容量和骨发生能力降低中的作用图；(A)代表性胸椎椎体微-CT三维重建图。(B)骨容量(BV/TV，% )定量结果图。(C)代表性胸椎椎体总胶原(Total Col)组织化学染色显微图片。(D)总胶原阳性面积定量结果图。(E)亚甲基蓝阳性成纤维细胞集落形成单位(CFU-f)图片。(F)CFU-f阳性面积。(G)碱性磷酸酶阳性成纤维细胞集落形成单位(CFU-fap)图片。(H)CFU-fap阳性面积。*，P<0.05 ;**，Ρ〈0.01 ;林*，Ρ〈0.001，与假手术对照组(Sham)比较.’#，Ρ〈0.05.’##，Ρ〈0.01，与 0RX 组小鼠比较。
[0026]图13为PQQ补充在纠正0RX引起的骨吸收增加中的作用图；(A)代表性胫骨上端干骺端抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色显微图片。(B)TRAP破骨细胞面/单位骨面(0c.S/B.S，% )定量结果图。*，P〈0.05，与假手术对照组(Sham)比较；#，P〈0.05，与0RX组小鼠比较。
【具体实施方式】
[0027]以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。
[0028]实施例1
[0029]为了明确PQQ在防治衰老相关骨质疏松中的作用，我们通过给予衰老相关骨质疏松的小鼠模型，Bm1-1基因敲除(ΒΚ0)小鼠饮食补充抗氧化剂PQQ，以正常饮食野生型(WT)和ΒΚ0小鼠作为对照，通过影像学、组织病理学和分子生物学的方法比较分析了三组动物的表型差异，研究PQQ补充在纠正Bm1-1缺失引起骨质疏松包括颂骨疏松中的作用。
[0030]材料与方法
[0031]实验动物
[0032]实验动物的繁殖Bm1-1基因敲除杂合子小鼠(由荷兰肿瘤研究所Anton Berns教授惠赠)由南京医科大学SPF级实验动物中心饲养，进行雌雄配对合笼，得到的子代小鼠用PCR方法进行基因型鉴定，获得同窝配对的野生型(WT)和Bm1-1 / (Bm1-lknock out，ΒΚΟ)小鼠用于实验研究。
[0033]实验动物的分组取子代小鼠WT和ΒΚ0小鼠将分别给予以下不同处理:
[0034]Α.正常饮食(WT)组:普通饮食饲养三周龄断奶后WT小鼠；
[0035]Β.正常饮食(ΒΚ0)组:普通饮食饲养三周龄断奶后ΒΚ0小鼠；
[0036]C.PQQ补充(BK0+PQQ)组:普通饮食中添加PQQ (4mg PQQ/kg普通饲料)饲养三周龄断奶后ΒΚ0小鼠。
[0037]实验方法
[0038]基因型鉴定小鼠鼠尾片段用酚-氯仿-异戊醇的方法进行抽提DNA。通过PCR的方法进行基因型的鉴定[Molofsky AV，He S,Bydon M,Morrison SJ,Pardal R.Bm1-lpromotesneural stemcell self-renewal and neural development but not mouse growth andsurvival by repressing the pl6Ink4a and pl9Arf senescence pathways.GenesDev.2005 ； 19 (12):1432 - 1437.]。
[0039]Bm1-1 的正向引物序列为 5' -CAGTTAGGCAGTATGTAGTTTTC-3'，
[0040]反向引物为5' -GTTGTGGTGGAGTGTAAGAGTGT-3'。
[0041]ΝΕΟ 基因的正向引物为 5' -AAGATGTTGGCGACCTCGTATTGG-3'，
[0042]反向引物为5' -GCAAGACCTGCCTGAAACCGAACT-3'。
[0043]引物由上海Invitrogen公司合成。PCR反应条件:94°C预变性4min ;94°C变性30s ;57°C退火30s ;72°C延伸 45s ;共进行 30循环；72°C延伸 lOmin。使用 B1-Rad MycyclerPCR扩增仪。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，Bm1-1扩增产物为687bp，ΝΕ0扩增产物为399bp0
[0044]仅有Bm1-1扩增产物为687bp条带为野生型，仅有ΝΕ0扩增产物399bp条带为纯合子，2条扩增产物均有者为杂合子(图1)。
[0045]取材取7周龄WT、ΒΚ0以及BK0+PQQ小鼠，麻醉后拍照，立即行颈椎脱臼处死，取同侧下颂骨、胫骨，使用能更好保存酶活性和组织抗原性的PLP (2 %副醛，75mM赖氨酸，10mM过碘酸钠)固定液固定，经常规脱水、石蜡包埋、切片，用于HE染色、组织化学染色和免疫组化及TUNEL染色。取另一侧下颂骨、胫骨提取蛋白质用于Western blot分析。
[0046]X-线摄影固定后的下颂骨、腔骨使用Faxitron Model 805 rad1graphic检测系统(Faxitron Contact,Germany ；22kV and 4-minute exposure time)进行X线摄影，观察骨骼形态和骨密度的改变。
[0047]Micro-CT扫描和三维重建取固定后的下颂骨、胫骨，使用我们先前报道的方法[Miao D，He B，Lanske B，et al.Skeletal abnormalities in PTH-null mice areinfluenced by dietary calcium.Endocrinology.2004 ; 145(4):2046 - 2053.]进行Micro-CT扫描(Sky Scan 1072Scanner，电压100kV，电流98mA)和三维重建，选择经中切牙横断面、第一磨牙、第二磨牙和第三磨牙近中根纵切面进行比较分析观察；选择胫骨近端冠状面观察已钙化次级骨化中心、生长板、皮质骨和小梁骨的改变。
[0048]HE染色石蜡切片常规脱蜡水化，苏木精(美国Sigma公司)染色，1%盐酸酒精分化，流水冲洗返蓝，伊红(美国Sigma公司)复染，常规脱水透明，中性树胶封片.
[0049]组织化学染色取下颂骨、胫骨组织的石蜡切片，按照我们先前报道的方法[MiaoD，Bai X，Panda D，McKee M，Karaplis A，Goltzman D.0steomalacia in HYP mice isassociated with abnormal Phex express1n and with altered bone matrix proteinexpress1n and deposit1n.Endocrinology.2001 ; 142 (2): 926 - 939.]，作总胶原(totalcollagen，TC0L)、碱性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)等组织化学染色。
[0050]免疫组织化学染色取下颁骨、胫骨组织进行固定、脱水、石蜡包埋切片，按照我们先前报道的方法[Miao D，Li J，Xue Y，Su H，Karaplis AC，Goltzman D.Parathyroidhormone - related peptide is required for increased trabecular bone volume inparathyroid hormone - null mice.Endocrinology.2004 ;145(8):3554 - 3562.]，作免疫组织化学染色，检测指标包括反映成牙本质细胞相关的指标:双糖链蛋白多糖(Biglycan)，牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSP);成骨细胞分化指标:I型胶原(Col
I)、骨钙素(0CN);反映下颁骨、胫骨增殖的指标:增殖细胞核抗原(proliferating cellnuclear antigen，PCNA)0
[0051]TUNEL染色取下颂骨、胫骨组织石蜡切片，按照我们先前报道的方法[Miao D，HeB?Karaplis AC?Goltzman D.Parathyroid hormone is essential for normal fetal boneformat1n.J Clin Invest.2002 ；109(9):1173 - 1182.]，进行反映凋亡的指标TUNEL染色。
[0052]结果
[0053]PQQ补充对ΒΚ0小鼠下颂骨、牙、胫骨骨矿化的影响
[0054]为了检测PQQ对ΒΚ0小鼠下颂骨、牙及胫骨骨矿化的影响，我们使用X射线检测了7周龄WT、ΒΚ0和BK0+PQQ小鼠下颂骨、牙及胫骨的矿化情况。X线结果显示:与ΒΚ0小鼠相比，BK0+PQQ小鼠下颂骨、牙齿及胫骨的形态增大，X线透光度减少，骨密度增加(图2中Α)。同时我们还利用微CT扫描观察了 PQQ对ΒΚ0小鼠下颂骨、牙及胫骨的影响。与ΒΚ0小鼠相比，BK0+PQQ小鼠在下颂中切牙横断面、第一磨牙、第二磨牙和第三磨牙近中根纵切面牙量均增加，密度增高，下颂骨牙槽骨骨量和胫骨的骨量都明显增加(图2中Β)。说明PQQ补充能够纠正Bm1-1缺失