[0020] 在多个实施方式中，瘤形成是前列腺癌且第一和第二肿瘤抗原是不同的抗原，选 自PSCA、PSMA、CD19、CD133、巨细胞病毒（CMV)感染细胞抗原、erb-B2、KDR、间皮素、NKG2D 配体、NY-ES0-1、癌胚抗原（h5T4)、VEGF-R2和WT-1。在多个实施方式中，瘤形成是乳腺癌 且第一和第二肿瘤抗原是不同的抗原，选自HER2、MUCl、⑶44、⑶49f、EpCAM、CEA、⑶133、巨 细胞病毒（〇1^)感染细胞抗原46?-246?-404?041、6吐-82,3,4、？8?、1(01?、间皮素、疆620 配体、NY-ES0-l、癌胚抗原（h5T4)、PSCA、PSMA、VEGF-R2或WT-l。在特定实施方式中，瘤形 成是B细胞白血病且第一和第二肿瘤抗原选自CDlO和CD19。在某些实施方式中，瘤形成是 多发性骨髓瘤且第一和第二肿瘤抗原选自CD56和CD138。在多个实施方式中，瘤形成是卵 巢癌且第一和第二肿瘤抗原是不同的抗原，选自间皮素、叶酸受体_a、CD44和CD133。
[0021] 本发明提供为靶向肿瘤细胞提供T细胞的组合物和方法。本发明限定的组合物和 物品是分离的或者另外根据下面提供的实施例制备。本发明的其他特点和优点从详细说明 和权利要求中将是显而易见的。
【附图说明】
[0022] 图IA-C是描述嵌合抗原受体（CAR)和嵌合共刺激受体（CCR)载体设计以及经由 原代人类T细胞转导的表达的图。（A)描述了通过将免疫球蛋白可变域的重链和轻链与CD8 跨膜域（其被融合至CD3的胞质信号转导域）融合生成CAR。通过使用内部核糖体进入位点 (IRES)实现双顺反子表达，CAR表达可通过关联dsRED荧光而很容易地被检测（数据未示 出）。通过将scFv融合至CD28跨膜和信号转导域 15 (其被融合至4-1BB (aka CD137)胞质信 号转导域）而生成CCR21。CCR表达可以与hrGFP的双顺反子表达相关联（数据未示出）。缩 写：LTR-长末端重复；SD-剪接供体位点；SA-剪接受体位点；VH或分别为可变重域或可 变轻域；EC-胞外域；TM-跨膜域；C-胞质域；IRES-内部核糖体进入位点；dsRED-Discosoma 菌株红色荧光蛋白，hrGFP-人重组绿色荧光蛋白。（B)描述了使用这些逆转录病毒载体的 原代人T细胞的代表性转导效率。（C)描述了本研宄中用不同的多种CAR进行的CTL转导。
[0023] 图2A-D显示了当结合两个抗原时，双受体（CAR/CCR)介导的人类T细胞激活可实 现强健的CTL功能、长期的增殖以及增强的肿瘤根除。（A)显示与未转导或经P28BB转导的 T细胞相比，在CTL实验中当T细胞表达⑶19特异性CAR时，表达嵌合受体的T细胞溶解 抗原阳性细胞。制图是η >4试验的代表，误差条表示3个重复实验的均值的标准差。（B) 显示了与表达两种或单独表达抗原之一的人肿瘤细胞系共培养的T细胞在31天内的T细 胞长期增殖（绝对T细胞计数），所述T细胞不表达、表达一种或两种嵌合受体。箭头表示 使用经新鲜辐照的肿瘤细胞重刺激T细胞。只有在表达双受体的T细胞遇到两种抗原时才 观察到强健的长期增殖。制图是η > 4试验的代表，误差条表示3个重复实验的均值的标 准差。（C)描述了肿瘤感应T(TTS)细胞的全身性肿瘤根除的效力，通过将LOX IO6的T细 胞静脉（IV)注射到携带表达荧光素酶的表达CD19+PSMA+PC3人前列腺肿瘤的NSG小鼠而进 行评估。通过使用BLI每周定量测定肿瘤负荷。示出来自每组的两只代表性小鼠的图像， 肿瘤发光的像素强度以彩色表示。对平均肿瘤负荷进行制图，误差条表示来自每组6只小 鼠的均值的标准差。（D)描述了使用三肿瘤小鼠模型的DP肿瘤选择性根除，通过皮下注射 I X IO6的PC3肿瘤细胞，每种单独对⑶19呈阳性的细胞注射入左肋，单独对PSMA呈阳性的 细胞注射入右肋，对CD19和PSM都呈阳性的细胞注入小鼠背部。在肿瘤注入后7天静脉 注入表达嵌合受体的19zl或Ρ28ΒΒ或19zl+P28BB的T细胞。示出携带这些肿瘤的每组两 只小鼠的代表性图像，肿瘤发光以彩色表示。用卡钳定量测量肿瘤，并对每个肿瘤的肿瘤体 积相对于时间作图。误差条表示6只小鼠的均值的标准差。用双尾非配对t检验来确定统 计学显著性，以比较由19zlT细胞和19zl+P28BB T细胞得到的值，p值表示为* < 0. 05或 林 < 0· Ol0
[0024] 图3Α-Ε描述了当靶向两种前列腺肿瘤抗原时，肿瘤感应T(tts)细胞选择性地根除 人类前列腺肿瘤。（A)描述了对三种不同的特异于PSCA的scFv组装到双特异性抗体中的 评价，该双特异性抗体还具有对CD3的特异性。将T细胞与PSCA+PC3肿瘤细胞以20:1的 比率共同培养且加入不同量的抗体，并测定特异性溶解。（B)描述了使用在细胞毒性测定 中表现出不同效力的抗PSCA scFv来产生CAR。CAR介导的表达PSCA的靶细胞的特异性裂 解证实了 LzIscFv的较弱效力：其需要50倍高的效应物：革E标比率以达到与Hzl或Mzl相 同的细胞溶解水平。（C)和（D)描述了表达PSCA和PSM的全身性前列腺肿瘤的选择性根 除，通过用这些低效的scFv进行研宄。如图2所示，确立肿瘤（图5)并进行处理。14天 后，对Mzl+P28BB (图3C)或Lzl+P28BB (图3D)静脉注射I. 0 X IO6的嵌合受体阳性T细胞。 示出每组两只代表性小鼠的图像，肿瘤发光以彩色示出（从蓝色=5X IO5至红色=2X10 7 光子）。平均肿瘤负荷通过发光而加以定量并进行制图，误差条表示每组5只小鼠的均值 的标准差。接受PSMA肿瘤的两只小鼠（绿线）在49天后死亡，因此发光均值通过从56天 和63天的3个值求均值得到。图3E :与图2D类似，在还有PSCATSMA+和PSCA +PSM/Γ的小 鼠中，通过Lz 1+P28BB T细胞实现了仅对PSCA+PSM+肿瘤的选择性抗肿瘤反应。用双尾非 配对t检验来确定统计学显著性，以比较由LzlT细胞和Lzl+P28BB T细胞得到的值，p值 表示为 * < 0· 05 或 ** < 0· 01。
[0025] 图4A-D描述了当在DP肿瘤上共培养时，发现由TTS引起的增强的细胞因子分泌 和BclxL表达。（A)描述了在使用未转导的PC3细胞（空）或⑶19+PSMA+PC3细胞进行第一 抗原刺激之后48小时对未转导T细胞或用19zl、P28BB或二者进行转导的T细胞的多重细 胞因子分析。误差条代表2个生物学复制品的均值的标准差。（B-D)描述了对未转导T细 胞、或者用 Hzl (B) ;Mzl (C)和 Lzl (D)转导的 T 细胞（抗 PSCA CAR、P28BB CAR 或 CAR+CCR 二者）的多重细胞因子分析，示出在用空白或用PSCA+PSMA+PC3细胞进行第二抗原刺激后 48小时的结果。（E)描述了在初始抗原刺激后的24小时后，使用未转导T细胞或用19zl、 P28BB或二者进行转导的T细胞的细胞裂解物进行的BclxL蛋白质印迹分析。Akt的总量 被用作负载对照。
[0026] 图5描述了产生前列腺肿瘤细胞用以表达融合蛋白GFP-萤火虫荧光素酶（GFP/ Luc)和肿瘤抗原。使用逆转录表达构建体，用GFP/Luc以及⑶19、PSMA、PSCA或两种抗原 的组合对未转导的PC3细胞（空白）进行转导。通过对GFP/Luc、⑶19、PSM和/或PSCA 的双提纯FACS提纯细胞。
[0027] 图6A-C图示了肿瘤感应T细胞的构思。（A)描述了表达有效CAR的TTS细胞，经 A+113+细胞有效刺激而促进针对A +细胞的免疫应答。CAR +CCR+细胞能够结合具有提供CD3 激活信号的CAR的肿瘤抗原A+细胞。这能够导致短期细胞溶解。CAR+CCR +细胞能够结合具 有提供CD28和CD137信号的CCR的肿瘤抗原B+细胞。该信号单独不足以引发细胞溶解或 增殖。只有当CAR +CCR+细胞结合具有CAR和CCR的肿瘤抗原A +B+细胞时，才能同时提供激 活和刺激。这导致强健的裂解、T细胞增殖、增强的细胞因子分泌、BclxL的上调以及在体内 选择性根除肿瘤的能力。然而，取决于CAR的效力，这些CAR +CCR+细胞能够潜在地再循环而 裂解单独对CAR特异性抗