蛋白的分子量分析证明它们相应于所述蛋白质的二聚和 三聚同种型。在图2的泳道1中，观察到相应于E2-⑶154的二聚同种型（180kDa)和三聚 同种型（270kDa)的2个条带。
[0055] 实施例4 :原位转导山羊乳腺上皮以用于在乳中生产E2his和E2his-⑶154。
[0056] 对于使用表达盒E2his和E2his_CD154的乳腺上皮转化，使用Ad-E2his_sec和 Ad-E2his⑶154-sec重组腺病毒载体。在这两种情况下，通过经乳头的通道对乳房进行直接 输注而将所述载体接种在正在泌乳的山羊的乳腺中。腺病毒载体感染符合乳腺上皮的分泌 性上皮细胞，这允许重组蛋白质的表达。
[0057] 使用处于天然泌乳的第二个月并且平均产量为1L/天的山羊。最初对雌性山羊进 行挤乳直至从乳房中去除乳以便转导腺病毒载体，随后通过乳头的通道将等渗盐水溶液直 接输注到池（cistern)中，其中对乳房进行轻柔的按摩以保证充分洗涤乳腺。通过乳房的 彻底挤乳来去除盐水溶液，并且该过程重复2次。随后，以在包含36mMEGTA的盐水溶液中 109CFU/mL的滴度输注腺病毒接种物。每个乳房的输注体积是可变的，并且保证池的全部充 满，这取决于乳房的容量。输注后，对乳房实施按摩，以便促进腺病毒接种物均匀分布到乳 腺中并达到腺泡的分泌性上皮细胞。腺病毒接种物在24小时后通过挤乳来去除。为了消 除池中或乳腺管中的残留腺病毒载体，通过输注盐水溶液再次冲洗乳腺。
[0058] 24小时后，通过人工挤乳开始从经转化的动物中收集乳。以12小时的间隔每天 进行2次挤乳。将收集的乳贮存于-70°C。对于每个挤乳样品，分析E2his和E2his-⑶154 重组蛋白质在乳中的表达动力学（图3和4)。证明了重组蛋白质的分子大小相应于二聚和 三聚同种型。所获得的在接种后第2 - 8天的E2his的平均表达为1. 03g/L，其中每只动物 的平均产量为5. 22g。对于重组分子E2his-⑶154,获得0. 73g/L的平均表达，其中平均产 量为3.04g/动物。
[0059] 实施例5 :从山羊乳中纯化E2his和E2his-CD154抗原。
[0060] 分别将包含E2his和E2his_⑶154重组疫苗抗原的每个挤乳日的样品相混合，并 于4°C在15 000g下离心30分钟。分离可溶相（乳清）并弃去脂肪相。将收集的乳清以 1:4的比例稀释在乳分离缓冲液（10mMTris-HCl，10mMCaCl2，pH:8. 0)中。将混合物在 冰上冷却30分钟，并于4°C在15 000g下离心30分钟。上清液和沉淀物通过SDS-PAGE和 Western印迹法进行分析。确定，此类重组蛋白质的大部分存在于可溶相中，而沉淀物主要 包含酪蛋白。
[0061] 包含目的重组抗原（E2his和E2his-⑶154)的乳清级分通过在0. 8yM和0. 4yM 膜（Millipore)中进行系列过滤而得到澄清，并且进一步施加到用Ni-NTA-Agarose基质 (Qiagen，USA)填充的XK16纯化柱（Amersham，USA)中。进行使用100mM磷酸盐缓冲液， 20mM咪唑，pH7. 2 (第一次洗涤）以及100mM磷酸盐缓冲液，50mM咪唑，pH7. 2 (第二次洗 涤）的2个洗涤步骤。洗涤后，在100mM磷酸盐缓冲液，20mM咪唑，pH7. 2中洗脱目的蛋白 质。将相应于纯级分的峰逆10mM磷酸盐缓冲液，pH7. 2进行透析（图5)。
[0062] 从山羊乳中的E2his和E2his_⑶154的纯化操作对于这两种疫苗抗原来说是 相同的。以高于90%的纯度水平获得这两种蛋白质。以70%的回收率获得E2his，和在 E2his-⑶154的情况下，获得58%的回收率。纯化的蛋白质通过SDS-PAGE和Western印迹 法进行分析，以便确定蛋白质聚集体形成。可以确定，在乳中产生的E2his的二聚同种型 (同二聚体）被来自受CSFV感染的猪的多克隆血清有效地识别，这表明该分子的这种特异 的构象增加分子抗原性（图6)。
[0063] 实施例6 :在巴斯德毕赤酵母甲醇营养酵母中的表达载体的构建。
[0064] 巴斯德毕赤酵母表达载体pPSlO用NaeI限制性核酸内切酶进行消化，以便在酿 酒酵母（Saccharomycescerevisiae)鹿糖转化酶（Suc2)的分泌信号的3'末端处掺入 目的编码序列。将由PCR扩增的E2编码序列插入pPSlO质粒的NaeI限制位点中。通 过用SmaI-EcoRV限制性核酸内切酶进行酶促消化而从pM0S-E2his-⑶154质粒中移 出E2his-⑶154编码序列，并插入pPSlO的NaeI限制位点中。由此，获得pPS-E2his和 pPS-E2his-⑶154质粒，其中编码这两种分子的序列与酿酒酵母的Suc2的分泌信号向偶 联，并且保持在巴斯德毕赤酵母醇氧化酶（A0X1)启动子的转录控制下。
[0065] 重组质粒用PvuII限制性核酸内切酶进行线性化，并且将它们电穿孔入巴斯德毕 赤酵母MP36菌株的电感受态细胞中。由此，产生了用质粒pPS-E2his和pPS-E2his-CD154 稳定转化的巴斯德毕赤酵母MP36菌株的几个克隆。这种菌株是组氨酸营养缺陷型突变体， 因此重组酵母获得His+表型，从而允许其的选择。
[0066] 还通过Southern印迹法来分析最初通过斑点印迹法鉴定的重组酵母，以便确定 可以通过巴斯德毕赤酵母A0X1基因的替换而发生的整合模式，产生Muts_His表型（甲醇 的低使用）。A0X1的基因替换通过在酵母基因组中和在质粒中存在的A0X1启动子区域和 3'A0X1区域的重组而发生，结果消除了A0X1基因的编码区。具有Muts表型的重组酵母支 持A0X2基因中的醇氧化酶产生，但它在甲醇中的生长率很低。此外，可以通过替换来获得 整合模式，表型Mut+-His+。
[0067] 编码E2his和E2his_⑶154变体的序列保持在A0X1启动子（其可通过甲醇诱导） 调控下。巴斯德毕赤酵母分泌低水平的蛋白质，并且其培养基不需要蛋白质补充物，因此， 可以预期，分泌的异源蛋白质构成了培养基中的总蛋白质的大部分（直至超过80%)。重 组蛋白质的生产在5L的发酵罐中进行。表达的诱导通过在5天期间向培养物中加入甲醇 来进行，并在发酵培养基中获得重组蛋白质。E2his以0. 143mg/mL的水平分泌到重组酵母 培养基中。在E2his-⑶154的情况下，获得0. 122mg/mL的表达水平。
[0068] 实施例7 :从巴斯德毕赤酵母培养基中纯化E2his和E2his_⑶154抗原。
[0069] 将发酵产物于4°C在10 000g下离心30分钟，以便从液相中分离出生物量。培养 基在0. 8yM和0. 2yM膜（Millipore)中进行过滤，并将它施加到用Ni-NTA-Agarose基质 (Qiagen，USA)填充的XK16纯化柱（Amersham，USA)中。进行使用100mM磷酸盐缓冲液，30mM 咪唑，pH7. 2的洗涤，并且目的蛋白质用100mM磷酸盐缓冲液，200mM咪唑，pH7. 2进行洗 脱。将纯的级分逆10mM磷酸盐缓冲液进行透析。用于从经遗传转化的巴斯德毕赤酵母的发 酵上清液中纯化E2his和E2his-⑶154的操作程序对于这两种疫苗抗原来说是相同的。以 高于95%的纯度水平获得这两种蛋白质。以83 %的回收率获得E2his，和在E2his-⑶154 的情况下，获得78 %的回收率。
[0070] 实施例8 :在用可分泌的E2his变体进行疫苗接种的猪中的保护试验。
[0071] 在这个测定法中使用24只健康猪，其体重为大约20kg、具有对于CSFV而言阴性的 血清学并且属于未疫苗接种和不含CSF的兽群。将猪分成每组8只动物的组，并且将它们 饲养在无限制地获得水和食物的3个分开的实验房间（A、B和C)中。
[0072] 组A和组B的动物用包含E2his抗原的疫苗组合物以30yg(组A)和50yg(组 B)/动物的单剂量进行免疫接种，以及组C用安慰剂进行免疫接种。将抗原配制在油包水乳 状液中，并且通过在颈中经肌内途径注射2ml来进行接种。由比例为1:1(V/V)的佐剂和磷 酸盐盐水溶液构成的安慰剂以相同条件进行接种。在免疫接种后的第3周，通过肌内注射 用10 5LD5。的同源的CSFV"Margarita"毒株对所有动物进行攻击。
[0073] 考虑到没有观察到正常临床参数改变这一事实，用E2his疫苗组合物进行接种不 产生不利反应。在免疫接种第2周后在经疫苗接种的组中获得高于1/50的中和抗体滴度 (被视为具有保护性）。在第3周后，滴度增至1/1600 - 1/6400 (图7)。在经疫苗接种的组 (A和B)之间没有观察到免疫应答的差异。已接种疫苗的猪不发展出发热或该病的临床症 状，并且在攻击后的时期中从淋巴细胞中没有制得病毒分离物。然而，安慰剂组发展出该病 的所有临床症状，包括发热、出血和非化脓性脑炎。在这个组中，从攻击后第4天直到处死 当天获得病毒分离。在此，证实了，采用所建议的疫苗接种方案用E2his组合物（以30yg 的剂量进行施用）进行疫苗接种的断奶猪保持受到保护而不出现临床症状和CSFV感染。
[0074] 实施例9 :在用可分泌的E2his抗原进行疫苗接种的怀孕母猪中的垂直保护试验。
[0075] 取在血清学上对于CSFV而言阴性的、来自无CSF疾病或疫苗接种史（3年前）的 兽群的10只母猪。在断奶后，通过激素处理来诱导发情周期，并且在3天后对所有母猪进 行授精。授精与免疫接种同时进行。在5只母猪的一个组中，通过在颈中通过肌内途径注 射2mL来施加实施例7 (组B)中提及的疫苗组合物。取其余5只母猪作为阴性对照组，并 且用由比例为1:1 (V/V)的2mL佐剂和盐水溶液构成的安慰剂进行注射。疫苗接种组在21 天后接受加强免疫。通过测量临床三联征（温度、心脏脉搏和呼吸频率）来研究怀孕母猪， 并且每周进行抽血以用于抗CSFV的中和抗体的血液学和检测。2个月后，通过肌内注射用 l〇5LD5。的同源CSFV"Margarita"毒株攻击怀孕母猪。在攻击后第3和5天时从外周血淋 巴细胞中分离病