S (SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A ;
[0197] 在氨基酸序列AGEIVGV(SEQ ID NO:42)内的氨基酸I ;
[0198] 在氨基酸序列ADF^PEK(SEQ ID N0:45)内的氨基酸N ;以及
[0199] 在氨基酸序列QTPILGR(SEQ ID NO:48)内的氨基酸I。
[0200] 更具体来说，本发明提供一种经分离猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS)，其中其由 ORFla编码的蛋白质选自由含有以下中的任一者的那些氨基酸序列组成的群组：
[0201] 在氨基酸序列AP(参见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N ;
[0202] 在氨基酸序列HM(参见SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N ;
[0203] 在氨基酸序列P2G(参见SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ;
[0204] 在氨基酸序列WIL(参见SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y ;
[0205] 在氨基酸序列VHG(参见SEQ ID NO: 21)内的氨基酸H ;
[0206] 在氨基酸序列KYD (参见SEQ ID NO: 24)内的氨基酸V ;
[0207] 在氨基酸序列AID(参见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T ;
[0208] 在氨基酸序列SLL(参见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L ;
[0209] 在氨基酸序列M￡Q(参见SEQ ID NO:33)内的氨基酸C ;
[0210] 在氨基酸序列PIG(参见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T ;
[0211] 在氨基酸序列VAK(参见SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A ;
[0212] 在氨基酸序列EIV(参见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I ;
[0213] 在氨基酸序列FNP (参见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N ;以及
[0214] 在氨基酸序列PIL(参见SEQ ID NO:48)内的氨基酸I。
[0215] 如上文所提到，存在北美和中国PRRS的许多已知病毒株和分离株，并且新颖病毒 株继续进化或分离。虽然在所有这些病毒株之间存在高水平的氨基酸序列同源性，但是本 领域的普通技术人员将立即认识到，的确存在一些变异，并且实际上可以采用这些差异和 相似性的优点以进一步改良所有疫苗病毒株的表现型特性。
[0216] 首先，关于通过刚刚（在第19页-第20页）在上文指定的SEQ ID NO定义的所有 氨基酸基元，带下划线的并且优选的氨基酸（如从P129第52代提供）一般保持完全有益 的，即使相邻氨基酸已经以其它方式从指定SEQ ID NO序列改变。因此，关于AMAMVYD (SEQ ID NO: 9)，作为一个特定并且代表性实例，检查来自任何北美或中国PRRS的对应ORFl表 达的蛋白质序列，从而发现对应氨基酸基元一般来说是可能的，即使在所述其它病毒株中 由于进化而发生了其它改变，引起取代和/或缺失或添加。如本领域的技术人员将了解， 通过P129第52代证明的优选氨基酸改变因此也应该保持可操作的，尽管在第52代的正 好5'或3'到指定氨基酸的整体氨基酸序列中有其它改变。如果在对比氨基酸改变被认 为是保守的时尤其将如此。因此关于AMAMVYD(SEQ ID N0:9)和其子序列ANV，如果例如 其中的缬氨酸被异亮氨酸或亮氨酸或任何其它残基替换，或如果简单地缺失残基或添加附 加残基，那么应该可能易于鉴别另一种PRRS病毒株中的类似基元。存在用于鉴别比对的 许多计算机程序并且由此确定多肽序列基元是否对应于例如所谓的Blosum表（基于指定 的一致性百分比水平），参见S.赫尼霍夫等人"来自蛋白序列块的氨基酸取代矩阵（Amino Acid Substitution matrices from protein blocks)"，美国国家科学院院刊，89 (22)，第 10915页-第10919页，1992年11月15日，并且还参见A. L.勒宁格尔（A. L. Lehninger) 等人生物化学原理（Principles of Biochemistry) ,2005，麦克米伦公司（MacMillan and Company),第4版。保守氨基酸改变也基于分成以下总共5组来识别：疏基（Cys);芳香族 (卩116、15^和1'印）；碱性（1^、厶找、把8);脂肪族（\%1、11611、1^11、]^1:)以及亲水性（八1&、 Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser以及Thr)。因此，在适当的并且对应的位置并入关于P129 第52代所指定的氨基酸改变中的任一者来修饰编码任何北美或中国PRRS的核苷酸序列是 在本发明的实践内，即使与所指定位置相邻的其它氨基酸中的一或多者已经被添加、缺失 或取代。
[0217] 另外，基于类似原理，本领域的普通技术人员将认识到，一旦根据本发明实践从关 于ORFla所鉴别的特定第52代改变鉴别出优选的氨基酸，那么也可以将任何所述第52代 氨基酸之保守替换用于P129变异体中或关于任何其它北美或中国病毒株，伴随对预期第 52代表现型的实质性保护。因此，作为代表性实例：关于SLL(在SEQ IDN0:30内），指定亮 氨酸残基可以进一步用异亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸替换；关于FMP(在SEQ ID N0:45内）， 指定天冬酰胺可以用Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Ser以及Thr中的任一者替换；以及关于 VAK(参见 SEQ ID N0:39)，指定丙氨酸可以用 Asn、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Ser 以及 Thr 中 的任一者替换等等，但是将容易认识到，任何所述替换氨基酸与最初鉴别的在指定位置的 独特第52代氨基酸改变一样好地起作用不是本发明的要求。当然，在本发明中也实践了根 据任何其它公认模型的标准保守氨基酸改变的使用。举例来说并且在所有情况下都包括反 之亦然，Asp用于Glu并且反之亦然，Asn用于Gln，Arg用于Lys，Ser用于Cys或Thr，Phe 用于Tyr，Val用于Leu或Ileu，Ala用于Gly等等。
[0218] 此外，在本发明的实践内，虽然单独的第52代氨基酸改变（如以上关于ORFla所 鉴别）中的任一者可以有用地放在具有所希望的表现型作用的任何北美或中国PRRS中，但 是进一步优选的是在最终构造体中包括尽可能多的表9或表10氨基酸选择，所述最终构造 体通常如通过编码多核苷酸序列的适当修饰来提供。因此，本发明的实践包括提供中国或 北美PRRS病毒（和对应编码多核苷酸），这些病毒提供约17种所鉴别的第52代ORFla改 变（表9)中的2、3、4、5、6、7、8、9种并且多达其中的任何种（所有都在最终病毒序列内）， 从而包括所有总体鉴别的第52代氨基酸改变的任何特定配对、三联体或其它更高组合。当 然，所述氨基酸改变可以通过定点诱变、PCR以及在本领域中众所周知的其它技术被引入到 病毒的对应编码核苷酸序列中。
[0219] 为了证明特定遗传修饰病毒株被减毒，可以使用如下所述的实验。
[0220] 在每一个试验中包括每组至少10只小母猪，它们来源于不含PRRSV的农场。这些 动物经测试不含PRRS病毒特异性血清抗体并且是PRRSV阴性的。试验中所包括的所有动 物具有相同的来源和品种。将动物随机分成数组。
[0221] 在怀孕第90天以每鼻孔IO5 TCID5。鼻内施加 Iml PRRSV进行攻击。每一个测试 设置存在至少三组：一组关于P129攻击；一个测试组关于用可能减毒的病毒攻击；以及一 个严格对照组。
[0222] 当严格对照组在研究的时间过程内保持PRRSV阴性并且在P129攻击组中出生相 比于严格对照组少至少25%的健康活猪崽时，认为所述研究是有效的。
[0223] 减毒（换句话说毒性更小）定义为决定繁殖性能或其它症候学的一或多个参数的 统计显著改变：
[0224] 相比于未修饰亲本病毒株感染组，测试组（可能减毒的病毒）的以下参数中的至 少一者的显著降低将是一种减毒指示：
[0225] a)死产频率
[0226] b)在怀孕第112天或在这之前流产
[0227] c)木乃伊化猪崽的数量
[0228] d)较不活跃并且虚弱的猪崽的数量
[0229] e)断奶前死亡率
[0230] 此外，相比于未修饰亲本病毒株感染组，测试组的以下参数之一显著增加是优选 的：
[0231] f)每只大母猪的断奶猪崽的数量
[0232] g)每只大母猪生出的健康活猪崽的数量
[0233] 在替代方案中，可以检查PRRSV感染的呼吸道症状和其它症状以建立减毒。
[0234] 减毒病毒株对于配制疫苗来说是有价值的。如果本发明疫苗保护猪不被PRRS病 毒感染，那么它是有效的。如果在向一或多只未感染的猪投与疫苗之后，生物学上纯的病毒 分离株（例如，VR 2385、VR 2386、P129等）的随后攻击引起疾病的任何总体或组织病理学 改变（例如，肺部病灶）和/或症状的严重程度相比于无保护的类似猪（即，相对于适当的 对照组）中通常由分离株引起的那些改变或症状有所减弱，那么所述疫苗保护猪不被PRRS 病毒感染。更具体地说，通过向对其有需要的一或多只合适的猪投与疫苗，然后在适当的时 间长度（例如，4周）之后，用生物学上纯的PRRSV分离株的大样品（10 (37)TCID_)攻击， 可以显示出本发明疫苗是有效的。然后在约一周之后从被攻击的猪抽取血液样品，并且然 后试图从所述血液样品中分离出病毒。大量病毒的分离说明所述疫苗可能不是有效的，而 有所降低的量的病毒（或无病毒）的分离说明所述疫苗可以是有效的。
[0235] 因此，可以在数量上（即，固结的肺组织的百分比相比于适当的对照组有所减小） 或质量上（例如，从血液分离PRRSV，通过免疫分析检测肺、扁桃体或淋巴结组织样品中的 PRRSV抗原）评估本发明疫苗的有效性。可以在数量上（例如，温度/热度）或半数量上 (例如，一或多种症状的存在或不存在或一或多种症状的严重程度的降低，所述症状例如发 绀、肺炎、肺部病灶等）评估猪繁殖与呼吸疾病的症状。
[0236] 未感染猪是尚未暴露于猪繁殖与呼吸疾病感染剂，或已经暴露于猪繁殖与呼吸疾 病感染剂但是未显示出所述疾病的症状的猪。被感染的猪是显示出PRRS症状或可以从中 分离出PRRSV的猪。
[0237] 本发明疫苗可以遵循公认惯例来配制，包括用于动物，包括人类（如果适用）的 可接受载剂，例如标准缓冲液、稳定剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂；并且也可以经配置以 促进持续释放。稀释剂包括水、生理食盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。用于等张性的添加剂 尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇以及乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白。其它合 适的疫苗媒剂和添加剂，包括尤其适用于配制经修饰活疫苗的那些，为本领域的普通技术 人员所知晓或将是清楚的。参见例如雷明顿的药物科学（Remington's Pharmaceutical Science),第18版，1990，马克出版（Mack Publishing)，它以引用的方式并入本文中。
[0238] 本发明疫苗可以进一步包含一或多种附加免疫调节组分，尤其例如佐剂或细胞因 子。可以用于本发明疫苗中的佐剂的非限制性实例包括RIBI佐剂系统（蒙大拿州汉密尔 顿的瑞比公司（Ribi Inc. ,Hamilton, Mont.))、明研；、矿物凝胶（例如氢氧化错凝胶）、水 包油型乳液、油包水型乳液（例如弗氏（Freund's)完全和不完全佐剂）、嵌段共聚物（佐 治亚州亚特兰大（Atlanta, Ga.)的CytRx)、QS-21 (马萨诸塞州剑桥的剑桥生物技术公司 (Cambridge Biotech Inc. ,Cambridge Mass. ))、SAF_M(加利福尼亚州愛莫利维尔的凯龙 公司（Chiron, Emeryville Calif. ))、AMPHIGEN.RTM.佐剂、皂苷、植物皂苷（Quil A)或其 它皂苷部分、单磷酰基脂质A以及阿夫立定（Avridine)脂质-胺佐剂。适用于本发明疫苗 的水包油型乳液的非限制性实例包括经修饰SEAM62和SEAM 1/2配制品。经修饰SEAM62 是一种水包油型乳液，它含有5% (v/v)角鲨烯（西格玛（Sigma))、l% (v/v)SPAN.RTM.85 清洁剂（ICI表面活性剂）、0. 7 % (v/v) TWEEN. RTM. 80清洁剂（ICI表面活性剂）、2. 5 % (v/ v)乙醇、200 pg/ml植物阜苷、100 [mgr] g/ml胆固醇以及0.5% (v/v)卵磷脂。经修饰SEAM 1/2是一种水包油型乳液，它包含5% (v/v)角鲨烯、1 % (v/v) SPAN. RTM. 85清洁剂、0.7% (v/v)吐温80清洁剂、2. 5% (v/v)乙醇、100μg/ml植物阜苷以及50μg/ml胆固醇。可以 包括在疫苗中的其它免疫调节剂包括例如一或多种介白素、干扰素或其它已知细胞因子。
[0239] 本发明疫苗可以任选地经配制用于持续释放本发明的病毒、感染性RNA分子、质 粒或病毒载体。所述持续释放配制品的实例包括与生物相容性聚合物的复合物组合的 病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体，所述生物相容性聚合物例如聚（乳酸）、聚（乳 酸-共-乙醇酸）、甲基纤维素、透明质酸、胶原蛋白等。药物传递媒剂中可降解聚合物 的结构、选择和使用已经在若干出版物中有所综述，这些出版物包括A.多姆（A. Domb)等 人，1992，先进技术聚合物（Polymers for Advanced Technologies)3:279_292,它以引用 的方式并入本文中。关于药物配制品中聚合物的选择和使用的附加指导可见于本领域中已 知的文本中，例如Μ.蔡辛（M. Chasin)和R.兰格（R. Langer)(编），1990，"作为药物传递 系统的生物可降解聚合物（Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems) "药物与 制药科学（Drugs and the Pharmaceutical Sciences),第 45 卷，Μ·德克（M.Dekker),纽 约州，它也以引用的方式并入本文中。可替代地或另外，可以对病毒、质粒或病毒载体进行 微封装以改良投药和功效。用于对抗原进行微封装的方法在本领域中是众所周知的，并且 包括在以下各者中所述的技术，例如美国专利第3, 137, 631号；美国专利第3, 959, 457号； 美国专利第4, 205, 060号；美国专利第4, 606, 940号；美国专利第4, 744, 933号；美国专利 第5, 132, 117 ;以及国际专利公开WO 95/28227,所有这些都以引用的方式并入本文中。
[0240] 还可以使用脂质体来提供病毒、质粒或病毒载体的持续释放。关于如何制造并使 用脂质体配制品的细节尤其可见于美国专利第4, 016, 100号；美国专利第4, 452, 747号； 美国专利第4, 921，706号；美国专利第4, 927, 637号；美国专利第4, 944, 948号；美国专利 第5, 008, 050 ;以及美国专利第5, 009, 956中，所有这些都以引用的方式并入本文中。
[0241] 上述疫苗中的任一者的有效量可以通过常规手段确定，以低剂量的病毒、病毒蛋 白质粒或病毒载体开始，并且然后增加剂量同时监测作用。可以在单次投与疫苗之后或在 多次投与疫苗之后获得有效量。当确定每种动物的最佳剂量时，可以考虑已知因素。这些因 素包括所述动物的物种、大小、年龄以及一般情况、所述动物中其它药物的存在情况等等。 优选地在考虑了来自其它动物研究（参见例如以下实例2和3)的结果之后选择实际剂量。
[0242] 是否已经实现了足够的免疫反应的一种检测方法是测定在接种疫苗之后动物中 的血清转化和抗体滴度。接种疫苗的时间安排和辅助剂（如果存在的话）的数量优选地将 基于所有相关因素的分析由医生或兽医确定，所述因素中的一些在上文已有描述。
[0243] 本发明的病毒、蛋白质、感染性DNA分子、质粒或病毒载体的有效剂量可以使用已 知技术，考虑可以由本领域的技术人员确定的因素（例如待接种疫苗的动物的体重）来确 定。本发明疫苗中本发明病毒的剂量优选地介于约IO 1到约10 9Pfu (空斑形成单位），更优 选地约IO2到约10spfu，并且最优选地约IO 3到约IO7Pfu的范围内。本发明疫苗中本发明质 粒的剂量优选地介于约〇. Img到约100mg，更优选地约Img到约10mg，甚至更优选地约IOmg 到约Img的范围内。本发明疫苗中本发明感染性DNA分子的剂量优选地介于约0.1 mg到约 l〇〇mg，更优选地约Img到约10mg，甚至更优选地约IOmg到约Img的范围内。本发明疫苗中 本发明病毒载体的剂量优选地介于约IO 1Pfu到约109pfu，更优选地约102pfu到约10spfu， 并且甚至更优选地约IO 3到约10 7pfu的范围内。合适的剂量大小介于约0. 5ml到约10ml， 并且更优选地约Iml到约5ml的范围内。
[0244] 根据本发明的实践，病毒蛋白或肽疫苗的合适剂量的范围一般是1到50微克/剂 量或更高的量，如可以通过标准方法确定，其中关于每种所述物质的佐剂的量通过公认方 法确定。在关于猪的疫苗接种的一个本发明优选实例中，动物的最佳年龄目标是在约1与 21天之间，在断奶之前，还可以与安排的其它疫苗接种一致，例如抗猪肺炎支原体或PCV。 另外，育种大母猪的疫苗接种的优选安排将包括类似剂量与每年再接种安排。
[0245] 上述疫苗中的任一者的有效量可以通过常规手段确定，以低剂量的病毒、质粒或 病毒载体开始，并且然后增加剂量同时监测作用。可以在单次投与疫苗之后或在多次投与 疫苗之后获得有效量。当确定每种动物的最佳剂量时，可以考虑已知因素。这些因素包括 所述动物的物种、大小、年龄以及一般情况、所述动物中其它药物的存在情况等等。优选地 在考虑了来自其它动物研究的结果之后选择实际剂量。
[0246] 是否已经实现了足够的免疫反应的一种检测方法是测定在接种疫苗之后动物中 的血清转化和抗体滴度。接种疫苗的时间安排和辅助剂（如果存在的话）的数量优选地将 基于所有相关因素的分析由医生或兽医确定，所述因素中的一些在上文已有描述。
[0247] 本发明的病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体的有效剂量可以使用已知技术， 考虑可以由本领域的技术人员确定的因素（例如待接种疫苗的动物的体重）来确定。举例 来说，可以经口、非经肠、皮内、皮下、肌内、鼻内或静脉内传递疫苗。经口传递可以涵盖例如 向动物的饲料或饮料中添加组合物。与疫苗剂量有关的因素包括例如猪的体重和年龄。
[0248] 本发明进一步提供一种制备包含本文中所述的PRRS病毒、感染性RNA分子、质粒 或病毒载体的疫苗的方法，所述方法包含将有效量的本发明的PRRS病毒、感染性RNA分子、 质粒或病毒载体中的一种与药用或兽用可接受的载剂组合。
[0249] 另外，如美国专利第6, 500, 662号中所述，可以对本发明的活减毒疫苗进行修饰 以编码使用已知的重组技术插入到PRRS病毒基因组中的异源抗原表位。还参见美国专 利7, 132, 106,它以全文引用的方式并入本文中。适用作本发明异源抗原表位的抗原表位 包括来自除PRRS病毒以外的猪病原体的抗原表位，包括（但不限于）来自选自由以下组 成的群组的猪病原体的抗原表位：猪细小病毒、猪圆环病毒、猪轮状病毒、猪流感病毒、假 狂犬病毒、传染性胃肠炎病毒、猪呼吸道冠状病毒、古典猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、脑心肌炎 病毒、猪副粘病毒、细环病毒、胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae)、 猪放线杆菌（Actinobacillus suis)、炭疽杆菌（Bacillus anthraci)、支气管炎博德特 菌（Bordetella bronchiseptica)、溶血梭状芽胞杆菌（Clostridium haemolyticum)、 产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens)、破伤风梭菌（Clostridium tetani)、大肠 杆菌（Escherichia coli)、