[0290] 在接种疫苗之后测量接种疫苗的动物的直肠温度并且将其与TOl (模拟疫苗）处 理组进行对比。结果示出在图1中。没有一种疫苗诱导发烧。在接种疫苗后的整个观察阶 段中，所有组平均小于104°C。
[0291] 测量攻击后猪的直肠温度。结果示出在图2中。未接种疫苗的TOl猪显示维持大 于104°C的热度。相比之下，这些疫苗中的三种在攻击后热度显著降低。P129-PK-FL在降 低热度方面最有效。
[0292] 记录接种疫苗之前和之后的动物体重。结果示出在图3中。在研究的前1天（在 接种疫苗之前）、第10天、第24天、第27天（在攻击之前）以及第37天记录体重。在未 接种疫苗的猪中，用毒性NADC20病毒攻击几乎完全消除了 10天观察阶段期间的体重增加。 所述疫苗不同程度地否定这种作用。
[0293] 在攻击之后，在尸体剖检时检查被攻击动物的肺。每个肺的涉及病灶的百分比示 出在图4中。TOl模拟疫苗组平均25. 1%肺部病灶涉及率。所述疫苗不同程度地降低了肺 部病灶。P129-PK-FL是最有效的，使肺部病灶涉及率降低到I. 1%。
[0294] 使用肺评估评分（LAS)来评估肺部病灶的严重程度，如图5所示。所述疫苗中的 三种降低LAS。P129-PK-FL使平均LAS从模拟接种疫苗组中的1. 63降低到0. 14。
[0295] 通过接种疫苗和攻击两者诱导针对PRRSV的血清抗体。在研究的第27天和第37 天测量IDEXX ELISA S/P比率。结果示出在图6中。接种P129-PK-FL诱导出最高水平的 抗PRRS抗体。
[0296] 在PAM细胞上滴定被攻击的猪的血清中的病毒血症。结果（TCIDM/mL)给出在图 7中。P129-PK-FL在减少攻击后病毒血症方面是最有效的。
[0297] 虽然已经参见以上实例和附件（所述附件中的每一个的完整内容以其全文引用 的方式并入本文中）描述了本发明，但是应了解，在本发明的精神和范围内涵盖修改和变 化形式。因此，本发明仅受以下权利要求书的限制。
[0298] 实例 7
[0299] 来自感染件 CDNA 克降 PCMV-S-P129 的感染件 CDNA 克降 PCMV-S-P129-PK17-FL 的 衍牛物
[0300] 本发明的PRRSV感染性cDNA克隆pCMV-S-P129-PK17-FL可以使用定点诱变技 术，由本领域的技术人员容易地从先前所述的PRRSV感染性cDNA克隆pCMV-S-P129得到。 PRRSV感染性cDNA克隆pCMV-S-P129描述于美国专利第6, 500, 662号中，并且以寄存编号 203489保藏于ATCC。这种克隆中的PRRSV基因组的DNA序列也可在基因库（NCBI)数据库 中以寄存编号AF494042获得。定点诱变试剂盒可购自多个供应商，并且能够在大质粒中在 多个位点同时制造许多核苷酸改变。所述试剂盒包括（但不限于）Change-IT?多点突变定 点诱变试剂盒（昂飞（Affymetrix)/USB)、QuikChange快速多定点诱变试剂盒（安捷伦技 术 -斯塔津产品（Agilent Technologies-Stratagene Products))以及 AMAP 多定点诱变 试剂盒（MBL国际性组织（MBL International))。
[0301] PRRSV感染性cDNA克隆pCMV-S-P129 (可自ATCC获得）与本发明的PRRSV感染 性cDNA克隆pCMV-S-P129-PK17-FL之间的核苷酸改变的清单呈现在表8中。所有改变都 是在基因组的蛋白质编码区域中。存在总共74种核苷酸改变，它们可以使用74种突变诱 发引物和与市售定点诱变试剂盒的多个序列反应被引入到PCMV-S-P129感染性克隆中，产 生在序列上与本文中所述的PCMV-S-P129-PK17-FL -致的质粒分子。实际上，可以在少于 74种突变诱发引物的情况下得到相同结果，因为可以使用单一突变诱发引物改变在彼此的 约50-60个核苷酸内的突变簇。举例来说，可以使用单一突变诱发引物改变核苷酸735、750 和756,如同可以改变核苷酸965、992和1009 -样。因此引物数量被降到约60。
[0302] 在74种核苷酸改变中，大多数（42种）是同义或"沉默"的，意指它们编码相同氨 基酸。这些核苷酸改变不太可能对病毒的干扰素诱导或抑制表现型造成任何可测量的影 响。其余的32种核苷酸改变是非同义或"非沉默"的，并且引起病毒蛋白中的氨基酸改变。 预测这32种核苷酸改变直接导致病毒的干扰素诱导/抑制表现型，并且应该被改变以便将 由感染性克隆PCMV-S-P129编码的病毒转化成如由感染性克隆pCMV-S-P129-PK17-FL编码 的病毒所示的相同干扰素表现型。此类改变将需要最多32种突变诱发引物，如果考虑到一 些相关核苷酸的成簇，那么更少。
[0303] 实例 8
[0304] 感染件CDNA克降PCMV-S-P129-PK17-FL的从头合成
[0305] 作为定点诱变的一个替代方案，本发明的PRRS病毒基因组可以用适当的5'和3' 衔接子序列以化学方式从头合成，并且克隆到用于PRRS感染性cDNA克隆pCMV-S-P 129 (可 自ATCC以寄存编号203489获得）的质粒骨架或类似质粒骨架中。长度大于50kb(PRRSV 基因组是约15. 5kb)的基因的委托合成可以商业服务形式从许多供应商获得，所述供应商 包括（但不限于）：金斯瑞（GenScript)、DNA 2.0以及生物基础公司（Bio Basic Inc·)。 通过使用侧接基因组的5' PacI和3' SpeI限制酶位点替换感染性克隆pCMV-S-P129中的病 毒基因组，将合成病毒基因组定向克隆到PCMV-S载体中。为了切割合成基因组，将24个核 苷酸的延伸部分（5' -GCAGAGCTCGTTAATTAAACCGTC-基因组_3'，它包括带下划线的PacI位 点）构建到合成基因组的5'端中，并且将83个核苷酸的延伸部分（5'_基因组-AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAATGCATATTTAAATCCCAAGCCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGAGCGGCCGC-3' ， 它包括带下划线的SpeI位点）构建到合成基因组的3'端中。在用PacI和SpeI切割质粒 和合成基因组之后，纯化适当片段，使用DNA连接酶连接，并且使用本领域的普通技术人员 众所周知的标准克隆技术转型到大肠杆菌中进行筛选和繁殖。
[0306] 表 L
[0308] 表 2.
[0309]
[0331] 实例 9.
[0332] 由P129-PKC12-FL病毒组成的痔苗用于1日龄猪是安全的并目.可有效持续至小26
[0333] 现有的经PRRS修饰的活疫苗仅建议用于两周龄或更大的猪。进行研究以确定减 毒P129-PKC12-FL病毒在第57代（2. 131og1QTCID5Q/2mL剂量）用于1日龄新生猪是否安 全，并且免疫原性是否足以在接种疫苗之后长达6个月（26周）提供对抗毒性异源攻击的 保护。（这与如SEQ ID No:6中所述的第52代病毒基本上相同）。
[0334] 24只PRRSV血清反应阴性的怀孕大母猪来源中的总共22只生下了健康猪崽。根 据分配，在约1日龄（第0天），以肌内注射向这些猪（猪崽）投与单一 2. OmL剂量的模拟 疫苗或P129-PKC12-FL病毒疫苗。产仔/分娩笼中所有健康猪崽在同一天接受相同模拟疫 苗（11窝，100只猪崽）或P129-PKC12-FL病毒疫苗（11窝，91只猪崽）。
[0335] 模拟接种的大母猪和猪崽在整个疫苗接种阶段中保持PRRSV阴性。没有检测到混 杂的疾病因素。用于证明在1日龄接种疫苗的猪崽中的安全性的主要变量是接种疫苗后的 临床观察结果。使用血清学来证实所有猪崽的成功疫苗接种。
[0336] 观察并记录所有猪崽在接种疫苗后第1天到第10天的临床观察结果。在投与对 照产品（TOl)的100只猪（猪崽）和投与测试产品（T02)的91只猪崽中，分别观察到15 和14只猪不正常（表11，涉及在本具体实例内编号的表格）。观察到不正常的猪崽进一步 指出具有异常的一般状况和/或沮丧。
[0337] 表11 :曾在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗或对照疫苗之后观察到临床征象的猪 的数量[观察到具有异常健康状况的动物的数量（观察到具有异常病状的动物的百分比）]
[0339] IDEXX ELISA结果证实了所有的猪在接种疫苗之前对于PRRSV都是阴性的（S/P比 率〈0.4)并且所有模拟疫苗对照组在此研究的疫苗接种阶段期间保持血清学阴性。在接种 疫苗之后，P129-PKC12-FL疫苗组中所有的猪到第21天或第22天都是血清反应阳性的（S/ P比率>0. 4)(下表12)。
[0340] 表12 :在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗或对照疫苗之后的血清几何平均PRRSV 滴度（IDEXX Elisa)[平均滴度（阳性动物*/全部动物）]
[0342] 所述数据支持以下结论：减毒P129-PKC12-FL病毒在第57代当以单一 2mL頂剂 量向由血清反应阴性的大母猪所生的猪崽投与时是安全的，观察时所述猪崽是一日龄但在 21或22日龄断奶。
[0343] 在攻击之前，将模拟接种的和P129-PKC12-FL病毒接种的猪崽重新圈养在房间内 的猪圈中（每个猪圈2只来自同一疫苗接种组的猪崽），以使得每个房间包含来自每个疫 苗接种组的12个猪圈。在接种疫苗后7、18或26周，用毒性异源PRRS分离株NADC20进行 攻击。攻击剂量等于4. 0mL(l. OmL/鼻孔加上2. OmL肌内注射）2. 271og1QTCID5Q/mL NADC20 储备溶液（2. 871og1QTCID5Q/4mL剂量）。NADC-20是一种毒性很强的基因型2PRRS病毒，由 美国农业部国家动物疾病中心（National Animal Disease Center, USDA)(爱荷华州艾姆 斯（Ames, Iowa))的凯莉?拉格尔（Kelly Lager)医生提供。NADC-20 0RF5氨基酸序列与 卩129-卩1((：12-卩1^94.5%-致。
[0344] 确定疾病预防的主要变量是具有病灶的肺的百分比。在尸体剖检时（攻击后第10 天）对肺部病灶进行评分，以使得以所观察到的具有病灶的叶的百分比形式评分并记录每 个叶（左颅、左中、左尾、右颅、右中、右尾以及附件）的固结百分比。
[0345] 在接种疫苗后7周，模拟接种的猪中具有病灶的肺的百分比明显大于 P129-PKC12-FL 病毒接种猪崽（P 彡 0· 0001)(表 13)。
[0346] 表13 :在先前在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗或模拟疫苗的7周龄猪崽的 PRRSV NADC20攻击之后具有病灶的肺的逆转换最小二乘均值百分比
[0348] 在接种疫苗后18周，模拟接种的猪崽中具有病灶的肺的百分比明显大于 P129-PKC12-FL 病毒接种猪崽（P 彡 0· 0001)(表 14)。
[0349] 表14 :在先前在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗或对照疫苗的18周龄猪崽的 PRRSV NADC20攻击之后具有病灶的肺的逆转换最小二乘均值百分比
[0351] 在接种疫苗后26周，模拟接种的猪中具有病灶的肺的百分比明显大于 P129-PKC12-FL 病毒接种猪崽（P 彡 0· 0001)(表 15)。
[0352] 表15 :在先前在一日龄接种经修饰活PRRSV疫苗或对照疫苗的26周龄猪崽的 PRRSV NADC20攻击之后具有病灶的肺的逆转换最小二乘均值百分比
[0354] 结果表明，减毒疫苗病毒P129-PKC12-FL在1日龄猪崽中是安全的，并且能够诱导 强力免疫反应，具有超常的免疫持续时间。单一剂量保护1日龄猪崽不被毒性异源PRRS攻 击持续至少26周。
[0355] 1日龄猪崽中的安全性和26周PRRS免疫持续时间这些特性适用于多价组合猪疫 苗，例如二价PRRSV/猪肺炎支原体（Ehyo)疫苗、二价PRRSV/2型猪圆环病毒（PCV2)疫苗 以及三价PRRSV/M. hyo/PCV2疫苗，以及适用于单价PRRSV疫苗。
[0356] 实例 10.
[0357] 由P129-PKC12-FL病毒组成的痔苗提供保护件免痔的早发。
[0358] 现有经修饰活PRRS疫苗建议在暴露于毒性PRRS病毒株之前接种至少3到4周。 这个时间间隔被认为是为了建立保护性免疫所必需的。在此所述的研究证明了在接种 P129-PKC12-FL病毒疫苗和两种其它市售PRRS疫苗之后仅14天传递的抗毒性异源PRRS病 毒攻击的显著保护作用。
[0359] 在接种疫苗阶段期间，18只猪（在3周龄）的处理组圈养在四个单独的房间的猪 圈中，每个猪圈6只动物。根据制造商的说明书，在约3周龄（第0天）时，向猪（猪崽） 投与模拟疫苗（2mL)、减毒P129-PKC12-FL第57代病毒疫苗（3. 621og1QTCID5Q/2mL剂量）、 Ingelvac PRRS MLV疫苗或Ingelvac PRRS ATP疫苗的单一肌内注射。
[0360] 在攻击之前，所有其余动物重新圈养在猪圈中，每个猪圈3只动物，每个占用猪 圈之间有一个空猪圈，以使得来自每个处理组的多个猪圈的动物被圈养在四个房间中的 每一个中。在约5周龄（第14天），用毒性异源PRRS分离株NADC20进行攻击。攻击 剂量等于4. 0mL(l. OmL/鼻孔加上2. OmL肌内注射）2. 071og1QTCID5Q/mLNADC20储备溶液 (2. 671og1QTCID5Q/4 mL 剂量）。
[0361] 确定疾病减少的主要变量是接种组相对于模拟疫苗组的肺部病变百分比。当与模 拟接种组相比时，发现了所有接种组（P129-PKC12-FL，P = 0· 0177 ;Ingelvac PRRS ATP，P =0· 0255 ;Ingelvac PRRS MLV，P = 0· 0137)之间的显著差异。当接种组相互比较时，未发 现显著差异（表16)。
[0362] 表16 :在先前接种经修饰活PRRSV疫苗或模拟疫苗的五周龄猪的PRRSVNADC20攻 击之后具有病灶的肺的百分比.
[0364] 这些结果证明，在接种疫苗后14天诱导部分免疫和疾病减少可能是经修饰活 PRRS病毒疫苗的一般特性。这种特性可能由猪（猪崽）中早期获得的免疫性（例如特异性 抗体和细胞毒性T细胞）、先天性免疫（例如诱导干扰素和自然杀伤细胞）和/或疫苗病毒 与攻击病毒之间关于有限数量的受纳宿主细胞（例如肺泡巨噬细胞）的竞争的组合引起。 无论机制如何，可以采用这种特性来保护猪远离与天然或故意PRRS感染（例如使即将到来 的后备小母猪故意暴露于毒性PRRS的地方性农场病毒株）相关的疾病。
[0365] 因此，如上文所提到，PRRS免疫性的早发这种特性适用于多价组合猪疫苗，例如二 价PRRSV/猪肺炎支原体（Ehyo)疫苗、二价PRRSV/2型猪圆环病毒（PCV2)疫苗以及三价 PRRSV/M.hyo/PCV2疫苗，以及适用于单价PRRSV疫苗。关于适用于本发明实践（即，用于 早在猪崽1日龄时提供早期并且安全的疫苗接种，任选地在此后两周的免疫性发作）的所 述疫苗的组分，参考如在尼斯特尔（Niztel)等人于2012年4月4日提交的名称为"PCV/ 猪肺炎支原体/PRRSZ 组合疫苗（PCV/Mycoplasma hyopneumoniae/PRRSZ Combination Vaccine) "的美国临时申请61/620189中所述的所有组合疫苗组分，所述申请的完全和完 整揭示内容如以其全文阐述一般以引用的方式并入本文中。
[0366] 关于可以用于本发明实践中（即，用于早在猪崽1日龄时提供早期并且安全的疫 苗接种，任选地在此后两周的免疫性发作）的特异性PRRS疫苗（或PRRS疫苗病毒株），请 注意默托（Murtaugh)等人，疫苗（Vaccine)，第29卷，第8192页-第8204页，（2011)的 表1，参见其第8196页，其中鉴别了许多所述病毒/疫苗，包括（但不限于）Ingelvac PRRS MLV、Ingelvac PRRS ATP以及Suvaxyn PRRS (来源于爱荷华州病毒株ISU-55)。应注意，提 供以上所提到的性能特征的疫苗预计还提供约6个月的免疫期持续时间。
[0367] 牛物材料的保藏
[0368] 以下生物材料（也参见美国专利第6, 500, 662号）于1998年11月19日保 藏于美国典型培养物保藏中心（ATCC) 10801大学大道（University Blvd.)，马纳萨斯 (Manassas),弗吉尼亚（Virginia) ,20110-2209, USA，并且按以下寄存编号分配。
[0369] 质粒 pT7P129A，寄存编号 203488
[0370] 质粒 pCMV-S-P129,寄存编号 203489
[0371] 以下美国专利的全文和披露内容如同全面阐述一般以引用的方式并入本文中： U. S. 6, 500, 662 和 U. S 7, 618, 797。
【主权项】
1. 一种用于保护猪科动物不被PRRS病毒感染的疫苗，所述疫苗包含（a)北美PRRS病 毒，它由多核苷酸分子SEQ ID N0:6或在非常严格的条件下与其杂交的任一多核苷酸编码， 在65°C下在0. 5M NaHP04、7%SDS、lmM EDTA中与过滤器结合的DNA杂交，并且在68°C下在 0.1 X SSC/0. 1% SDS中洗涤；(b)所述编码多核苷酸分子；(c)呈质粒形式的所述多核苷酸 分子；或（d)病毒载体，它包含所述多核苷酸分子，其中所述PRRS病毒能够以可有效产生对 抗感染的免疫保护的量引发不被PRRS病毒感染的有效免疫保护反应；和适用于兽用的载 剂，并且其中所述疫苗早在猪崽1日龄时就提供了早期并且安全的疫苗接种，并且其中所 述疫苗提供长达6个月的免疫持续时间。2. 根据权利要求1所述的疫苗，其中免疫的发生是在接种疫苗之后两周开始提供。3. -种用于给猪科动物接种疫苗以不被PRRS病毒感染的方法，包含在出生之后约12 小时与2周龄之间投与所述疫苗，其中所述疫苗包含 (a) 包含编码感染性RNA分子的DNA序列的经分离多核苷酸分子，所述感染性RNA分子 编码北美PRRS病毒， (b) 编码北美PRRS病毒的感染性RNA分子； (c) 呈质粒形式的所述多核苷酸分子（a)，或 (d) 包含感染性序列的病毒载体。4. 根据权利要求3所述的方法，其中保护性免疫在接种疫苗之后不迟于约14天出现。5. 根据权利要求4所述的方法，其中保护性免疫在生命第1天接种疫苗之后在第15 天、在生命第7天接种疫苗之后在第21天或在生命第14天接种疫苗之后在不迟于约第28 天出现。6. 根据权利要求3所述的方法，其中所提供的保护性免疫的持续时间长达6个月。
【专利摘要】本发明提供包含编码感染性RNA序列的DNA序列的经分离多核苷酸分子，所述感染性RNA序列编码遗传修饰北美PRRS病毒；所述病毒和相关多肽、多核苷酸以及各种组分的制造方法。还提供了包含所述遗传修饰病毒和多核苷酸的疫苗以及一种用于区分自然感染的动物与接种疫苗的动物的诊断试剂盒。ATCC 20348819981119
【IPC分类】A61K39/12, A61P31/14
【公开号】CN105688201
【申请号】CN201610064519
【发明人】J.G.卡尔弗特, R.G.安肯鲍尔, J.G.马克思, D.S.皮尔斯, M.L.基思
【申请人】佐蒂斯有限责任公司
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2013年5月15日
【公告号】CA2872789A1, CN104302316A, US20130309263, WO2013173443A1