分粉碎后过10目筛，称取100g，用体积分数为70%的乙醇溶液在90°C条件下加热回流提取4次，每次2h，合并提取液，用2层40目纱布过滤，然后用旋转蒸发仪在45°C下减压浓缩蒸干至膏状，得到大蓟乙醇粗提物，黄酮含量为4.05mg/g ;
[0044](2)对步骤(I)制备得到的大蓟乙醇粗提物采用等体积石油醚脱脂，萃取至基本无颜色为止；然后上大孔树脂AB-8，水洗脱至无色；再用体积分数为50%的乙醇溶液洗脱，洗脱液用旋转蒸发仪在45°C下减压浓缩蒸干，即制得植物总黄酮(CJF);测得其黄酮含量为 203.33mg/go
[0045]实施例3从大蓟根上部分中制备得到CJF
[0046](I)将购买的大蓟根上部分粉碎后过100目筛，称取100g，用体积分数为70%的乙醇溶液在100°c微沸状态下加热回流提取3次，每次4h，合并提取液，用2层40目纱布过滤，然后用旋转蒸发仪在40°C下减压浓缩蒸干至膏状，得到大蓟乙醇粗提物，黄酮含量为4.17mg/g ；
[0047](2)对步骤(I)制备得到的大蓟乙醇粗提物采用等体积石油醚脱脂，萃取至基本无颜色为止；然后上大孔树脂AB-8，水洗脱至无色；再用体积分数为50%的乙醇溶液洗脱，洗脱液用旋转蒸发仪在40°C下减压浓缩蒸干，即制得植物总黄酮(CJF);测得其黄酮含量为 203.33mg/go
[0048]实施例4 MTT法检测CJF对肝癌细胞H印G2增殖的影响
[0049]将H印G2细胞以I X 15个/mL浓度接种于96孔细胞培养板(100 μ L/孔)，置37°C，5% CO2恒温培养箱中培养；待孔板中的细胞完全贴壁后，加入含有不同终浓度(25 μ g/mL、50 μ g/mLU00 μ g/mL、200 μ g/mL、400 μ g/mL)CJF(实施例1 制备)的细胞培养液100 μ L，同时设细胞对照组，即加入与样品液等量的完全培养液；阳性对照组，加与样品同浓度梯度同体积的五-氟尿嘧啶作为阳性对照，每个浓度设6个平行。在37°C，5% CO2培养箱中继续培养，24h后取出，倒置显微镜观察细胞形态的变化。用ImL注射器小心地吸弃96孔板中的培养液，用不含钙、镁离子的PBS洗板2次，然后每孔加入5mg/mL的MTT溶液20 μ L(需关灯操作，MTT见光易分解)和DMEM完全培养液180 μ L，在37°C，5% CO2培养箱中继续培养4h。小心吸弃孔内的细胞培养液，每孔加入150 μ L DMS0，振荡1min ;用酶联免疫检测仪在波长为490nm下测定其吸光度值。
[0050]结果见图1，CJF能够抑制HepG2细胞增殖，并呈现梯度依赖性。
[0051]实施例5 CJF对四氯化碳损伤的正常人肝细胞L02细胞的保护作用
[0052]取对数生长期的L02细胞，以IX 15个/mL浓度接种于96孔细胞培养板(100 μ L/孔)，置37°C，5 % CO2恒温培养箱中培养。待孔板中的细胞完全贴壁后，吸弃上清，按如下分组要求给药，每组6个复孔。样品组:加入含有不同终浓度(12.5 μ g/mL、25 μ g/mL、50 μ g/mLUOO μ g/mL、200 μ g/mL)CJF(实施例1制备)的细胞培养液；正常细胞对照组和模型组(control组):加入与样品液等量的培养液；阳性对照组:加入与样品组相同浓度梯度的水飞蓟素。6h后除正常细胞对照组加入不含0:14的100 μ L培养液，其余各孔中都加10yL含CCl4(10mmol/L)的培养液。37°C，饱和湿度，5%的CO2恒温培养箱中培养24h后，倒置显微镜观察细胞形态的变化。并小心地吸弃96孔板中的培养液，用不含钙、镁离子的PBS洗板2次，然后每孔加入5mg/mL的MTT溶液20 μ L (需关灯操作，MTT见光易分解)和DMEM完全培养液180 μ L，在37°C，5% CO2培养箱中继续培养4h。小心吸弃孔内的细胞培养液，每孔加入150 μ L DMS0，振荡lOmin。用酶联免疫检测仪在波长为490nm下测定其吸光度值。
[0053]结果见图2，与模型组对比，样品组细胞存活率显著增大，并呈现浓度依赖性，且细胞存活率与阳性对照相当。
[0054]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种植物总黄酮的制备方法，其特征在于包含如下步骤: (1)将大蓟根上部分粉碎过筛，然后用乙醇溶液加热回流提取，提取液过滤，然后减压浓缩蒸干至膏状，得到大蓟乙醇粗提物； (2)对步骤(I)制备得到的大蓟乙醇粗提物采用石油醚脱脂，然后上大孔树脂，水洗脱至无色；然后用乙醇溶液洗脱，洗脱液减压浓缩蒸干，得到植物总黄酮。
2.根据权利要求1所述的植物总黄酮的制备方法，其特征在于； 步骤(I)中所述的乙醇的体积分数为70%。
3.根据权利要求1所述的植物总黄酮的制备方法，其特征在于； 步骤(I)中所述的加热回流提取的温度为90?100°C ;所述的加热回流提取次数为2?4次；所述的加热回流提取每次提取的时间为2?4h。
4.根据权利要求1所述的植物总黄酮的制备方法，其特征在于； 步骤(I)中所述的过筛的目数为10?100目； 步骤(I)中所述的减压浓缩的温度为40?45°C。
5.根据权利要求1所述的植物总黄酮的制备方法，其特征在于； 步骤(2)中所述的石油醚与大蓟乙醇粗提物的体积比为1:1。
6.根据权利要求1所述的植物总黄酮的制备方法，其特征在于； 步骤(2)中所述的大孔树脂为大孔树脂AB-8。
7.根据权利要求1所述的植物总黄酮的制备方法，其特征在于； 步骤(2)中所述的乙醇的体积分数为50%。
8.根据权利要求1所述的植物总黄酮的制备方法，其特征在于； 步骤⑵中所述的减压浓缩的温度为40?45°C。
9.一种植物总黄酮，其特征在于:通过权利要求1?8任一项所述的制备方法制备得到。
10.权利要求9所述的植物总黄酮在制备抗肿瘤药物或护肝药物中的应用。
【专利摘要】本发明属于中药领域，具体涉及一种植物总黄酮及其制备方法与应用。所述的植物总黄酮的制备方法，包含如下步骤：(1)通过将大蓟根上部分粉碎过筛，然后用乙醇溶液加热回流提取，提取液过滤，然后减压浓缩蒸干至膏状，得到大蓟乙醇粗提物；(2)大蓟乙醇粗提物采用石油醚脱脂，然后上大孔树脂，水洗脱至无色，然后用乙醇溶液洗脱，洗脱液减压浓缩蒸干，得到植物总黄酮；所述的植物总黄酮在体外能显著抑制肝癌细胞HepG2的增殖，而且能保护人肝细胞L02不受四氯化碳的损伤，可作为新型的护肝药物，用药途径简单，易操作。
【IPC分类】A61K36-28, A61P35-00, A61P1-16
【公开号】CN104873560
【申请号】CN201510290606
【发明人】姜建国, 马勤, 金宏昊, 侯艳
【申请人】华南理工大学
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年5月29日