可用的加热和干燥方法的例子包括在恒温浴中、在液体浴中、移动浴中或干燥炉中加热和干燥、和用微波加热和干燥。优选在恒温浴中加热和干燥。
(ii)W/O/W法首先制备可生物降解聚合物的有机溶剂溶液。
可用的有机溶剂的例子包括卤代烃(如二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、三氯乙烷和四氯化碳)、醚(如乙醚和异丙醚)、脂肪酸酯(如乙酸乙酯和乙酸丁酯)、芳香烃(如苯、甲苯和二甲苯)、醇类(如乙醇和甲醇)和乙腈。其中优选卤代烃，并特别优选二氯甲烷。另外，也可把这些溶剂以适当比例混合。在这种情况下，优选卤代烃和醇的混合液，并特别优选二氯甲烷和乙醇的混合液。
可生物降解聚合物在有机溶剂溶液中的浓度根椐可生物降解聚合物的分子量和有机溶剂的类型而改变，例如，在用二氯甲烷作为有机溶剂的情况下，该浓度通常选自约0.5-70％重量，更优选约1-60％重量，特别优选约2-50％重量。
接着，把生理活性物质或其盐的溶液(溶剂的例子包括水和水和醇(如甲醇或乙醇)的混合物)加入到可生物降解聚合物的有机溶剂中(油相)。然后把该混合物用已知的方法如用均化器或超声波来乳化，以形成W/O乳液。
接着，把生成的由生理活性物质和可生物降解聚合物组成的W/O乳液加入到水相中，形成W(内水相)/O(油相)/W(外水相)乳液，接着蒸发油相中的溶剂来制备微胶囊。此时外水相的体积通常选自油相体积的约1-10,000倍、优选约5-5,000倍，并特别优选约10-2,000倍。
可向外层水相中加入的乳化剂和渗透压调节剂以及制备方法的其它方面同于上述部分(I)中的部分(i)。
(II)相分离法在制备根据本发明方法的微胶囊的情形下，向在上述部分(I)的水干燥法中介绍的含有由生理活性物质和可生物降解聚合物组成的组合物的有机溶剂溶液中，通过在搅拌下逐渐加入凝聚剂来沉淀和固化胶囊。选择凝聚剂使其体积为油相体积的约0.01-1,000倍、优选约0.05-500倍，并特别优选约0.1-200倍。
对凝聚剂没有特别限制，只要其是混有有机溶剂的且不溶解可生物降解聚合物的聚合物基的、无机油基的、或植物油基的化合物。可用的凝聚剂的具体例子包括硅氧烷油、芝麻油、豆油、玉米油、棉子油、椰子油、亚麻子油、矿物油、正己烷和正庚烷。可使用这些的两种或多种的混合物。
分离按这种方法得到的微胶囊后，用庚烷等重复洗涤来洗掉凝聚剂和除了包含生理活性物质和可生物降解聚合物的组合物之外的其它物质，然后冷冻干燥。另外，以与上述部分(I)的部分(i)中的水干燥法中所述的相同方式洗涤后，可冷冻干燥或加热干燥微胶囊。
(III)喷雾干燥法在根椐该方法制备微胶囊时，把如上述部分(I)的水干燥法中所述的含有由生理活性物质和可生物降解聚合物两组分组成的组合物的有机溶剂溶液或分散液用喷嘴喷入喷雾干燥器的干燥室中，使在细小液滴中的有机溶剂挥发并在极短的时间内制备微胶囊。喷嘴的例子包括两流体喷嘴、加压喷嘴和旋转盘。接下来，若必要，按上述部分(I)的水干燥法中所述的相同方法洗涤后，冷冻干燥或加热干燥微胶囊。
除了上述微胶囊之外的药物形式的其它例子是细颗粒(微粒)。这些细颗粒的形成为如制备微胶囊的上述部分(I)的水干燥法中所述，制备含有由生理活性物质和可生物降解聚合物两组分组成的组合物的有机溶剂溶液或分散液，在调节真空度下用旋转蒸发器等来蒸发有机溶剂和水以干燥成固体，最后用喷射研磨机等来粉碎。
另外，如制备微胶囊的上述部分(I)的水干燥法中所述的相同方法洗涤后，可冷冻干燥或加热干燥粉碎的细颗粒。
这里制备的微胶囊或细颗粒能达到相应于所用的可生物降解聚合物或乳酸-乙醇酸聚合物的分解速率的药物释放。
由本发明制备方法得到的持续释放组合物可以各种药物形式用它们本身或用它们作为原材料来制备，当肌内、皮下给药或进入器官时作为注射剂或植入物给药，当对鼻腔、直肠或子宫给药时作为透粘膜制剂、或作为口服制剂(如胶囊(如硬胶囊和软胶囊)、固体制剂如颗粒剂和粉末剂、或液体制剂如糖浆、乳液和悬浮液)。
例如，为了制备呈针剂的由本发明制备方法得到的持续释放组合物，通过用分散剂(如表面活性剂如Tween 80或HCO-60、多糖如透明质酸钠、羧甲基纤维素或藻酸钠；防腐剂(例如羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯)、等渗剂(如氯化钠、甘露糖醇、山梨醇、葡萄糖或脯氨酸)制备含水悬浮液，或用植物油如芝麻油或玉米油分散得到油悬浮液，把其制备成可实际使用的持续释放针剂。
在用悬浮针剂的情形下，根椐本发明制备方法得到的持续释放组合物的粒径应在满足分散度和通过针头的性能的范围内，以平均粒径计，应为约0.1-300μm，优选在约0.5-150μm范围内、更优选在约1-100μm范围内。平均粒径可用本身已知的方法如用激光分析型粒径分布测试体系(SALD2000AShimadzu)来测定。
在由本发明制备方法得到呈无菌制剂状的持续释放组合物的制备中，对方法没有特别限制，其例子包括对整个制备方法灭菌的方法、用γ射线进行灭菌的方法和加入抗菌剂的方法。
由于本发明的持续释放组合物具有低毒性，其也可用作用于哺乳动物(如人类、牛、猪、狗、猫、小鼠、大鼠和免子)的安全药物。
根椐所含的生理活性物质的种类，根据本发明制备方法得到的持续释放组合物可用作防止和/或治疗各种疾病的试剂，在生理活性物质如是LH-RH衍生物的情形下，其可用作防止/或治疗激素依赖疾病，特别是性激素依赖疾病如性激素依赖癌(如前列腺癌、子宫癌、乳房癌和脑垂体癌)、前列腺肥大、子宫内膜异位、子宫肌瘤、青春期早熟、痛经、闭经、经前期综合征和多腔卵巢综合征，以及避孕药(或在停止用药后利用其反弹效果用于防止和/或治疗不育症)。另外，虽然是非性激素依赖，其也可用作防止和/或治疗对LH-RH敏感的良性或恶性瘤。
根椐本发明制备方法得到的持续释放组合物的剂量根椐呈生理活性物质形式的主剂的种类和含量、药物形式、生理活性物质的释放时间、目标疾病、目标动物等而改变，该剂量应是生理活性物质的有效量。在持续释放制剂的释放时间为6个月的情形下，呈生理活性物质的主剂的每次给药的成人剂量，例如，可适当地选自优选约0.01mg-10mg/kg体重，更优选为约0.05mg-5mg/kg体重的范围。
每次给药的持续释放组合物的成人剂量可适当地选自优选约0.05mg-50mg/kg体重，更优选为约0.1mg-30mg/kg体重。
给药的次数可根椐为生理活性物质形式的主剂的种类和含量、药物形式、生理活性物质的释放时间、目标疾病、目标动物等而适当选择，例如，每几周一次，一个月一次或每几个月一次(如每3个月一次，每4个月一次或每6个月一次)。
实施例通过实施例、比较例和实验例更具体地介绍本发明，但本发明不局限于此。
实施例1由D-乳酸叔丁酯/二乙基锌/DL-丙交酯来合成PLA把二乙基锌的甲苯溶液(1/2摩尔当量)加入到在氮气氛中冷却到-78℃的40.6mg D-乳酸叔丁酯中，接着在室温下反应30分钟。然后把生成的混合物与4.14g熔化的DL-丙交酯在氮气氛下混合，接着在130℃下聚合2小时。
把反应试剂溶解在二氯甲烷中来终止聚合反应。与0.1N HCl水溶液混合并搅拌20分钟后，重复用水洗涤直到混合物变成中性。接下来，把二氯甲烷溶液浓缩并通过真空干燥(40℃，2天)，得到其中ω残基是D-乳酸叔丁酯的聚(DL-乳酸)。1H-NMR分析结果，确认了乳酸残基的次甲基氢(5.1-5.3ppm)、甲基氢(1.5-1.6ppm)和叔丁基氢(1.46ppm)。当把端基标记检测法用于该聚合物时，聚合物几乎不显示任何颜色。根椐这些发现，认为聚合物的ω残基是其中羧基是用叔丁基保护的乳酸。
接着，为了除去保护基，把该聚合物溶于三氟乙酸中并在室温下搅拌过夜。接下来，把溶液与冷异丙醚混合，聚合物沉淀下来并加以收集，用二氯甲烷/冷异丙醚进行两次再沉淀纯化。把纯化后的沉淀物溶于二氯甲烷中并用水重复洗涤直到其变成中性。然后，把二氯甲烷溶液浓缩并真空干燥(40℃，2天)，得到3.84gω残基是D-乳酸的聚(DL-乳酸)。1H-NMR分析结果，对应于叔丁基的信号完全消失，从而确认了保护基已被除去。另外，测定原子吸收的结果，剩下的锌的量低于检测限(10ppm)，从而表明用该方法有效地除去聚合催化剂。另外，当把端基标记检测法用于该聚合物时，聚合物显示深紫色，从而确认了由于脱保护又产生了羧基。GPC测试结果，重均分子量为43.0kDa，数均分子量为15.9kDa。
实施例2由D-乳酸叔丁酯/二乙基锌/DL-丙交酯来合成PLA把二乙基锌的甲苯溶液(1/2摩尔当量)加入到在氮气氛中冷却到-78℃的D-乳酸叔丁酯中，接着在室温下反应10-30分钟。然后把生成的混合物与熔化的DL-丙交酯在氮气氛下混合，接着在130℃下聚合1-5小时。
把反应试剂溶解在三氟乙酸中来终止聚合反应并除去保护基，接着在室温下搅拌1小时。接下来，把聚合物与冷异丙醚混合，使聚合物沉淀并加以收集，然后用二氯甲烷/冷异丙醚进行两次再沉淀纯化。把纯化后的沉淀物溶于二氯甲烷中并用水重复洗涤直到其变成中性。然后，把二氯甲烷溶液浓缩并真空干燥(40℃，2天)，得到其中ω残基是D-乳酸的聚(DL-乳酸)。1H-NMR分析结果，对应于叔丁基的信号完全消失，根据该发现确认保护基已被除去。另外，测定原子吸收的结果，发现剩下的锌的量低于检测限(10ppm)，从而表明用该方法有效地除去了聚合催化剂。另外，当把端基标记分析法用于该聚合物时，聚合物显示深紫色，从而确认由于脱保护产生了羧基。表1表示加入的DL-丙交酯和D-乳酸叔丁酯的组合物、摩尔比、以及聚合物的重均分子量和脱保护后的羧基的量。从表中可明显发现根成所加入的DL-丙交酯和D-乳酸叔丁酯的摩尔比，可控制聚合物的分子量。
表1

实施例3由L-乳酸苄酯/二乙基锌/DL-丙交酯来合成PLA
把二乙基锌的甲苯溶液(1/2摩尔当量)加入到在氮气氛中冷却到-78℃的181.7mg D-乳酸苄酯中，接着在室温下反应20分钟。加入1ml蒸馏过的甲苯稀释后，在氮气氛下加入15.03gDL-丙交酯并在130℃下聚合1.5小时。
把反应试剂溶解在二氯甲烷中来终止聚合反应。与0.1N HCl水溶液混合并搅拌20分钟后，重复用水洗涤直到混合物变成中性。接下来，把二氯甲烷溶液浓缩并真空干燥(40℃，2天)，得到ω残基是L-乳酸苄基酯的聚(DL-乳酸)。1H-NMR分析结果，确认了乳酸残基的次甲基氢(5.1-5.3ppm)、甲基氢(1.5-1.6ppm)和苄基的苯基氢(7.35ppm)。另外，当把端基标记分析法用于该聚合物时，聚合物几乎不显示任何颜色。根椐这些发现，认为聚合物的ω残基是其中羧基是用苄基保护的乳酸。
接着，为了除去保护基，把约一半聚合物溶于30ml三氟乙酸中，接着加入苯硫基甲烷(L-乳酸苄酯的3当量)，并在用冰冷却下搅拌1小时。接着加入甲磺酸并进一步搅拌2小时，同时用冰冷却。然后，把反应液与冷异丙醚混合，沉淀聚合物并加以收集后，用二氯甲烷/冷异丙醚进行两次再沉淀纯化。把纯化后的沉淀物溶于二氯甲烷中并用水重复洗涤直到其变成中性。然后，把二氯甲烷溶液浓缩并真空干燥(40℃，2天)，得到7.54gω残基是L-乳酸的聚(DL-乳酸)。1H-NMR分析结果，对应于苄基的苯基氢的信号完全消失，从而确认了保护基已被除去。另外，测定原子吸收的结果，剩下的锌的量低于检测限(10ppm)，从而表明用该方法有效地除去了聚合催化剂。另外，当把端基标记分析法用于该聚合物时，聚合物显示深紫色，从而确认由于脱保护又产生了羧基。
实施例4由L-乳酸苄基酯/二乙基锌/DL-丙交酯来合成PLA把二乙基锌的溶液(己烷或甲苯)(1/2摩尔当量)加入到在氮气氛中冷却到-78℃的L-乳酸苄基酯中，接着在室温下反应20分钟。然后把生成的混合物与熔化的DL-丙交酯在氮气氛下混合，接着在130℃下聚合1.5小时。
接着，把反应试剂用30ml三氟乙酸溶解来终止聚合反应并除去保护基，接着加入苯硫基甲烷(L-乳酸苄基酯的3当量)，并搅拌1小时，同时用冰冷却。虽然在下一步骤中直接用QA2，但也把QA1在室温下另外搅拌1小时。然后，把反应液与冷异丙醚混合，使聚合物沉淀并加以收集，然后用二氯甲烷/冷异丙醚进行两次再沉淀纯化。把纯化后的沉淀物溶于二氯甲烷中并用水反复洗涤直到其变成中性。然后，把二氯甲烷溶液浓缩并真空干燥(40℃，2天)，得到ω残基是L-乳酸的聚(DL-乳酸)。1H-NMR分析结果，对应于苄基的苯基氢的信号完全消失，根据该发现确认了保护基已被除去。另外，测定原子吸收的结果，发现剩下的锌的量低于检测限(10ppm)，从而表明用该方法能够有效地除去聚合催化剂。另外，当把端基标记分析法用于该聚合物时，聚合物显示深紫色，从而确认由于脱保护又产生了羧基。合成结果示于表2。
表2

实施例5由丙醇二酸二苄基酯/二乙基锌/DL-丙交酯来合成丙醇二酸封端的PLA把二乙基锌的已烷溶液(1/2摩尔当量)加入到在氮气氛中冷却到-78℃的592.8mg丙醇二酸二苄基酯中，接着在室温下反应20分钟。然后把该混合物与9.63gDL-丙交酯在氮气氛中混合，接着在130℃下聚合3小时。
把反应试剂溶解在二氯甲烷中来终止聚合反应。与0.1N HCl水溶液混合并搅拌20分钟后，重复用水洗涤直到混合物变成中性。接下来，把二氯甲烷溶液浓缩并真空干燥(40℃，2天)，得到ω残基是丙醇二酸二苄基酯的聚(DL-乳酸)。1H-NMR分析结果，确认了乳酸残基的次甲基氢(5.1-5.3ppm)、甲基氢(1.5-1.6ppm)和苄基的苯基氢(7.35ppm)。另外，当把端基标记分析法用于该聚合物时，聚合物几乎不显示任何颜色。根椐这些发现，认为聚合物的ω残基是其中羧基是用苄基保护的丙醇二酸。
接着，为了除去保护基，把215mg该聚合物溶于2ml三氟乙酸中，接着加入200μl苯硫基甲烷，并在-5℃搅拌1小时。接着加入2ml甲磺酸并进一步搅拌20分钟，同时用冰冷却，并另外在室温下搅拌25分钟。接下来，把反应液与冷异丙醚混合，沉淀聚合物并加以收集后，用二氯甲烷/冷异丙醚进行两次再沉淀纯化。把纯化后的沉淀物溶于二氯甲烷中并用水反复洗涤直到其变成中性。然后，把二氯甲烷溶液浓缩并真空干燥(40℃，2天)，得到ω残基是丙醇二酸的聚(DL-乳酸)。1H-NMR分析结果，对应于苄基的苯基氢信号完全消失，从而确认了保护基已被除去。另外，测定原子吸收的结果，剩下的锌的量低于检测限(10ppm)，从而表明用该方法能够有效地除去聚合催化剂。另外，当把端基标记分析法用于该聚合物时，聚合物显示深紫色，从而确认由于脱保护又产生了羧基。
实施例6由丙醇二酸二苄基酯/二乙基锌/DL-丙交酯来合成丙醇二酸封端的PLA把二乙基锌的甲苯溶液(1/2摩尔当量)加入到在氮气氛中冷却到-78℃的丙醇二酸二苄基酯中，接着在室温下反应20分钟。然后把该混合物与DL-丙交酯在氮气氛下混合，接着在130℃下聚合1-5小时。
把反应试剂溶解在三氟乙酸中来终止聚合反应并除去保护基，接着加入苯硫基甲烷(L-乳酸苄基酯的3当量)，并在-5℃下搅拌1小时。接着加入甲磺酸并把该混合物进一步搅拌2小时，同时用冰冷却。接下来，把反应液与冷异丙醚混合，使聚合物沉淀并加以收集，然后用二氯甲烷/冷异丙醚进行两次再沉淀纯化。把纯化后的沉淀物溶于二氯甲烷中并用水反复洗涤直到其变成中性。然后，把二氯甲烷溶液浓缩并真空干燥(40℃，2天)，得到ω残基是丙醇二酸的聚(DL-乳酸)。1H-NMR分析结果，对应于苄基的苯基氢的信号完全消失，根据该发现确认保护基已被除去。另外，测定原子吸收的结果，剩下的锌的量低于检测限(10ppm)，从而表明用该方法能够有效地除去聚合催化剂。另外，当把端基标记分析法用于该聚合物时，聚合物显示深紫色，从而确认由于脱保护又产生了羧基。另外，比较通过用丙醇二酸作为标准物的ONPH标记法得到的丙醇二酸酰肼时的吸光度，测定为聚合物的ω残基的丙醇二酸的量作为二羧基的量。合成结果列于表3中。
表3


实施例7由2-羟乙基丙二酸二-叔丁酯/二乙基锌/DL-丙交酯来合成2-羟乙基丙二酸封端的PLA把二乙基锌的甲苯溶液(1/2摩尔当量)加入到在氮气氛中冷却到-78℃的482.4mg2-羟乙基丙二酸二-叔丁基酯中，接着在室温下反应30分钟。然后把生成的混合物与3.43g熔化的DL-丙交酯在氮气氛下混合，接着在130℃下聚合2小时。
把反应试剂溶解在二氯甲烷中来终止聚合反应。与0.1N HCl水溶液混合并搅拌20分钟后，重复用水洗涤直到混合物变成中性。接下来，把二氯甲烷溶液浓缩并真空干燥(40℃，2天)，得到ω残基是2-羟乙基丙二酸二-叔丁基酯的聚(DL-乳酸)。1H-NMR分析结果，确认了乳酸残基的次甲基氢(5.1-5.3ppm)、甲基氢(1.5-1.6ppm)和叔丁基氢(1.46ppm)。当把端基标记分析法用于该聚合物时，聚合物几乎不显示任何颜色。根椐这些发现，认为聚合物的ω残基是其中羧基是用叔丁基保护的2-羟乙基丙二酸。
然后，用与实施例1相同的方式进行脱保护反应，得到2.98gω残基是2-羟乙基丙二酸的聚(DL-乳酸)。1H-NMR分析结果，对应于叔丁基的信号完全消失，从而确认保护基已被除去。另外，测定原子吸收的结果，剩下的锌的量低于检测限(10ppm)，从而表明用该方法能够有效地除去聚合催化剂。另外，当把端基标记分析法用于该聚合物时，聚合物显示深紫色，从而确认由于脱保护又产生了羧基。
实施例8由2-羟乙基丙二酸二-叔丁基酯/二乙基锌/DL-丙交酯合成2-羟乙基丙二酸封端的PLA用2-羟乙基丙二酸二-叔丁基酯来代替D-乳酸叔丁酯用与实施例2相同的方法进行合成，来获得其中ω端是2-羟乙基丙二酸二-叔丁基酯的聚(DL-乳酸)。
1H-NMR分析结果，对应于叔丁基的信号完全消失，根据该发现，确认保护基已被除去。另外，测定原子吸收的结果，发现剩下的锌的量低于检测限(10ppm)，从而表明用该方法能够有效地除去聚合催化剂。另外，当把端基标记分析法用于该聚合物时，聚合物显示深紫色，从而确认由于脱保护又产生了羧基。另外，比较通过用丙醇二酸作为标准物的ONPH标记法得到的丙醇二酸酰肼时的吸光度，测定为聚合物的ω残基的2-羟乙基丙二酸的量作为二羧基的量。合成结果列于表4中。
表4

实施例9酸解把800mg在实施例2中合成的聚合物PA5和PA6的相等混合物溶于2ml二氯甲烷中，把生成的溶液与15ml 1％的含水乳酸混合，接着在65℃下搅拌。在预定的时间对聚合物取样，在用水洗涤并干燥后，进行GPC测试和端基标记分析。其结果示于表5中。从表5中可以清楚地看出，羧基的量几乎与反应时间成正比增加，并由酸解反应可控制聚合物的性能。
表5

实施例10把含有0.6g 5-氧代-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5(下文简称为肽A)的乙酸盐的0.6ml水溶液、和7ml含有2.4g在实施例6(试验号RA4)中合成的其中ω残基是丙醇二酸的(DL-乳酸)的二氯甲烷溶液混合，并用均化器乳化，得到W/O乳液。接着，把该乳液倒入800ml预冷到18℃的聚乙烯醇(EG-40，Nippon Synthetic Chemical Industry)的0.1％(w/w)水溶液中，并把该混合物用涡轮均混器以7000rpm搅拌，得到W/O/W乳液。在室温下搅拌该W/O/W乳液3小时以挥发二氯甲烷并固化油相后，用筛目大小为75μm的筛子进行过滤，之后用离心分离器(05PR-22，Hitachi Ltd.)在2000ppm条件下分离和捕获微胶囊5分钟。把微胶囊再分散在蒸馏水中后，把分散液再进行离心分离，接着洗涤掉游离的化学品等。加入少量蒸馏水再分散捕获的微胶囊后，对其冷冻干燥得到粉末。微胶囊的质量回收率为38％，微胶囊的肽A的含量为18.9％。由实际含量除以加料量得到的胶囊化效率为94.6％.
实施例11以与实施例10相同的方式制备微胶囊，除了把实施例10中的W/O乳液的组成改变成0.8ml含有0.8g肽A的乙酸盐的水溶液、和13ml含有3.2g在实施例6(试验号RA6)中合成的其中ω残基是丙醇二酸的(DL-乳酸)的二氯甲烷溶液。微胶囊的质量回收率为69％，微胶囊的肽A的含量为19.1％。由实际含量除以加料量得到的胶囊化效率为95.3％.。
实施例12以与实施例10相同的方式制备微胶囊，除了把实施例10中的W/O乳液的组成改变成0.6ml含有0.6g肽A的乙酸盐的水溶液、和4ml含有2.4g在实施例8(试验号SA1)中合成的其中ω残基是2-羟乙基丙二酸的(DL-乳酸)的二氯甲烷溶液。微胶囊的肽A的含量为16.3％。由实际含量除以加料量得到的胶囊化效率为81.3％。
比较例1以与实施例10相同的方式制备微胶囊，除了把实施例10中的W/O乳液的组成改变成1ml含有1g肽A的乙酸盐的水溶液、和5ml含有4g聚(DL-乳酸)(PLA25000，Mw25.9k，[COOH]＝98.2μmol/g，Wako Pure ChemicalIndustries)的二氯甲烷溶液。微胶囊的质量回收率为49％，微胶囊的肽A的含量为11.4％。由实际含量除以加料量得到的胶囊化效率为57.1％。
实验例1把在实施例10和实施例12中得到的约50mg微胶囊分散在0.3ml分散剂(0.15mg羧甲基纤维素、0.3mg Polysorbate 80和15mg甘露糖醇，溶于蒸馏水中)中，用22G注射器针头把生成的分散液皮下给药于8周龄的雄性SD大鼠。给药1天后杀死大鼠，取出在给药位置余下的微胶囊，并检测在那些微胶囊中的肽A的量。结果，在微胶囊中肽A的含量分别为95.6％和87.1％。
由于在实施例10和12中得到的肽A的含量显著大于比较例1中的量，很明显本发明的聚酯作为含有高含量生理活性物质的持续释放制剂的基础材料是优越的，并且根椐实验例1，用该聚酯的制剂具有给药后极好地抑制药物初始释放的效果。
实施例13以与实施例10相同的方式制备微胶囊，除了把实施例10中的W/O乳液的组成改变成0.8ml含有0.8g肽A的乙酸盐的水溶液、和含有在实施例4(试验号QA1)中合成的3.08g聚合物、0.12g3-羟基-2-萘酸、5ml二氯甲烷和0.3ml乙醇的作为油相的溶液。微胶囊的质量回收率为46％，微胶囊的肽A的含量为21.3％。由实际含量除以加料量得到的胶囊化效率为106.6％。
比较例2以与实施例10相同的方式制备微胶囊，除了把实施例10中的W/O乳液的组成改变成1ml含有1g肽A的乙酸盐的水溶液、和含有3.85g聚(DL-乳酸)(PLA25000，Mw25.9k，[COOH]＝98.2μmol/g，Wako Pure ChemicalIndustries)、0.15g 3-羟基-2-萘酸、5.5ml二氯甲烷和0.35ml乙醇的作为油相的溶液。微胶囊的质量回收率为49％，微胶囊的肽A的含量为21.3％。由实际含量除以加料量得到的胶囊化效率为106.5％。
比较例3以与实施例10相同的方式制备微胶囊，除了把实施例10中的W/O乳液的组成改变成0.8ml含有0.8g肽A的乙酸盐的水溶液、和含有3.08g由开环聚合合成的聚(DL-乳酸)(Mw24.9k，[COOH]＝12.3μmol/g，Boehrnger-Ingelheim)、0.12g 3-羟基-2-萘酸、5.5ml二氯甲烷和0.3ml乙醇的作为油相的溶液。微胶囊的质量回收率为29％，微胶囊的肽A的含量为10.9％。由实际含量除以加料量得到的胶囊化效率为54.6％。
实验例2把在实施例13和比较例2中得到的每一种约40mg微胶囊分散在0.3ml分散剂(0.15mg羧甲基纤维素、0.3mg Polysorbate 80、和15mg甘露糖醇，溶于蒸馏水中)中，用22G注射器针头把所得的分散液皮下给药给8-10周龄的雄性SD大鼠。给药后分多次杀死大鼠，取出在给药位置余下的微胶囊，并检测在那些微胶囊中的肽A的量。结果示于表6中。
表6

根椐实施例13和比较例2的实验结果，本发明的聚酯是含有高含量生理活性物质的持续释放制剂的优秀基础材料。另外，根椐实验例2的结果，用该聚酯的制剂明显地表现出在极长的时间内稳定释放所含药物。
实施例14由DL-乳酸叔丁酯/二乙基锌/DL-丙交酯合成PLA把1.242g DL-乳酸叔丁酯加入到装有冷凝捕集器且容量为500ml的三颈烧瓶反应器中，在室温下在氮气氛中加入3.8ml的1.0mol/L二乙基锌的己烷溶液，接着加入34.2ml脱水的正己烷稀释。接着加入100gDL-丙交酯并搅拌，得到均匀的混合物。开始加热并在冷凝器外捕集在65-70℃蒸掉的己烷。在基本上不再蒸出己烷后在150℃下反应1小时。
把反应试剂溶解在50ml二氯甲烷后，向该溶液中加入100ml三氟乙酸来终止反应，并除去保护基，随后在室温下搅拌1小时。接下来，在与冷异丙醚混合，沉淀聚合物并加以收集后，用二氯甲烷/冷异丙醚进行两次再沉淀纯化。把纯化后的沉淀物溶于二氯甲烷中并用水重复洗涤直到其变成中性。然后，把二氯甲烷溶液浓缩并真空干燥(40℃，2天)，得到其中ω残基是DL-乳酸的聚(DL-乳酸)。GPC测试结果，重均分子量为35.0kDa，数均分子量为13.6kDa。当把端基标记分析法用于该聚合物时，聚合物显示深紫色，定量分析结果表明端羧基的量为67.7μmol/g。
工业应用本发明能够提供一种可生物降解聚合物的制备方法，该聚合物可使生理活性物质高效地加入到持续释放制剂中，并具有高纯度和极低量的残余催化剂。本发明还提供了一种方便目标可生物降解聚合物的分子量和游离羧基的量的调节的可生物降解聚合物的制备方法。
权利要求
1.一种制备在ω-端具有游离羧基的可生物降解聚合物的方法，包括在羧基被保护起来的羟基单羧酸衍生物或两个羧基被保护起来的羟基二羧酸衍生物的存在下，把环酯化合物进行聚合反应，和，把所得的在ω-端具有被保护起来的羧基的聚合物进行脱保护反应。
2.权利要求1中所述的方法，其中羧基被保护的羟基单羧酸衍生物是羧基被保护的乙醇酸，羧基被保护的L-乳酸、羧基被保护的D-乳酸或羧基被保护的DL-乳酸。
3.权利要求1中所述的方法，其中羧基被保护的羟基单羧酸的保护基是叔丁基或苄基。
4.权利要求1中所述的方法，其中羧基被保护的羟基二羧酸衍生物是丙醇二酸二苄基酯或2-羟乙基丙二酸二-叔-丁基酯。
5.权利要求1中所述的制备方法，其中环酯化合物是环单酯化合物或环双酯化合物。
6.权利要求1中所述的制备方法，其中脱保护反应是酸解反应。
7.一种制备在ω-端具有游离羧基的可生物降解聚合物的方法，包括在羧基被保护起来的羟基单羧酸衍生物的存在下把环酯化合物进行聚合反应，和，把所得的在ω-端具有被保护起来的羧基的聚合物进行脱保护反应。
8.权利要求7中所述的方法，其中在脱保护反应后进行酸水解反应。
9.权利要求1或7中所述的方法，其中可生物降解聚合物是用在至少约6个月期间释放生理活性物质的持续释放制剂中的可生物降解聚合物。
10.由权利要求1或7中所述的方法制备的可生物降解聚合物。
11.一种持续释放制剂，包含权利要求10中所述的可生物降解聚合物。
12.权利要求11中所述的持续释放制剂，还包括生理活性物质。
13.权利要求12中所述的持续释放制剂，其中生理活性物质是LH-RH衍生物或其盐。
全文摘要
公开了一种制备在ω－端具有游离羧基的可生物降解聚合物的方法,特征在于:在羧基被保护起来的羟基单羧酸衍生物或两个羧酸被保护起来的羟基二羧酸衍生物的存在下,把环酯化合物进行聚合反应,然后把如此得到的在ω－端具有被保护起来的羧基的聚合物进行脱保护反应。使用上述方法可容易控制目标可生物降解聚合物的分子量和其中游离羧基的量,从而有效地制备具有高纯度且几乎没有被其中残余的催化剂污染的聚合物。
文档编号A61K47/34GK1334834SQ99815914
公开日2002年2月6日 申请日期1999年12月14日 优先权日1998年12月15日
发明者畑善夫, 猪狩康孝 申请人:武田药品工业株式会社