hsa-miR-487a在制备治疗或术后预防肝癌的药物中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种内源性的非编码小miRNAs、包含其的药物组合物，以及其用于治 疗或术后预防肝癌的新用途，特别地，涉及一种hsa-miR-487a用于治疗或术后预防肝癌药 物中的用途。
【背景技术】
[0002] 众所周知，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝癌）是全球男性第 五大常见肿瘤，具有预后恶劣、死亡率高等特点，严重威胁我国人民的生命与健康。如2008 年世界新增肝癌病例为7483万人，而同年肝癌死亡病例高达到6959万人，其发病率与死 亡率几近1:1。尽管近年来随着影像诊断与手术技术的不断进步以及以索拉非尼为代表的 肝癌靶向治疗药物的面世，为肝癌的早期诊断与治疗提供了可能与更多且更有效的治疗选 择，使肝癌的治疗水平得到了一定的提高。
[0003] 然而，综观目前肝癌临床治疗现状，肝癌术后复发转移率仍高居不下，术后5年生 存率仍徘徊在30%上下，严重的制约了肝癌总体治疗水平的提高，无法使之得到根本性的 改善。宄其原因就是尚未完全弄清楚肝癌发生、发展与侵袭转移的确切机制。这严重制约 了对肝癌进展过程的理解和对新的治疗肝癌药物的研发。因此，如何深入研宄探讨HCC发 生、发展与侵袭转移的机制已成为现今HCC研宄领域中的一个十分重要科学问题。
[0004] 微小RNA (microRNAs，简称miRNAs)是一类长度约为20~24nt，有显著生物学意 义的内源性非编码蛋白质的单链小RNA分子。miRNA于基因转录后阶段发挥相应的调控作 用。据已有文献估计，miRNA能够对体内约1/3的蛋白合成起到调控作用，miRNAs可广泛参 与不同生理及病理过程的调节，如发育、凋亡、分化、增殖、代谢、应激等。
[0005] 鉴于miRNA常常定位于染色体易于丢失、重排、扩增的脆点，致使miRNA定位的染 色体脆点部分易于出现缺失、重排、扩增，进而导致miRNA表达出现异常，并直接导致细胞 增殖、分化、转移、凋亡等功能也随之发生异常改变，诱使肿瘤细胞的出现。miRNA强大的功 能及特殊的生成、调控方式已经吸引了众多学者的关注，目前大量研宄已证明miRNA在肿 瘤的发生、增殖、分化、侵袭、转移、凋亡方面均发挥重要的作用，在肿瘤的诊断、预后评估、 治疗等领域开始崭露头角。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术中存在的问题，本发明人通过研宄发现了与肝癌侵袭转移和 肝癌增殖过程密切相关的分子机制，并利用在该分子机制中起关键作用的小分子RNA-- hsa-miR-487a的表达量的变化和作用通路，提供了用于治疗肝癌的药物组合物。
[0007] 根据本发明的一个方面，提供了一种药物组合物，其包含小分子核酸 hsa_miR-487a〇
[0008] 进一步地，小分子核酸hsa-miR-487a与递送载体相连接后用于药物组合物中D
[0009] 进步一地，递送载体为吗啉代核酸。
[0010] 根据本发明的另一方面，还提供了一种小分子核酸hsa-miR-487a在制备治疗或 术后预防肝癌的药物中的应用。
[0011] 进步一地，应用包括将小分子核酸hsa-miR_487a与递送载体连接后用于药物中。
[0012] 进步一地，递送载体为吗啉代核酸。
[0013] 进步一地，药物为用于肝癌的生长期或肝癌转移期的药物。
[0014] 进步一地，含有小分子核酸hsa-miR_487a的肝癌诊断试剂盒。
[0015] 根据本发明的另一方面，还提供了一种用于检测肝癌的试剂盒，试剂盒包括小分 子核酸 hsa_miR-487a。
[0016] 本发明具有以下有益效果：
[0017] 1.本发明通过研宄首次证实hsa-miR-487a的作用通路，及其具有可促进肝癌细 胞的侵袭转移与增殖的作用的特性。利用该特性，将具有该结构的miRNA与现有的药物载 体相结合，给药后，该药物能有效抑制动物体内该基因的表达，从而抑制肝癌细胞的增殖和 转移，从而达到提高肝癌患者预后的目的。
[0018] 2.本发明提供的hsa-miR_487a的应用包括了对于肝癌的治疗或术后预防。
[0019] 3.本发明通过研宄首次证实名为hsa-miR-487a的miRNA在肝癌中存在高表达，利 用该RNA的这一特性，可以用于制备检测潜在肝癌患者的试剂盒。
[0020] 除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。 下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
【附图说明】
[0021] 构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实 施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0022] 图1示出肝细胞癌芯片结果示意图；
[0023] 图2示入选550例患者的纳入排除及分组过程的流程示意图；
[0024] 图3示hsa-miR-487a在肝细胞癌中的表达水平，其中图A与图B分别示训练队列 和验证队列中肝癌hsa-miR_487a的表达水平，红线示癌组织中hsa-miR_487a高于癌旁组 织2倍水平，在两个队列中分别有85/132与43/66例样本中癌组织hsa-miR-487a表达水 平高于癌旁组织两倍以上；图C示在两个队列中，统计显示癌组织中hsa-miR-487a表达水 平均显著高于癌旁组织；图D示在两个队列肝细胞癌的三种亚型中，hsa-miR-487a在高转 移潜能的亚型NHCC中表达显著高于低转移潜能的SHCC与SLHCC组；
[0025] 图4示肝癌组织与癌旁组织中hsa-miR-487a表达水平。采用原位杂交技术检测肝 癌组织石赌固定切片中hsa-miR-487a表达水平。图A示阴性对照原位杂交探针Scramble 结果图，图B示作为内参及阳性对照的原位杂交探针U6结果图，图C示采用hsa-miR-487a 探针检测检测样本中hsa-miR-487a表达水平。图片中蓝色为原位杂交探针阳性颗粒，红色 为核固红非特异性核染料。图中可见hsa-miR-487a在肝癌组织中表达显著高于癌旁组织， 两者之间可看到显著的分界线；
[0026] 图5示正常肝细胞系与肝癌细胞系中hsa-miR_487a表达水平。采用realtime-PCR 检测原代肝细胞系（PHH)，正常肝细胞系（L02)与肝癌细胞系〇fepG2, PLC，Bel7402， 皿!1〇：97-1^，5丽07721，!111117，!1印38，]\^〇：97-!1，!^〇1〇)细胞系中11831^1?-4873的表达水平。 hsa-miR-487a在肝癌细胞系中表达均高于正常肝细胞系；
[0027] 图6示肝癌组织中高表达hsa-miR_487a的患者往往具有相对差的总体生存率与 无病生存率。图A与图B分别示意训练队列与验证队列中hsa-miR-487a高低表达组中总 体生存率和无病生存率。hsa-miR-487a低表达组中患者具有较好的术后总体生存率与无病 生存率；
[0028] 图7示采用慢病毒感染肝癌细胞系感染效率。亮视野（Brightfield)示光镜下所 见，绿色荧光（GFP)示同视野下成功被感染慢病毒的细胞。叠加图（Merge)则是将亮视野与 绿色荧光图叠加后所获得的图片，可清晰看出镜下已成功感染病毒与未感染病毒的细胞；
[0029] 图8示采用慢病毒感染肝癌细胞系后其中hsa-miR-487a的表达水平。图A 示空白的HCCLM3细胞系（untreated)和HCCLM3细胞系感染hsa-miR-487a干预病毒 (Anti-hsa_miR-487a)或阴性对照病毒（Negative control，NC)后其中 hsa_miR-487a 表 达水平。图B示空白的HepG2细胞系（untreated)和HepG2细胞系感染hsa-miR_487a过 表达病毒（hsa_miR-487a)或阴性对照病毒（Negative control，NC)后其中 hsa_miR-487a 表达水平；
[0030] 图9示hsa-miR-487a具有促进肝癌细胞的增殖的作用。图A示7天细胞增殖曲 线，可见干预hsa-miR_487a表达后（Anti-hsa_miR-487a)可抑制肝癌细胞系HCCLM3的增 殖能力，而过表达hsa-miR-487a后可促进肝癌细胞系H印G2的增殖能力。图B左图示克隆 形成试验结果，右图示克隆数目统计，干预hsa-miR-487a表达后细胞克隆形成能力下降， 过表达hsa-miR-487a表达后细胞克隆形成能力增强。图C左图示细胞周期结果图，右图示 结果统计图，统计结果示hsa-miR-487a能够促进细胞由G0/G1期进入G2/M期；
[0031] 图10示采用Edu染料标记增殖细胞证实hsa-miR-487a促进肝癌细胞的增殖。图 AH〇echeSt33342为细胞核染料，标记所有细胞细胞核为蓝色。Edu为胸腺嘧啶类似物，标记 处于增殖周期的细胞系为红色。Overlay示将Hoechest33342与Edu图叠加，红色细胞为处 于增殖期细胞，蓝色为处于静息期的细胞。图B为图A中各组中处于增殖期的细胞占细胞 总数的比例；
[0032] 图11示hsa-miR-487a具有促进肝癌细胞的转移与迀移能力的作用。图A示 hsa-miR-487a促进肝癌细胞的转移能力。左图示Transwe