. 24 (d), 1 21. 64 (d), 127. 64 (d), 128. 42 (d), 132. 03 (s), 134. 99 (s), 135. 97 (s), 137. 42 (s), 160. 82 (s ),197. 15 (s)〇
[0027] Antrocamol LT2:为无色的液体产物，经分析该化合物的分子式为C26H4(A ;分子量 为448,完整中文英名称为4-乙酰羧基-2, 3-二甲氧基-6-甲基-5-(9-羟基-3, 7, 11-三 甲基-2, 6, 10-十二碳三烯）_2_ 环己烯酮、4-acetoxy-5-[9-hydroxy-3, 7, ll-trimethyldo deca-2, 6, l0-trienyl]_2, 3-dimethoxy-6_m ethyl-cyclohex_2-enone〇
[0028] LT2 结构鉴定数据"H-NMR (400MHz, CDC13) : 1. 18 (3H, d, J = 7. 2Hz,), 1. 54 (3H, s), 1. 64 (3H, s), 1. 67 (3H, s), L 69 (3H, s), 1. 72 (1H, m), L 80 - 2. 40 (8H), 2. 50 (1H, dq, J = 11. 6, 7. 2Hz), 3. 65 (3H, s), 3. 98 (3H, s), 4. 36 (1H, m), 5. 10 (1H, t, J = 6. 8Hz), 5. 12 (1H, d, J =8. 0Hz), 5. 20(1H, t, J = 6. 4Hz), 5. 72(1H, t, J = 3. 2Hz) ;13C-NMR(100MHz，CDC13) :12. 80 (q), 15. 96 (q), 16. 09 (q), 18. 14 (q), 20. 93 (q), 25. 72 (q), 26. 19 (t), 26. 76 (t), 39. 47 (t), 4 1. 25 (d), 42. 98 (d), 48. 12 (t), 59. 65 (q), 60. 67 (q), 65. 53 (d), 68. 98 (d), 120. 74 (d), 127. 4 2 (d), 128. 25 (d), 131. 74 (s), 134. 70 (s), 137. 31 (s), 137. 56 (s), 158. 21 (s), 169. 73 (s), 19 6. 84 (s)〇
[0029] 细胞培养方法
[0030] 在此是使用利用老鼠肾脏膈细胞（Mouse MC line CRL-1927)进行后续实验。该 细胞株取自 American Type Culture Col lection (Rockvi lie, MD，USA)，以 3:1 比例的 Dulbecco, s modified Eagle，s medium及Ham，s F_12medium培养液，并加入5% fetal bovine serum及14mM HEPES进行定期培养。
[0031] 细胞存活率分析
[0032] 将上述细胞株分别于适当的培养液中培养24小时。将增生后的细胞以PBS清洗 一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA处理细胞，随后于l，200rpm下离心5分钟，将细胞沈淀并 丢弃上清液。之后加入l〇ml的新培养液，轻微摇晃使细胞再次悬浮，再将细胞分置于96孔 微量盘内。测试时，分别于每一孔内加入〇. 〇1~200 μ g/ml的牛樟芝化合物，于37°C、5% C02下培养48小时。其后，于避光的环境下于每一孔内加入5mg/ml的3-(4, 5-dimethylthi azol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)(Sigma - Aldrich, St. Louis, M0)反 应2小时。再以酵素免疫分析仪在570nm吸光波长下测定其吸光值，藉以计算细胞的存活 率，并推算出其生长半抑制率所需浓度（即IC50值）所有实验数据均以平均值土标准误 差表示。实验资料以配对t考验（paired-t test)进行统计分析。以p值小于0. 05视为具 有统计学上差异。
[0033] 针对2种牛樟芝化合物的细胞存活率分析（MTT cell viability assay)，结果参阅 如图1A和图1B。结果显不，Antrocamol LTl、Antrocamol LT2于目前挑选的（兰0· 048 μ g/ ml)浓度均不影响肾脏膈细胞生长。
[0034] 牛樟芝化合物抗氧化/抗发炎的效果
[0035] 由于目前已知，肾丝球硬化症或肾丝球肾炎是由严重的发炎反应所引起，因免疫 反应而聚集的白血球细胞会释出大量R0S并造成肾细胞内氧化逆境产生，进而对肾脏造成 伤害，故降低甚至是消除肾细胞内的氧化压力为治疗肾盂肾炎的方法之一，因此降低胞内 的R0S也是治疗上述肾脏疾病的重要指标之一。
[0036] 细胞内 reactive oxygen species (R0S)的测定
[0037] 细胞内R0S的测定是藉由检测2'，7'-dichlorofluorescein diacetate的氧化物 (2'，7' -dichlorofluorescein)的荧光强度而定。将肾脏膈细胞以待测化合物处理后，加 入 2'，7' -dichlorofluorescein diacetate (2 μ M)反应 30 分钟，再于指定时间加入 LPS。 接着以激发波长485nm与放射波长530nm的吸收光谱读取仪（Bio-Rad Laboratories, Inc) 进行测读，当荧光愈强即表示R0S含量愈高。
[0038] 由于活性氧（R0S)与肾炎疾病具有密不可分的关系，在此进行上述细胞内R0S的 测定，结果如图2A和图2B所示。
[0039] 参阅图 2A 所示，分别以 0· 012 μ g/ml、0. 048 μ g/ml 的 Antrocamol LT1 进行抑制氧 化压力（R0S)分析，结果显示于5分钟时，0· 012μ g/ml可以抑制氧化压力3%，0· 048μ g/ ml可以抑制氧化压力14%。
[0040] 参阅图 2B所示，分别以 0· 012 μ g/ml、0· 048 μ g/ml 的 Antrocamol LT2 进行抑制氧 化压力（R0S)分析，结果显示于5分钟时目前浓度无抑制效果。
[0041] 结果整理如下表一所示：
[0044] 牛樟芝化合物对于肾炎细胞的抗发炎效果
[0045] 目前已知，MCP-1在促使肾小管组织间隙发炎反应、肾小管萎缩以及肾脏纤维化等 扮演了重要角色，故对此指标性蛋白质进行检测，据以判定牛樟芝化合物对于肾脏细胞的 抗发炎效果。
[0046] 利用ELISA检测套组（Biosciences，Los Angeles, CA，USA)，依据使用说明检测细 胞上清液的MCP-1蛋白质，并利用ELISA读取仪（Bio-Tek)进行测读（吸收波长为450nm)。 *** 表示 p〈0. 005, NS 表示。
[0047] 参阅图3A所示，以0· 048 μ g/ml和0· 012 μ g/ml的LT1进行抗发炎反应（MCP-1) 分析，结果显示目前浓度无抑制效果。
[0048] 参阅图3B所示，以0· 048 μ g/ml和0· 012 μ g/ml的LT2进行抗发炎反应（MCP-1) 分析，结果显示目前浓度无抑制效果。
[0049] 结果整理如下表二所示：
[0052] 依据上述实验结果，由细胞内R0S测定的实验结果可知，LT1对于肾炎细胞皆具 有抗氧化的效果，间接地可证实其具有用于制备治疗肾脏疾病的药物的潜力，可预期地对 于目前已知的肾脏疾病，包括肾丝球硬化症及肾丝球肾炎，特别是局部性肾丝球硬化症 (FSGS)、结节性肾丝球硬化症、免疫球蛋白A型肾丝球肾炎（IgAN)等皆具有抗发炎的功效。
[0053] 另外，LT2虽暂无发现任何对于肾炎细胞具有抗氧化或抗发炎的功效性，未列入本 发明的保护范围中，然而相比之下更可印证同样萃取自牛樟芝的LT1化合物具有抗发炎功 效的珍贵性。
[0054] 本发明所提供的牛樟芝化合物在制备治疗肾脏疾病中的药物的用途确具产业上 的利用价值，以上的叙述仅为本发明的较佳实施例说明，本领域技术人员可依据上述的说 明而作其它种种的改良，这些改变仍属于本发明的精神及权利要求书中界定的专利范围 中。
【主权项】
1. 一种牛樟芝化合物在制备治疗肾脏疾病的药物中的用途，该化合物以式I表示：其中，该肾脏疾病为肾丝球硬化症或肾丝球肾炎。2. 如权利要求1所述的用途，其中，该肾丝球硬化症为局部性肾丝球硬化症（FSGS)或 结节性肾丝球硬化症。3. 如权利要求1所述的用途，其中，该肾丝球肾炎为免疫球蛋白A型肾丝球肾炎 (IgAN) 〇
【专利摘要】本发明公开了一种牛樟芝化合物在制备治疗肾脏疾病的药物中的用途，该化合物以式I表示：其中，该肾脏疾病为肾丝球硬化症或肾丝球肾炎。
【IPC分类】A61K31/122, A61P13/12, A61P29/00
【公开号】CN105287448
【申请号】CN201410256389
【发明人】张温良, 姚振文, 严逸钊, 曾卉菱, 曾宛平, 曾泰霖, 郭盈妤
【申请人】曾卉菱
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2014年6月10日