[0082] 在氨基酸序列SLL(参见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L ;
[0083] 在氨基酸序列M￡Q (参见SEQ ID NO: 33)内的氨基酸C，或其任何子组；和/或
[0084] 来自组（b)(3)
[0085] 在氨基酸序列PIG(参见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T ;
[0086] 在氨基酸序列VAK (参见SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A，或其任何子组；和/或
[0087] 来自组（b)(4)
[0088] 在氨基酸序列EIV(参见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I ;
[0089] 在氨基酸序列FM3 (参见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N ;
[0090] 以及在氨基酸序列PIL (参见SEQ ID NO: 20)内的氨基酸I，或其任何子组；以及
[0091] (c)与（a)或（b)的DNA序列的互补序列在非常严格的条件下杂交的DNA序列， 这些非常严格的条件包含在65°C下在0.5M NaHPo4、7% SDSUmM EDTA中与过滤器结合的 DNA杂交，并且在68°C下在0. 1SSC/0/1% SDS中洗涤。
[0092] 本发明还提供了经多核苷酸分子转染的宿主细胞并且提供了用于保护猪科动物 不被PRRS病毒感染的疫苗，所述疫苗包含：(a)由上述多核苷酸分子编码的遗传修饰北美 PRRS病毒，或（b)所述感染性分子，或（c)呈质粒形式的所述多核苷酸分子，或（d)病毒载 体，它包含所述多核苷酸分子，其中所述PRRS病毒能够以可有效地产生不被感染的免疫保 护的量引发不被PRRS病毒感染的有效免疫保护反应，和适用于兽用的载剂。
[0093] 本发明还提供了对应于（即通过具有互补的碱基编码序列）以下的RNA多核苷酸 序列：
[0094] (a)DNA 序列 SEQ ID NO:6 ;
[0095] (b)与（a)的DNA序列至少85%-致的DNA序列，其中其由ORFla编码的蛋白质 具有含有以下中的任一者和任何以下的任何组合的氨基酸序列：
[0096] 在氨基酸序列AP(参见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N ;
[0097] 在氨基酸序列HM(参见SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N ;
[0098] 在氨基酸序列PQG(参见SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ;
[0099] 在氨基酸序列WIL(参见SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y ;
[0100] 在氨基酸序列VHG(参见SEQ ID NO: 21)内的氨基酸H ;
[0101] 在氨基酸序列KYD (参见SEQ ID NO: 24)内的氨基酸V ;
[0102] 在氨基酸序列AID(参见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T ;
[0103] 在氨基酸序列SLL (参见SEQ ID NO :30)内的氨基酸L ;
[0104] 在氨基酸序列M￡Q (参见SEQ ID NO: 33)内的氨基酸C ;
[0105] 在氨基酸序列PIG(参见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T ;
[0106] 在氨基酸序列VAK(参见SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A ;
[0107] 在氨基酸序列EIV(参见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I ;
[0108] 在氨基酸序列FNP (参见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N ;
[0109] 以及在氨基酸序列PIL(参见SEQ ID NO:20)内的氨基酸I ;或
[0110] (C)与（a)或（b)的DNA序列的互补序列在非常严格的条件下杂交的DNA序列， 这些非常严格的条件包含在65°C下在0.5M NaHPo4、7% SDSUmM EDTA中与过滤器结合的 DNA杂交，并且在68°C下在0. 1SSC/0/1% SDS中洗涤。
[0111] 因此，本发明还提供了包含多核苷酸分子的诊断试剂盒，它们区分自然感染有 PRRS病毒的野外病毒株的猪科动物与接种本发明疫苗的猪科动物，所述疫苗（病毒）优选 地证明了相比于野生型P129 PRRS病毒（SEQ ID NO:5)有所降低的干扰素-α抑制作用。
【附图说明】
[0112] 表1示出了感染性cDNA克隆和通过转染到ΡΚ-9细胞中得到的对应病毒。
[0113] 表2示出了野生型PRRS病毒和适于在细胞培养液中生长的衍生物的干扰素 - α 抑制作用。
[0114] 表3描绘了野生型PRRS病毒Ρ129和其适于在表达⑶163的ΡΚ-9细胞中生长的 基因工程改造衍生物的干扰素 -α抑制作用。
[0115] 表4示出了 P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒相比于野生型Ρ129病毒和PRRS Ingelvac疫苗有所降低的干扰素- α抑制作用。
[0116] 表5描绘了为了评估疫苗病毒的安全性和功效而进行的研究的设计。
[0117] 表6示出了 Ρ129第0代与P129-PK-FL第17代之间由于基因组位置所造成的所 有核苷酸差异和所得氨基酸差异。
[0118] 表7示出了 Ρ129第0代与P129-PK-FL第17代之间由于病毒蛋白质所造成的核 苷酸和氨基酸差异的汇总。
[0119] 表 8 示出 了见于感染性 cDNA 克隆 pCMV-S-P129 和 pCMV-S-P129-PK17-FL 中的 PRRSV基因组之间由于基因组位置所造成的所有核苷酸差异和所得氨基酸差异。
[0120] 表9和表10示出了有助于第52代病毒（SEQ ID NO:6)的表现型的氨基酸改变。
[0121] 表11示出了在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗之后具有临床症状的猪的数量。
[0122] 表12示出了在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗之后的血清平均滴度。
[0123] 表13示出了在先前在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗的7周龄猪攻击之后的肺 部病灶百分比。
[0124] 表14示出了在先前在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗的18周龄猪攻击之后的肺 部病灶百分比。
[0125] 表15示出了在先前在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗的26周龄猪攻击之后的肺 部病灶百分比。
[0126] 表16示出了在先前接种经修饰活PRRSV疫苗的5周龄猪崽攻击之后的肺部病灶 百分比。
[0127] 图1示出了接种疫苗后的直肠温度。
[0128] 图2示出了用毒性PRRSV NADC20攻击后的直肠温度。
[0129] 图3示出了接种疫苗后和攻击后的体重。
[0130] 图4示出了攻击后具有PRRS病灶的肺的百分比数据。
[0131] 图5示出了关于所观察到的病灶严重性的攻击后肺评估评分（LAS)。
[0132] 图6是一个直方图，描绘了接种疫苗后和攻击后在血清中的抗PRRSV抗体水平 (ELISA S/P 比率）。
[0133] 图7是血清中的攻击后病毒载量的图形表示（PAM细胞上的log TCID50/ml)。
[0134] 图8是用于获得疫苗的方法的图示，所述疫苗包括如本文所披露的SEQ ID NO: 1 到 SEQ ID NO:6。
[0135] 主要序列的简要说明
[0136] SEQ ID NO: 1 提供 P129-PK-FL 第 17 代全基因组。
[0137] SEQ ID N0:2 提供 P129-PK-d43/44 第 17 代全基因组。
[0138] SEQ ID N0:3 提供 P129-PK-FL 第 24 代全基因组。
[0139] SEQ ID N0:4 提供 P129-PK-d43/44 第 34 代全基因组。
[0140] SEQ ID NO: 5提供P129第0代全基因组。
[0141] SEQ ID N0:6提供P129第52代全基因组。
【具体实施方式】
[0142] 除非上下文另外明确规定，否则如在本说明书和所附权利要求书中所使用的单数 形式"一个/种（a/an) "和"所述"包括复数个指示物。因此，举例来说，提到"所述方法" 包括一或多种方法，和/或本领域的普通技术人员在阅读了本发明时所清楚的本文中所述 类型的步骤等等。
[0143] 除非另外规定，否则本文中所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的 一般技术人员通常所了解相同的含义。虽然可以在本发明的实践或测试中使用类似于或等 效于本文中所述的那些方法和材料的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。
[0144] 除非明确相反地指出，否则本发明的实践将采用在本领域技术内的病毒学、免 疫学、微生物学、分子生物学以及重组DNA技术的常规方法，其中许多出于说明的目的如 下描述。在文献中全面解释了所述技术。参见例如萨姆布鲁克（Sambrook)等人分子克 隆实验指南（Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第 2 版，1989);马尼亚迪斯 (Maniatis)等人分子克隆实验指南（1982) ;DNA克隆实用方法（DNA Cloning:A Practical Approach),第I卷和第II卷（D.格洛弗（D. Glover)编）；寡核苷酸合成（Oligonucleotide Synthesis) (Ν·盖特（Ν· Gait)编，1984);核酸杂交（Nucleic Acid Hybridization) (Β·哈 梅斯（B.Hames)和 S.希金斯（S. Higgins)编，1985);转录和转译（Transcription and Translation) (B.哈梅斯和S.希金斯，1984);动物细胞培养（Animal Cell Culture) (R.弗 瑞旭尼（R.Freshney)编，1986);佩巴尔（Perbal)，分子克隆实践指导（A Practical Guide to Molecular Cloning)(1984)〇
[0145] "北美PRRS病毒"意指具有与北美PRRS病毒分离株相关的遗传特性的任何 PRRS病毒，例如（但不限于）最初在美国在约1990年代初期分离的PRRS病毒（参 见例如柯林斯，J. E. (Collins, J. E.)等人，1992，兽医诊断研究杂志（J. Vet. Diagn. Invest.) 4:117-126);北美PRRS病毒分离株 MN-Ib(光，J. (Kwang，J.)等人，1994,兽医诊 断研究杂志 6:293-296) ;PRRS 的 Quebec LAF-exp91 病毒株（梅尔达希，H. (Mardassi, H.) 等人，1995,病毒学文献（Arch. Virol. ) 140:1405-1418);以及北美PRRS病毒分离株VR 2385 (孟，X. -J (Meng, X. -J)等人，1994,普通病毒学杂志（J. Gen. Virol.) 75:1795-1801)。 遗传特性是指由北美PRRS病毒株所共享的基因组核苷酸序列类似性和氨基酸序列类似 性。中国PRRS病毒株一般显示出与北美病毒株约80-93%的核苷酸序列类似性。
[0146] "欧洲PRRS病毒"是指具有与最初在欧洲在约1991年分离的PRRS病毒相关的遗 传特性的PRRS病毒的任何病毒株（参见例如，温斯福德，G. (Wensvoort，G.)等人，1991， 兽医问题（Vet. Q.) 13:121-130)。"欧洲PRRS病毒"在本领域中有时也指"莱利斯塔德病毒 (Lelystad virus) '，。
[0147] 出于本发明的目的，"有效免疫保护反应"、"免疫保护"等术语意指在接种疫苗的 动物中针对病原体的一或多个抗原表位从而保护不被病原体感染的免疫反应。出于本发明 的目的，保护不被病原体感染不仅包括感染的绝对预防，而且包括相比于未接种疫苗的感 染动物，在接种疫苗的动物中，被病原体感染的程度或比率的任何可检测的降低，或由被病 原体感染产生的疾病或任何症状或病状的严重程度的任何可检测的降低。可以在先前尚未 感染病原体和/或在接种疫苗时未感染病原体的动物中诱导有效免疫保护反应。还可以在 接种疫苗时已经感染了病原体的动物中诱导有效免疫保护反应。
[0148] 如果遗传修饰PRRS病毒的毒性低于其未修饰的亲本病毒株，那么它是"减毒的"。 如果病毒株显示出决定疾病严重程度的一或多个参数的统计显著减少，那么它的"毒性较 低"。所述参数可以包括病毒血症的程度、发烧、呼吸窘迫的严重程度、繁殖症状的严重程 度、或肺部病灶的数量或严重程度等。
[0149] "能够支持PRRS病毒复制的宿主细胞"意指能够在感染本发明病毒时产生感染性 PRRS的细胞。所述细胞包括单核细胞/巨噬细胞系的猪细胞，例如猪肺泡巨噬细胞和衍生 物、MA-104猴肾细胞和衍生物（例如MARC-145细胞）以及经PRRS病毒受体转染的细胞。 术语"能够支持PRRS病毒复制的宿主细胞"还可以包括在活猪内的细胞。
[0150] 如本文中所用的"开放阅读框"或"0RF"意指用于编码特定PRRS病毒蛋白所需的 不含中间终止密码子的最小核苷酸序列。
[0151] "猪（Porcine) "和"猪（swine) "在本文中可互换地使用并且是指作为猪科的成员 的任何动物，例如猪（pig)。除非另外指出，否则如本文中所用的术语"PRRS病毒"意指北 美或欧洲PRRS病毒的任何病毒株。
[0152] "PRRS"涵盖猪中由PRRS病毒感染所引起的疾病症状。所述症状的实例包括（但 不限于）发烧、怀孕母畜的流产、呼吸窘迫、肺部病灶、食欲不振以及幼猪的死亡。如本文所 用的"不能够产生PRRS"的PRRS病毒是指可以感染猪，但是在猪中不产生通常与PRRS感染 相关的任何疾病症状的病毒。
[0153] 如本文中所用的PRRSV "N蛋白"或"0RF7"定义为由PRRS病毒的欧洲和北美基因 型两者的0RF7编码的多肽。当前已知的N蛋白的具体同型的实例是在基因库中通过寄存 编号PRU87392报告的北美PRRS原型分离株VR2322的123氨基酸多肽，和在基因库中通过 寄存编号A26843报告的欧洲原型PRRS分离株莱利斯塔德的128残基N蛋白。
[0154] "PRRSV N 蛋白 NLS-I 区"或 "PRRSV 0RF7 NLS-I 区"是指 "pat4" 或 "nucl" 核定 位信号（中井（Nakai)和兼久（Kanehisa), 1992 ;罗兰（Rowland)和柳（Yoo) ,2003)，它含 有四个连续的碱性氨基酸（赖氨酸或精氨酸）或三个碱性残基和一个组氨酸或脯氨酸，位 于成熟N蛋白的约前15个N端残基内。举例来说，VR2332 NLS-I区序列是KRKK并且位于 残基9-12,而莱利斯塔德分离株序列是KKKK并且位于N蛋白的残基10-13。
[0155] "PRRSV N蛋白NLS-2区"或"PRRSV 0RF7 NLS-2区"是指在N蛋白内的第二核定 位信号，它可以采用两种形式中的一种。在北美PRRS病毒中，NLS-2具有一种被我们命名 为"pat8"基元的模式，它始于脯氨酸，之后的三个残基内跟随一个五残基序列，所述序列在 五个残基中含有至少三个碱性残基（K或R)(由中井和兼久，1992 ;罗兰和柳，2003描述的 "pat7"或"nuc2"基元的轻微修饰）。举例来说，此类序列位于北美PRRSV分离株VR2332 的N蛋白残基41-47,并且由序列P……K表示。在欧洲PRRS病毒中，NLS-2具有"pat4" 或"nucl"基元，它是四个碱性氨基酸或与组氨酸或脯氨酸相连的三个碱性残基的连续延伸 (中井和兼久，1992 ;罗兰和柳，2003)。欧洲PRRSV分离株莱利斯塔德的NLS-2位于残基 47-50并且由序列K……K表示。
[0156] "PRRSV N蛋白NoLS区"或"PRRSV 0RF7 NoLS区"是指核仁定位信号，具有约32 个氨基酸的总长度并且在其氨基端附近并有NLS-2区。举例来说，VR2332 NoLS区序列位 于残基41-72并且由序列P……R表示（罗兰和柳，2003)，而对应莱利斯塔德分离株序列 位于残基42-73并且由序列P......R表示。
[0157] "经转染宿主细胞"意指如美国专利第5, 600, 662号中所述，在经PRRS病毒RNA转 染时可以产生至少第一轮PRRS病毒粒子的几乎任何宿主细胞。
[0158] 出于本发明的目的，"感染性DNA分子"是编码用于支持从合适的宿主细胞复制、转 录以及转译成功能性病毒粒子所需要素的DNA分子。
[0159] 类似地，"经分离多核苷酸分子"是指包含从其天然存在状态（如果存在的话）纯 化到任何可检测程度的本发明多核苷酸分子的物质组合物。
[0160] 出于本发明的目的，第二多核苷酸分子（RNA或DNA)的核苷酸序列是与第一多核 苷酸分子的核苷酸序列"同源的"，或与所述第一多核苷酸分子具有"一致性"，其中如基于 遗传密码的简并，或当第二多核苷酸分子的核苷酸序列编码足够类似于由第一多核苷酸分 子的核苷酸序列编码的聚氨基酸的聚氨基酸以便适用于实践本发明时，它编码与第一多核 苷酸分子的核苷酸序列相同的聚氨基酸。同源多核苷酸序列也是指有义链和反义链，并且 在所有情况下是指任何所述链的互补序列。出于本发明的目的，多核苷酸分子适用于实践 本发明，并且因此是同源的或具有一致性，其中它可以用作用于检测被感染的猪的体液或 组织样品中PRRS病毒或病毒多核苷酸的存在的诊断探针，例如通过标准杂交或扩增技术。 一般来讲，如基于BLASTN算法（美国国立卫生研究院（United States National Institute of Health)的美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information)，另被称为 NCBI，（美国马里兰州贝塞斯达（Bethesda, Maryland, USA)))， 如果第二多核苷酸分子的核苷酸序列与第一多核苷酸分子的核苷酸序列具有至少约70% 核苷酸序列一致性，那么它与第一多核苷酸分子的核苷酸序列同源。在用于根据本发明 实践计算的具体实例中，提到了 BLASTP2. 2. 6 [塔图索瓦TA (Tatusova TA)和TL马登 (TL Madden)，"BLAST 2序列-一种用于比较蛋白质和核苷酸序列的新工具（BLAST 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences) ·'，（1999) FEMS微生物学快报（FEMS Microbiol Lett. ) 174:247-250.]。简单来说，使用空位开放 罚分10、空位延伸罚分0. 1以及赫尼霍夫（Henikoff)和赫尼霍夫（美国国家科学院院刊 89:10915-10919. 1992)的"blosum62"评分矩阵比对两个氨基酸序列以优化比对评分。然 后如下计算一致性百分比：一致匹配的总数XlOO/除以较长序列的长度+为了比对两个序 列而引入到较长序列中的空位的数量。
[0161] 优选地，同源核苷酸序列具有至少约75%核苷酸序列一致性，甚至更优选地至少 约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%核苷酸序列一致性。由于遗传密码是简 并的，所以同源核苷酸序列可以包括任何数量的"沉默"碱基改变，即仍然编码相同氨基酸 的核苷酸取代。
[0162] 同源核苷酸序列可以进一步含有非沉默突变，即在所编码的聚氨基酸中产生氨基 酸差异的碱基取代、缺失或添加，只要所述序列保持与由第一核苷酸序列编码的聚氨基酸 至少约70%-致或以其它方式适用于实践本发明即可。就此而言，可以进行公认为不使整 体蛋白质功能失活的某些保守氨基酸取代：例如关于带正电荷的氨基酸（且反之亦然）赖 氨酸、精氨酸和组氨酸；关于带负电荷的氨基酸（且反之亦然）天冬氨酸和谷氨酸；以及关 于某些不带电氨基酸的群组（并且在所有情况下，也反之亦然），（1)丙氨酸和丝氨酸，（2) 天冬酰胺、谷氨酰胺和组氨酸，（3