)半胱氨酸和丝氨酸，（4)甘氨酸和脯氨酸，（5)异亮氨酸、 亮氨酸和缬氨酸，（6)甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，（7)苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和酪 氨酸，（8)丝氨酸和苏氨酸，（9)色氨酸和酪氨酸，（10)以及例如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨 酸。可以根据物理性质和对二级与三级蛋白质结构的贡献对氨基酸进行分类。保守取代在 本领域中被认为是一种氨基酸被具有类似性质的另一种氨基酸取代。例示性保守取代可见 于 1997 年 3 月 13 日公开的 WO 97/09433 第 10 页（PCT/GB96/02197,1996 年 9 月 6 日提 交）中。可替代地，保守氨基酸可以如勒宁格尔（Lehninger)(生物化学（Biochemistry), 第二版；沃斯出版社公司（Worth Publishers, Inc. )NY:NY(1975),第71页-第77页）中 所述进行分组。其它合适的保守改变和其应用如下所述。
[0163] 可以通过比较核苷酸序列，例如通过使用上文的BLASTN来确定同源核苷酸序列。 可替代地，可以通过在选定条件下杂交来确定同源核苷酸序列。举例来说，如果第二多核苷 酸分子的核苷酸序列与SEQ ID NO: 1的互补序列在适当严格的条件下杂交，例如在65°C下 在0. 5M NaHP04、7%十二烷基硫酸钠（SDS)、ImM EDTA中与过滤器结合的DNA杂交，并且在 42°C下在0. 2 X SSC/0. 1% SDS中洗涤（参见奥斯贝（Ausubel)等人编，分子生物学实验方 法汇编（Protocols in Molecular Biology),威利父子公司（Wiley and Sons) ,1994，第 6. 0. 3页到第6. 4. 10页），或将以其它方式引起如下文所定义的编码PRRS病毒的序列的杂 交的条件，那么它与SEQ ID N0:1(或任何其它特定多核苷酸序列）同源。可以凭经验确定 或基于探针的长度和鸟苷/胞嘧啶（GC)碱基配对的百分比准确计算杂交条件的修改。可以 如萨姆布鲁克等人(编），分子克降实骑指南,冷泉港实验室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press):冷泉港（Cold Spring Harbor),纽约州（New York) (1989),第 9.47 页到第9. 51页所述计算杂交条件。
[0164] 在另一个实施例中，如果第二核苷酸序列与SEQ ID NO: 1的互补序列在非常严格 的条件下杂交，例如在65°C下在0. 5M NaHP04、7% SDSUmM EDTA中与过滤器结合的DNA杂 交，并且在68°C下在0. 1XSSC/0. 1% SDS中洗涤，如本领域中已知（奥斯贝（Ausebel)等 人最新分子生物学实验方法汇编（Current Protocols in Molecular Biology),格林出版 社和威利国际科学出版社（Greene Publishing and Wiley Interscience),纽约，1989)， 那么它与SEQ ID NO: I (或本发明的任何其它序列）同源。
[0165] 此外应了解，本发明的经分离多核苷酸分子和经分离RNA分子包括合成分子和通 过重组技术，例如通过体外克隆和转录获得的分子两者。
[0166] 多核苷酸分子可以使用本领域普通技术人员已知的重组技术进行基因突变，包括 通过定点诱变，或通过随机诱变，例如通过暴露于化学诱变剂或辐射，如本领域中已知。可 以通过本领域中已知的标准方法进行突变，例如如（例如莫伊伦贝格（Meulenberg)等人， 实验医学与生物学进展（Adv. Exp. Med. Biol.), 1998,440:199-206)所述的感染性拷贝的 定点诱变（参见例如萨姆布鲁克等人（1989)分子克隆实验指南，第2版，冷泉港实验室 出版社，冷泉港，纽约州）。
[0167] 因此，本发明进一步提供一种用于制造遗传修饰北美PRRS病毒的方法，所述方法 包含使编码感染性RNA分子的DNA序列突变，所述感染性RNA分子编码如上所述的PRRS病 毒；并且使用合适的表达系统表达遗传修饰PRRS病毒。可以使用本领域中通常已知的合适 表达系统，从经分离多核苷酸分子表达遗传修饰PRRS病毒，其实例描述在本申请中。举例 来说，经分离多核苷酸分子可以呈能够在合适的宿主细胞中体外表达所编码病毒的质粒形 式，如下文进一步详细描述。
[0168] 北美PRRSV N蛋白序列是高度保守的并且所报告的序列彼此具有约93-100% - 致性。北美和欧洲PRRSV N蛋白是约57-59%-致的并且共享共同的结构基元。一般来讲， 当比较PRRS编码序列和分离株（它们可以与特定核苷酸或所编码的氨基酸以不同方式编 号）时，易于通过鉴别相关PRRS病毒株中所保存的特征氨基酸并且将它与参考病毒株进行 比对来实现恰当区域的鉴别。
[0169] 重组DNA技术包含旨在以DNA水平修饰核酸的极其多变并且强大的分子生物学技 术，并且使在分子水平分析和修饰基因组成为可能。在这方面，例如PRRS病毒等病毒由于 其基因组的适度大小而尤其能够经受所述操作。然而，重组DNA技术并不可立即应用于非 反转录病毒RNA病毒，因为这些病毒在其复制过程中不涵盖DNA中间步骤。关于所述病毒， 必须在重组DNA技术可以应用于其基因组以产生修饰病毒之前发展感染性cDNA克隆。感染 性克隆可以通过构造在研究中的病毒的全长（基因组长度）cDNA (这里是在RNA的DNA拷 贝的广泛意义上并且不仅在mRNA的DNA拷贝的严格意义上使用）得到，之后在经全长cDNA 转染的细胞中体内合成感染性转录物，但是感染性转录物还可以通过在具有原核启动子的 质粒中在存在转录混合液的情况下从全长cDNA体外转录获得，或同样使用包含完整病毒 基因组的接合部分长度cDNA片段体外获得。在所有情况下，所转录的RNA携带已被引入到 cDNA中的所有修饰并且可以用以使如此修饰的病毒进一步传代。
[0170] 欧洲PRRS病毒分离株或莱利斯塔德病毒的感染性克隆的制备描述在美国专利 第6, 268, 199号中，所述专利以引用的方式完全并入本文中。命名为P129 (李（Lee)等 人，2005 ;柳等人，2004)的北美PRRS病毒分离株的感染性cDNA克隆的制备描述在美国专 利第6, 500, 662号中，所述专利以引用的方式完全并入本文中。P129 cDNA的序列披露于基 因库寄存编号AF494042中和美国专利第6, 500, 662号中。我们以下的工作利用这类感染 性克隆，它在质粒的情况下通过CMV即刻早期启动子表达并且已被命名为pCMV-S-P129并 且也披露在美国专利第6, 500, 662号内。如美国专利第6, 500, 662号中所描述，存在适用 于此的其它质粒和启动子。
[0171] 鉴于任何相关开放阅读框的全序列和相关氨基酸残基的位置，普通技术人员仅仅 需要查询密码子表来设计在所希望的特定位置的改变。
[0172] 密码子构成了 mRNA和其对应cDNA分子中核苷酸的三重序列。密码子当存在于 mRNA分子中时以碱基尿嘧啶（U)为特征，但是当存在于DNA中时以碱基胸苷（T)为特征。 多核苷酸内相同氨基酸残基的密码子简单改变将不改变所编码多肽的序列或结构。显然当 短语陈述特定3核苷酸序列"编码"任何特定氨基酸时，一般熟练的业内人士将认识到上表 提供了讨论中的特定核苷酸的鉴别手段。举例来说，如果特定三核苷酸序列编码赖氨酸，那 么上表披露了两种可能的三重序列是AAA和AAG。甘氨酸是由GGA、GGC、GGT(如果在RNA 中，那么是GGU)以及GGG编码的。为了将所编码蛋白质中的赖氨酸变成甘氨酸残基，可以 用GGA和GGC、GGT或GGG中的任一者替换编码核酸中的AAA或AAG三联体。
[0173] 如上文所提到，本发明是针对提供PRRS的疫苗病毒株，其中除了其它反应以外， 不下调由干扰素路径介导的宿主对病毒的反应。如下文详细描述，存在对病毒基因组的各 种修饰，这些修饰就此而言是有效的，尤其是在如本文所披露的ORFla中所发现的那些，以 及其组合。应注意，类似修饰点可见于PRRS基因组的其它开放阅读框中，也披露在本文中 (参见表9)。
[0174] 值得注意的是，为了减弱PRRS病毒而用于PRRS多核苷酸修饰的某些其它先前方 法已经成功了，有可能提供疫苗使用的适合性，但是所得减毒的确切原因尚未普遍知晓。举 例来说，已经披露了通过突变或删除病毒的核衣壳或N蛋白（由0RF7编码）中的NLS-2区、 NoLS区或NES区，从而包括开放阅读框7 (0RF7)中的缺失而使毒性PRRS病毒减弱。在另一 方面，0RF7缺失是在编码衣壳蛋白的核定位信号（NLS)的序列内。在编码NLS的序列内的 0RF7缺失可以包括在位置43-48的一或多个氨基酸的缺失或在位置43和44中的任一者或 两者的氨基酸缺失。参见例如美国专利7, 544, 362的完整披露内容，所述专利以引用的方 式并入本文中。由0RF7编码的PRRSV的核衣壳蛋白（N)是一种被磷酸化的小碱性蛋白（伍 顿（Wootton)、罗兰以及柳，2002)并且形成同型二聚体（伍顿和柳，2003)。近来已经确定 了晶体结构（多恩（Doan)和多克兰（Dokland)，2003)。N蛋白在感染细胞中似乎具有多种 功能。除了形成内部包装有基因组RNA的球形衣壳结构，一种在细胞质中发生的过程以外， 一部分N蛋白还被输送到细胞核中并且更明确地说被输送到被感染细胞的细胞核。N蛋白 的氨基酸序列含有两种核定位信号（NLS):核仁定位信号（NoLS)和核输出信号（NES)，它们 对应地促进输送到细胞核和核仁中并且从细胞核输出（罗兰等人，1999 ;罗兰等人，2003 ; 罗兰和柳，2003)。同时在核仁中，N蛋白与小核仁RNA相关蛋白纤维蛋白相互作用并且可 以调节感染细胞中的rRNA加工和核糖体生物合成以便促进病毒复制（柳等人，2003)。这 种类型的病毒突变单独或与其它减毒突变组合对于设计新颖PRRS疫苗是有价值的。在已 经减毒的PRRS病毒的另一个实例中，采用了对ORFla的修饰。采用了编码在ORFla的非结 构蛋白2编码区中的高变区中的氨基酸616到752之间的抗原表位的DNA序列的缺失，参 见美国专利7, 618, 797,所述专利以全文引用的方式并入本文中。
[0175] 关于PRRS病毒的免疫生物学的研究表明，PRRS病毒与TOC的相互相用有益于检 查。这种细胞类型代表了人类、小鼠、大鼠、猪以及猴中〇. 2% -0. 8%的外周血单个核细胞。 尽管其稀少，但是这种细胞是先天免疫系统的一种重要组分并且能够在病毒刺激之后分泌 大量IFN-a。PDC是通过IFN-α的分泌而在调节抗病毒先天性和适应性免疫中起主要作 用，因为它们促进了自然杀伤细胞、B细胞以及T细胞的功能。此外，通过PDC分泌的IFN-a 帮助了猪单核细胞来源树突状细胞（MoDC)的成熟，产生MoDC对所存在抗原和活化T细胞 的强化能力。在病毒感染的后期，PDC分化成独特类型的成熟树突状细胞，它直接调节T细 胞的功能并且指导T细胞分化成能够分泌IFN-γ的细胞，IFN-γ是对抗病毒（包括PRRS 病毒）的抗病毒免疫的主要介体。不出意料，存在已知抑制PDC分泌IFN-a的能力的人类 病毒，例如呼吸道合胞病毒和麻疹病毒。这种抑制作用被认为在由于感染了这些病毒所观 察到的体液免疫反应的优势和相关免疫病理学中，以及在宿主对继发性细菌和病毒感染的 增加易感性中起一定作用。
[0176] 相比之下，野生型PRRSV分离株以及两种Ingelvac PRRS疫苗病毒株（参见下文 中的实例5和以下实例）抑制猪PDC的经纯化群体产生IFN- α的能力，而新颖P129-PK-FL 和P129-PK-d43/44病毒储备液（参见下文）展现出对这种PDC功能的最小到无的抑制作 用。这些观察结果的重要性部分在于IFN-α在调节对病毒的适应性免疫反应的发展中的 重要性。因此，来源于最小IFN-a抑制病毒的减毒病毒疫苗极有可能将引发强烈的抗病毒 保护免疫反应。先前已经证明了 IFN-a对Ingelvac PRRS MLV疫苗诱导的病毒特异性T 细胞介导的IFN-γ反应的辅助作用，并且在野外和实验室条件下，由疫苗引起的病毒特异 性T细胞介导的IFN-γ反应的强度与对抗病毒的保护性免疫具有正相关。因此，虽然不受 理论限制，但是可以合理预计细胞介导的免疫反应和由非IFN-α抑制PRRSV引起的保护性 免疫的水平将显著大于展现野生型（IFN-a抑制）表现型的PRRSV分离株。
[0177] 参看本发明，值得注意的是，P129-PK-FL病毒以及来源于pCMV-S-P129-PK感染性 cDNA克隆的所有五种缺失突变体都失去了抑制IFN-a产生的能力。因此，这种与众不同 的表现型可能不是仅仅由于缺失，但是一定至少部分地由于在感染性克隆的构造期间变成 固定的基因改变。有趣的是，在PK-9细胞上连续传代63次的未克隆的P129病毒保留了抑 制IFN诱导的能力（表1)。在所有感染性克隆来源病毒中所看到的常见IFN表现型的最 可能解释是在感染性克隆的产生期间并入了一或多个突变。这些突变本来应该可能以低 水平存在于用来构造感染性克隆的病毒RNA中。最终，这些突变可能已经存在于猪的初始 (第〇代）病毒中或它们可以在使病毒适应在PK-9细胞上生长持续16次传代的过程期间 产生并且富集。不能排除突变是PCR诱导错误或克隆假象的结果的可能性。无论如何，导 致IFN-α抑制功能丢失的突变在感染性克隆构造期间变成"固定"的，并且预计将存在于 来源于这种特定感染性克隆的所有病毒中。
[0178] 考虑到已知PRRSV由于病毒RNA依赖性RNA聚合酶的错误而易于产生随机遗传多 样性，导致改变的IFN- α抑制表现型的突变预存在于用来构造 cDNA克隆的病毒RNA中的 可能性是可能的。病毒准种由自然地出现于病毒体内复制期间的密切相关的遗传变异体的 不均匀混合物组成。甚至更相关的是在来源于感染性cDNA克隆的PRRSV的多次体外传代之 后，病毒准种的观察结果。这是值得注意的，因为在先前进行的研究中病毒基因组的起始群 体由基因同源群体组成，并且序列多样性在传代期间在细胞培养液中迅速地产生。在当前 研究中，基因组异源性水平本来应该更高，因为初始P129病毒在构造感染性克隆之前的16 次PK-9传代之前尚未被克隆（以生物学方式或以分子方式）。因此，准种之中导致IFN-a 抑制功能丢失的PRRSV RNA变异体的机会选择和并入到pCMV-S-P129-PK17-FL感染性cDNA 克隆中似乎是合理的。在一些情况下，考虑到所有衍生病毒应该共享可以证明对有效的下 一代PRRS疫苗的发展至关重要的这种独特生物表现型，将这些突变并入到感染性克隆中 可以被视为偶然的。
[0179] 野生型PRRS病毒株P129如这种病毒的其它病毒株一样，展现出对外周血单个核 细胞（PBMC)和浆细胞样树突状细胞（TOC)产生干扰素（IFN)-a的能力的强烈抑制作用。 另一方面，来源于P129的感染性cDNA克隆（pCMV-S-P129-PK17-FL)的病毒展现出IFN-a 抑制表现型显著减少。这种感染性克隆是从先前经适应以在表达CD163的猪肾细胞系PK-9 上生长的病毒在16次连续传代的过程中构造的（参见美国专利7, 754, 464,所述专利以全 文引用的方式并入本文中）。P129-PK-FL和P129-PK-d43/44的IFN-a抑制表现型在低 到可忽略的之间变化并且与两种Ingelvac PRRS修饰活病毒疫苗病毒株中的任一者所展 现的IFN-α抑制表现型形成鲜明对比，这两种病毒株均是高度抑制性的。这些结果表明 P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒在生物学上不同于亲本低传代P129分离株、其它野生 型PRRS病毒以及两种Ingelvac PRRS疫苗。讨论了降低的IFN-a抑制性表现型的潜在含 义以及表现型改变的可能原因。
[0180] 本发明的氨基酸修饰
[0181] 根据本发明的实践，PRRS的新颖分离株，无论具有北美或中国基因型，都可以被野 外鉴别，这些分离株在从ORFl编码的蛋白质中的特定位置含有特定含有氨基酸，并且赋予 这些病毒所希望的表现型。在替代方案中，如上文所提到，可以采用标准基因程序来修饰所 编码ORFl蛋白的基因序列（并且由此修饰氨基酸序列），此外产生经修饰北美和中国PRRS 病毒以及来自这些病毒的感染性克隆和疫苗，所有这些都提供所述表现型。在优选实例中， 表现型包括（但不限于）如相比于野生型PRRS病毒有所降低的干扰素-a抑制作用，并且 任选地，用于在宿主动物（猪）中繁殖或存留同时触发稳固的免疫反应的能力，但是具有极 少的可检测病理学。
[0182] 因此，在本发明的实践中，可以充当有用的起始点的北美PRRS病毒株或分离 株包括例如在美国专利 6, 500, 662 ;7, 618, 797 ;7, 691，389 ;7, 132, 106 ;6, 773, 908 ; 7, 264, 957 ;5, 695, 766 ;5, 476, 778 ;5, 846, 805 ;6, 042, 830 ;6, 982, 160 ;6, 241，990 ;以及 6, 110, 468中披露的那些。关于可以充当有用的起始点的中国PRRS病毒株和分离株，参见 例如来自关于TJM-92病毒的中国申请CN201633909的公开中国申请CN200910091233. 6。
[0183] 结合以下讨论，关于由DNA编码的大多数常见氨基酸使用国际公认的单字母和三 字母名称：丙氨酸（Ala，A);精氨酸（Arg，R);天冬酰胺（Asn，N);天冬氨酸（Asp，D);半胱 氨酸（Cys，C);谷氨酸（Glu，E);谷氨酰胺（Gln，Q);甘氨酸（Gly，G);组氨酸（His，H);异 亮氨酸（Ile，I);亮氨酸（Leu，L);赖氨酸（Lys，K);甲硫氨酸（Met，M);苯丙氨酸（Phe，F); 脯氨酸（Pro，P);丝氨酸（ser，S);苏氨酸（Thr，T);色氨酸（Trp，W);酪氨酸（Tyr，Y)以及 缬氨酸（Val，V)。
[0184] 表9和表10鉴别所观察到的导致北美（和中国）PRRS的毒力减弱的氨基酸改变， 这些改变与干扰素 α活性的抑制降低有关，从而允许对疫苗的安全并且稳固的免疫反应。 表10鉴别在ORFla内就此而言高度优选的氨基酸修饰，并且显示这些突变如何关于从其它 P129培养物的传代出现（应注意，这个历史的检查也有助于用于（重新）构造具有本发明 氨基酸改变中的任一者（根据需要）的编码DNA的诱变策略的设计）。就此而言，ORFla的 最优选氨基酸改良（如通过P129第52代所证明）包括：在182的天冬酰胺、在189的天冬 酰胺、在273的酪氨酸、在302的组氨酸、在665的苏氨酸、在943的半胱氨酸、在1429的苏 氨酸、在1505的丙氨酸、在2410的天冬酰胺，这些改良也潜在地增加了许多糖基化机会并 且可以进一步改变蛋白质功能。
[0185] 因此，本发明进一步提供一种经分离猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS)，其中其由 ORFla编码的蛋白质选自由含有以下中的任一者的那些氨基酸序列组成的群组：
[0186] 在氨基酸序列AMAPYD (SEQ ID NO:9)内的氨基酸N ;
[0187] 在氨基酸序列IGHMVM(SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N ;
[0188] 在氨基酸序列TVP2GNC(SEQ ID N0:15)内的氨基酸D ;
[0189] 在氨基酸序列CffffILFD (SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y ;
[0190] 在氨基酸序列HGVHGKY(SEQ ID NO: 21)内的氨基酸H ;
[0191] 在氨基酸序列AAKYDQY(SEQ ID NO: 24)内的氨基酸V ;
[0192] 在氨基酸序列PSAIDTS (SEQ ID NO: 27)内的氨基酸T ;
[0193] 在氨基酸序列LNSLLSK(SEQ ID NO:30)内的氨基酸L ;
[0194] 在氨基酸序列APM￡QDE (SEQ ID NO: 33)内的氨基酸C ;
[0195] 在氨基酸序列CAPIGMD(SEQ ID NO:36)内的氨基酸T ;
[0196] 在氨基酸序列PKVAKV