一种肝素或其盐修饰的氧化石墨烯及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及药物合成领域，具体设及一种用于肝素或其盐修饰的氧化石墨締及其 制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 氧化石墨締（Grapheneoxide,G0,见图1)是具有单原子层结构的石墨締的衍 生物（Carbon, 2011,49:1126-1132)。与表面上仅含有碳碳双键的石墨締（Graphene) 相比，氧化石墨締自身结构中含有大量的径基、环氧基、簇基等含氧基团，而具有较 好的亲水性，可广泛应用于生物医学中（JControlRelease, 2014, 173:75-88)。由 于氧化石墨締是单原子层结构，具有较大的比表面积（有文献测得为736. 6m7g，见 Langmuir, 2013, 29:13443-13448)，其两面都可通过共价、非共价作用与药物结合，因此 具有较高的药物负荷量。它可通过较强的物理吸附作用与芳香环类药物非共价结合， 能运载一些难溶性药物，特别是对大部分难溶性抗癌药物的体内转运具有重要的意义 (Science, 2004, 306:666)。氧化石墨締为亲水性物质，具有较好的生物相容性。研究 发现，在细胞水平氧化石墨締是一种相当安全的材料，没有明显的细胞毒作用（Toxicol Lett, 2011，200:201)，因此氧化石墨締作为药物祀向输送的载体越来越受到科研人员的重 视，当前公开的专利较多。
[0003] 如专利CN201210509075报道了一种葡聚糖化学接枝血红素修饰的氧化石墨締， 用于药物输送等生物医学的诊断和治疗。专利CN201310450626报道了一种氧化石墨締-棚 改性酪醒树脂的制备方法，不仅保持了石墨締的结构和性能，而且保留的部分含氧官能团 能很好地解决石墨締分散性、溶解性和加工性差等难题。专利CN201310185529报道了一种 氧化石墨締与水性聚氨醋纳米复合材料的制备方法，可降低氧化石墨締片层的亲水性，提 高其在有机溶剂中的分散性及与聚合物之间的相溶性。专利CN201210038641报道了一种 氧化石墨締-血根碱复合物及其制备方法。该复合物中，氧化石墨締载体和血根碱之间通 过非共价n-JT作用结合，能大幅改善血根碱的溶解度和稳定性，还可使其具有祀向性，并 有望作为一种潜力巨大的抗癌制剂被广泛应用。专利CN201110361574报道了一种聚苯乙 締接枝氧化石墨締的方法。专利CN201110227223报道了聚乙二醇修饰氧化石墨締的方法。
[0004] 氧化石墨締经还原剂（如阱、棚氨化钢、连苯=酪、抗坏血酸、硫脈等）还原后可转 变为还原性氧化石墨締（re化cedG0，rG0,见图2)。与氧化石墨締相比，rGO去除了较多的 含氧基团，同时保持了平面结构，但具有不可逆聚集的特点，或在缺少高分子分散剂或表面 活性剂的条件下有堆积成石墨的倾向（Carbon, 2012, 50:3210-3228)。rGO不仅载药性能大 大提高，而且可吸收650-900nm范围内的红外线的能力而产生热量（光热效应）大大增强 (JAmChemSoc, 2009, 131:11027-11032)。如对于多柔比星，其载药量提高了 10倍（ACS Nano, 2013, 7:6735-6746)，在808皿的近红外光且能量为0. 6W/cm2的光照下，其光热效果 增加了 6倍（JAm化emSoc, 2011，133:6825-6831)。利用rGO的较高的载药性和较强的光 热效应，大大地增强了抗肿瘤的祀向性和治疗效果，目前有也较多报道。
[0005] 文献报道，为增加抗癌药物的在祀癌细胞的转运效率，降低对其他正常细胞 的毒性，提高其疗效，氧化石墨締在药物载体前需经过一定的化学修饰，才能发挥其 抗癌活性（如NanoLett. 2010, 10:3318-3323,AdvMater. 2012,24:1722-1728,ACS Nano. 2011，5:7000-7009,Biomaterials. 2014, 35:4986-4995 等）。如氧化石墨締经聚 乙二醇修饰后其水溶性进一步增强（JAm化emSoc. 2008;130:10876-10877)。又如在 一定条件下，将氧化石墨締与氯乙酸钢（ClCHzCOONa)混合，使氧化石墨締中的径基、环 氧基、醋基转换为簇基，再横酸化，生成含有大量横酸基和簇基的氧化石墨締衍生物，从 而提高了氧化石墨締在生理溶液中的稳定性（Small, 2010, 6(4) :37)。该衍生物中的簇 基（COOH)可与叶酸中的氨基（N&)共价结合生成叶酸-氧化石墨締缀合物。由于叶酸 可选择性被叶酸受体识别，而叶酸受体在人乳腺癌细胞中大量表达，因此，负载在叶酸表 面修饰的氧化石墨締上的药物可实现祀向给药（NanoRes, 2008, 1:203-212)。通过氧化 石墨締的JT-JT堆积和疏水作用，该缀合物可将抗癌药物喜树碱值NA拓扑异构酶I抑制 剂）、多柔比星值NA拓扑异构酶II抑制剂）物理吸附在氧化石墨締表面上，并形成含有 抗癌药物的复合物。该复合物经血液（pH7. 35~7. 45)运输到叶酸受体大量表达的部 位（如人乳腺癌细胞），经受体介导的细胞内吞作用，将含抗癌药的复合物转运至癌细胞 内，在内吞体（pH5. 0~6. 5)和溶酶体（pH4. 5~5. 0)的酸性破坏作用，释放出抗癌药 物度iomaterials，2013, 34:3647-3657)。另外，由于肿瘤细胞生长快，在增殖过程中生成 了比正常组织更多的乳酸等酸性代谢产物，因此，肿瘤细胞周边的组织液抑值比正常细胞 低，显弱酸性（P册.5 ~7. 2，Biomacromolecules2009 ;10 (7) :1727-1735;JAmQiemSoc 2005, 127巧1) : 17982-17983)。而抗癌药多是碱性药物，如喜树碱的地a= 8. 63(CurrMed Qiem. 2011, 18 巧）：1367-1372),多柔比星的地a= 8. 22(AnalyticalProfilesofDrug Substancesvol9:260)，由血液到肿瘤细胞外液的过程，W及癌细胞内的内吞体和溶酶体 的破坏过程，均是由弱碱性环境变为弱酸性的过程，药物分子由分子态转变为离子态，其溶 解度升高，即脂溶性变为亲水性，从氧化石墨締表面释放增加，溶于细胞内液中，与DNA拓 扑异构酶结合，运是通过抑敏感的原理利用氧化石墨締作为载体发挥药物的毒性治疗作 用。
[0006] 肿瘤研究中发现，二硫键（-S-S-)在细胞外溫和条件下稳定存在，而在细胞内遇到 还原性物质通过二硫键交换反应迅速分解，运些还原物质主要是谷脫甘肤（glutathione， GSH，MethodsEnzymol, 1995, 251:8-28;AnnuRevMicrobiol, 1997, 51:179-202)。G甜在 细胞液和亚细胞核中W毫摩尔浓度高水平存在（约0. 5~lOmM)，然而由于在血浆中迅速的 酶降解降到了较低水平（约2~20ym)，即细胞质和细胞核内的还原电势大约是体液或细 胞外液等体液的 100~1000倍（CellBiochemRmct, 2004, 22:343-352 ;化eeRadicBiol Med, 2001，30:1191-1212)。肿瘤细胞由于生长快，耗氧量较大，致使G甜的含量至少是正常 组织的4倍（CancerRes, 2002, 62 (1) : 307-312)，因此，采用氧化还原原理将抗癌药物或基 因传递到肿瘤细胞内而发挥治疗作用。 W07] 肝素化巧arin，见图如是1916年发现的由1 一 4连接的醒糖酸和葡萄糖 胺二糖组成的线性多糖类化合物，1935年临床上开始用于抗凝剂，其活性是因为它能 与丝氨酸蛋白酶抑制剂抗凝血酶相结合，导致该抑制剂变成无活性的凝血酶（JMed 化em，2003, 46:2551-64)。普通的肝素通常是从猪小肠或牛肺等天然组织中提取出来的， 平均分子量约15kDa，约有20个双糖结构，化学结构和分子量高度不均匀，多分散性为 1. 2~1. 4,分子量范围为5~40kDa。钢盐在水中易溶，在常见的有机溶剂中难溶，在水 中分子链伸展成螺旋状，十二个双糖单位的肝素长度约为5nm，推测肝素的长度约为9nm。 每个二糖单元含有一个簇基，一个或多个r或2°径基，2~2. 5个硫酸基，其中N-硫酸 基占75~85%，O-硫酸基占15~25%，每个二糖单元结构中还含有15~25 %的邻径 基。每个链含有一个半缩醒的还原性末端，掩盖了醒基（Cffi))。肝素每个链含有约0.3游 离的氨基（N&)。高度亲水，即使在干燥条件下，仍带有2~10%的水。由于结构中含有 簇基（pKa为3. 3)和硫酸基（0-硫酸基和N-硫酸基的地a为1. 0~1. 5)，使肝素高度带 负电荷（约-75/链），使得可与生长因子、蛋白酶、细胞因子等多种蛋白质发生静电作用 (NatProdR巧，2002, 19:312-331)，导致蛋白质稳定或增加了对细胞受体的亲和性（JCell Siol，1986, 128:475-484)，运种稳定性已经用于成纤维细胞生长因子（fibroblast growthfactor,FGF)和血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor, VEG巧可制成组织再生用工程载体支架和控制药物释放的药物传递系统平台（化emSoc Rev, 2013, 42:7335-7372)。作为抗凝剂，肝素较多的副作用，如出血性并发症、血小板减少、 非静脉给药后生物利用度低（JClinI^armacol, 1992, 32:584-596)。
[0008] 低分子肝素（low-mole州Iarwei曲theparin,LMWH)化学组成确切，生物半 衰期延长，不良反应较少（Science, 2011，334:498-501)。低分子肝素（CAS:9041-08-l) 有多种药用形式，如药用的低分子量肝素钢、低分子量肝素巧、阿地肝素钢（Ardeparin Sodium)、贝米肝素钢度emiparinSodium)、舍托肝素钢（CertoparinSodium)、达肝素 钢值alteparinSodium)、依诺肝素钢巧noxaparinSodium)、那曲肝素巧（化化oparin Calcium)、帕肝素钢（ParnaparinSodium)、瑞维肝素钢巧eviparinSodium)、亭扎肝素钢 (Tinzaparinsodium)等（Martindale, 36版1329页）。研究显示，与普通未分级的肝素相 比，LMWH通过调节与多种血管相关的生长因子（如FGF和VEGF)，对抑制肿瘤组织的生长 更有效果。另外，LMWH还可干扰肿瘤转移，或与血小板选择蛋白竞争性结合，抑制肿瘤小的 黏附（化tRevCancer, 2002, 2:521-528)。近来研究发现，肝素还可与转录因子作用，导致 细胞调亡性死亡（化emBiol, 2004, 11:420-422)。因此，LMWH被广泛用于肿瘤祀向给药系 统，也有一些化学修饰的LMWH衍生物，如LMWH-脱氧胆酸，抗凝活性降低，抗血管生成活性 升高（JControlledRelease, 2010, 148:317-326)。LMWH可作为抗纤维化剂治疗乙肝度i omaterials，2011，32:1438-1445)。肝素修饰的PLGA-普朗尼克F-127可用于控制生长因子 的释放度iomaterials，2006, 27:2621-2626) ,Kipper等人利用聚阴离子壳聚糖-肝素和聚 阳离子壳聚糖-透明质酸聚合电解质对组成的聚电解质复合物纳米粒（polyelectrolyte complexnanoparticles，PCN)，用于控释FGF-2的释放，可W零级释放的方式缓慢释放30 天（ActaBiomater, 2012, 8:1551-1559)。W氯化S甲基壳聚糖和肝素非共价键组成的纳 米粒，WVEGF为模型药物，突释作用减少，14天零级方式释放约49%(MacromolRapid Commun，2012, 33:2015-2022)。Mi等人合成了肝素修饰的壳聚糖/聚丫-谷氨酸纳米粒，由 于丫-谷氨酸和肝素带