进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0017]实施例1.用Ub-AMC酶活测试体系进行体外检测天然五环三萜类小分子化合物对USPs (包括USP7、USP47)的抑制活性
[0018]以USP7 为例:
[0019]测试于96孔板中进行。测试使用Buffer:EDTA，0.5mM;DTT，2mM;Tris_HCl(PH7.6)50mM，全长USP7终浓度为20nM，Ub-AMC终浓度为400nM。
[0020](I )USP7与被测化合物于37°C孵育20分钟。
[0021 ] (2)加入Ub-AMC，测试体系于37°C孵育50分钟。
[0022](3)应用酶标仪测试样品的激发光强度，激发光波长为380nm，发射光波长为460nm。将测试结果进行EC5q计算，得化合物对USP7的体外抑制活性。
[0023]测试结果如图2所示，多个化合物显示出对USP7明显的抑制活性:其中乌苏烷型化合物:熊果酸(1(:50 = 7.0±1.5411101/1)、科罗索酸(1(:50 = 22.7±2.1411101/1)表现出对1^?7的抑制活性;齐墩果烷型化合物:齐墩果酸(IC5q= 12.5 ± 1.0ymol/L)、常春藤皂苷元(IC50=33.5±1.(^!1101/1)、扁塑藤素(1(:5() = 21.1±3.2411101/1)表现出对1^?7的抑制活性;羽扇烷型化合物:桦木酸(IC5q = 33.3 ± 2.6μπιο 1/L)表现出对USP7的抑制活性。
[0024]接下来，我们以抑制活性最高的熊果酸为研究对象，测试了熊果酸对USP47的抑制活性。测试结果显示(图5)，熊果酸可以在一定程度上区分USP7与USP47，熊果酸对USP7抑制效果是对USP47抑制效果的3.6倍(熊果酸对1^?47的1(:5()为25.7±2.6411101/1)，这一结果优于已报道的USP7抑制剂。
[0025]实施例2.熊果酸与细胞内USP7的结合效果(CETSA实验)
[0026]以72°C为例:使用大于17个的Η08910细胞，用I3BS洗三次，用细胞刮刮下，收集到1.5ml离心管，2500rpm离心5min，弃净上清，加入500μ1 PBS(1:100加入cocktail)，将细胞充分重悬，放液氮快速冷冻30s，室温放置约15min，直至完全溶解，如此重复3次，20000g，20min，4°C离心，将上清吸入新的1.5ml EP管，等分为两份，每份240μ1，一份加入熊果酸(终浓度15μΜ)，另一份加入相同体积的DMS0，室温孵育30min。将上述裂解液等分至PCR管，每管30μ1，稍离心，放PCR仪，按照设置好的温度孵育3min，室温孵育3min。然后20000g，20min，4°C离心。将20μ1上清转到0.6ml的EP管中，加入5μ1的5xloading buffer，72°C煮5min。将样品用8%的SDS-PAGE胶进行western blot分析。
[0027]如图4A所示，熊果酸可以提USP7在高温下的稳定性，这说明熊果酸在细胞内可以直接作用于USP7蛋白。
[0028]实施例3.熊果酸对卵巢癌细胞H08910的增值抑制试验
[0029]将H08910细胞种至96孔板中，24小时后，细胞完全贴后，用不同浓度的熊果酸加入细胞中，用DMSO做溶剂对照。处理细胞48小时后，每孔加入10μ1的CCK-8试剂。细胞培养箱再培养2小时后，在450nm检测吸光值。本实验说明，熊果酸能够抑制卵巢癌细胞Η08910的活性。
[0030]实施例4.Western blotting检测熊果酸在卵巢癌细胞H08910内对USP7的抑制情况
[0031 ]使用不同浓度的熊果酸处理H08910细胞。收取细胞后裂解蛋白，并进行蛋白浓度测定。将样品进行western blotting，用8%的SDS-PAGE胶。胶上的蛋白转染至NC膜上，用丽春红进行膜染色，查看上样量是不是一样。将膜用PBS漂洗3次后，用5 %的脱脂牛奶室温封闭I小时，先后上一抗和二抗，用化学发光的方法进行显影。如图4C，D所示，熊果酸可以在细胞内有效抑制USP7活性，下调Mdm2，上调p53;同时检测与细胞凋亡相关的蛋白水平也说明，随着USP7被抑制，p53上调，细胞被诱导凋亡。本实验说明熊果酸在细胞内能够有效抑制USP7的活性，诱导癌细胞凋亡。
[0032]实施例5.熊果酸与USP7的计算机模拟对接实验
[0033]我们尝试使用计算机模拟的方法将熊果酸的分子结构与已报道的USP7的晶体结构进行对接实验，对接结果显示，熊果酸可能结合于USP7的泛素结合口袋(the ubiquitinbinding pocket)，并与多个结合区域的氨基酸残产生相互作用(图3)。分子对接试验所使用的计算机软件为AutoDock4.2 DUSP7的催化域晶体结构来源于Prote in Data Bank(http://www.rcsb.0rg/pdb)(PDB ID:4M5ff)。
[0034]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.五环三萜类化合物在制备USP7抑制剂中的应用。2.根据权利要求1所述的五环三萜类化合物在制备USP7抑制剂中的应用，其特征在于，所述五环三萜类化合物包括熊果酸、齐墩果酸、桦木酸、科罗索酸、常春藤皂甙元和扁塑藤素中的一种或几种。
【专利摘要】本发明公开五环三萜类化合物在制备USP7抑制剂中的应用。设计优化具有高活性高选择性的USP7小分子抑制剂，有利于新型抗肿瘤药物的开发以及更为全面的理解与USP7相关的多种肿瘤的发生机理。本发明公开的五环三萜类化合物是一类全新的USP7小分子抑制剂，其中熊果酸等天然五环三萜类小分子更是已经广泛地用作医药原料以及抗肿瘤研究当中，这一研究对于开拓熊果酸等天然五环三萜类小分子应用范围，进一步了解此类小分子化合物抑制肿瘤的作用机制有重要创新意义，同时也为开发具有自主知识产权的以USP7为靶标的创新药物奠定先导化合物基础。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/56
【公开号】CN105534991
【申请号】CN201510990684
【发明人】王伟卫, 吴英理, 刘梦, 井博
【申请人】上海交通大学医学院
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年12月24日