专利名称：从植物中分离提取和纯化奇壬醇的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从植物中分离提取和纯化化合物奇壬醇(kirenol)的方法，特别是从药用植物豨莶革中分离提取和纯化奇壬醇的方法，本发明还涉及奇壬醇的应用，特别是在抗类风湿性关节炎、镇痛等药物中应用。
根据“中华人民共和国药典”(中华人民共和国卫生部药典委员会编，化学工业出版社，1995年版一部P325)记载，豨莶草为菊科植物东方豨莶、腺梗豨莶或毛梗豨莶的干燥地上部分。性味辛、苦、寒、归肝、肾经。主要功能与主治为祛风湿、利关节、解毒。用于风湿痹痛、筋骨无力、腰膝酸软、四只麻痹、半身不遂、风疹湿疮。
类风湿性关节炎(UA)是一种不明原因的慢性全身性免疫反应性炎症性疾病，免疫反应多发生于关节滑膜，为最常见的结缔组织疾病。
目前类风湿性关节炎的药物治疗方法主要是1.消炎镇痛类①乙酰水杨酸 有消炎镇痛作用，对关节蒸装有明显效果。
②消炎痛 作用较阿司匹林强，但消化道溃疡及肝肾功能不全者忌用。
③保泰松 1周内可显效，但可引起粒细胞和血小板减少。
④氯灭酸 该药抗炎作用强，副作用小，偶尔有头痛、头晕。
2.糖皮质激素 因激素副作用大，停用后易复发，故一般在其它要无效时才使用。
3.金制剂 硫代苹果酸金钠合金硫葡萄糖，深部肌肉注射，该药可诱发皮炎，如有肾功能损害应慎用。
4.免疫抑制剂 如果用上述药物不理想，可加用免疫抑制剂。如环磷酰胺。
5.氯喹 用药1-3个月可显效，应用时应注意视网膜病。
目前主要使用的西药皆有不同程度的毒副作用或其它副作用，本发明克服了现有技术中直接使用中药治疗疾病的不方便之处，提供从传统中药中获得药效成分奇壬醇的方法，并以奇壬醇作为先导化合物，为抗类风湿性关节炎、镇痛、抗菌、抗疟、降压、舒张血管等疾病的治疗，提供毒性低、药效明显之良药。
2.用溶媒回流提取或浸泡渗漉提取步骤1中得到的滤渣。溶媒可以是30-95％乙醇水溶液、氯仿、二氯甲烷、己酸己酯、丙酮、甲醇或含有丙酮40-80％的水液；溶媒的加入量按照步骤1中加入的原料加入量计算，每次加入溶媒的体积升数∶最初加入干品重量公斤数＝6-12∶1，或溶媒的体积升数∶新鲜药材重量公斤数＝4-8∶1；回流提取的方法是向滤渣中按比例加入溶媒，反复回流提取2-5次，每次回流时间为1-4小时；浸泡渗漉的方法是直接用上述溶媒、按上述比例在常温下对滤渣进行1-4次渗漉提取，每次渗漉4-6天，将得到的提取液过滤，收集滤液；在低于80℃温度下，对滤液进行减压浓缩，除去溶媒，得比重为1.1-1.4的浸膏状提取物A。
3.对步骤2中得到的提取物A，先加入水混悬溶解，提取物A的重量公斤数∶水的体积升数＝1∶3-6，然后以溶媒I萃取1-4次，溶媒I是石油醚或包括己烷、环己烷、正己烷在内的C6-C7烷烃，每次水相与溶媒相的体积比＝1∶0.2-2，分离出溶媒层，水层再用溶媒II萃取1-4次，溶媒II是乙酸乙酯或包括二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氯化碳在内的卤化烃或包括乙醚在内的醚或包括乙酸丁酯、乙酸戊酯在内的有机酸酯类或C3-C5的脂肪醇，每次水相与溶媒相的体积比例为1∶0.2-3；合并各次萃取后的溶媒II液，得溶媒液B，其中主含奇壬醇。
4.对步骤3中收集到的溶媒液B，在低于80℃条件下进行减压浓缩，得到提取固体浓缩物B1。
5.对步骤4中得到的提取固体浓缩物B1，用色谱法进行一次或多次同种或不同种的层析法纯化，或对层析法的产品再进行重结晶纯化，就得到奇壬醇纯品。色谱法层析纯化的具体步骤为取层析柱，用填料装柱，用洗脱液洗脱，收集含奇壬醇的部位，得到本发明所说的纯化有效化合物奇壬醇；对于色谱法中使用的不同填料，采取不同的条件，具体为1)硅胶层析柱取常压玻璃层析柱，以60-400目硅胶为填料，提取固体浓缩物B1与硅胶重量份数比在1∶10-1∶300之间，以体积比在1∶0.5-1∶5之间的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱液，或用体积比在1∶0.5-1∶5之间的石油醚和丙酮的混合溶剂为洗脱液，将收集到的含奇壬醇的洗脱液，再在低于50℃温度下减压浓缩成固体；2)D101大孔树脂层析柱取常压玻璃层析柱，以D101大孔树脂为填料，提取固体浓缩物B1与填料的重量份数比在1∶20-1∶200之间，用水洗脱至洗脱流出液无色，然后再依次用体积百分比为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，每次洗脱至洗脱流出液无色再增加梯度，收集60％-80％的洗脱流出液，其中主含奇壬醇，再在低于60℃温度下将洗脱流出液减压浓缩成固体；3)中性氧化铝层析柱取常压或真空玻璃层析柱，以60-300目中性氧化铝为填料，提取固体浓缩物B1与中性氧化铝的重量份数比在1∶20-1∶200之间，以体积比在1∶0.5-1∶5之间的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为梯度洗脱液，或以体积比在1∶0.5-5之间的石油醚和丙酮的混合溶剂为梯度洗脱液，即依次以2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的极性梯度增加，进行梯度洗脱，每一梯度洗脱至无样品检出，再增加至下一梯度，收集含奇壬醇的洗脱流出液，控制温度低于60℃，将洗脱流出液减压浓缩成固体；4)聚酰胺层析柱取常压玻璃层析柱，以60-300目聚酰胺为填料，提取浓缩物B1与聚酰胺的重量份数比在1∶20-1∶200之间，以体积比在1∶1-1∶10之间的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为梯度洗脱液即依次以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10为梯度洗脱液，或以体积比在1∶0.5-10之间的石油醚和丙酮的混合溶剂为梯度洗脱液即依次以2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10的混合液为梯度洗脱液，进行梯度洗脱，每一梯度洗脱至无样品检出，再增加至下一梯度，收集含奇壬醇的洗脱流出液，控制温度低于60℃，将洗脱流出液减压浓缩成固体；5)反相硅胶层析柱取常压柱或包括Lobar柱在内的制备型加压柱，以100-300目反相硅胶C-18或C-8为填料，提取固体浓缩物B1与反相硅胶C-18或C-8的重量份数比在1∶20-1∶200之间，以体积比在1∶9-4∶1之间的甲醇和水的混合溶剂为洗脱液，收集含奇壬醇的洗脱液，或以体积比在0∶1-1∶0之间的甲醇-水混合液为梯度洗脱液，即依次以0∶1、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶1、8∶2、9∶1、1∶0为梯度洗脱液，进行梯度洗脱，每一梯度洗脱至无样品检出，再增加至下一梯度，收集含奇壬醇的洗脱流出液；然后控制温度低于60℃、将收集到的洗脱流出液减压浓缩成固体；
所述的重结晶，就是将色谱法层析纯化后得到的固体，在分析纯级的有机溶媒乙酸乙酯或丙酮或包括乙醇在内的C1-C4醇或水中进行重结晶1-4次，得到奇壬醇结晶纯品。
依照上述方法分离提取到的奇壬醇，其纯度不低于95％。
奇壬醇的分子结构式为 根据上述方法和步骤得到的化合物奇壬醇，其在甲醇中的理化特征和性质为无色透明方晶，可溶解于己酸己酯、丙酮、氯仿、二氯甲烷、甲醇、正丁醇，部分溶解于水。分子组成为C20H34O4，mp.201℃～202℃，元素分析结果为C 71.012％；H 10.061％；红外波谱IR(KBr)max cm-13314，2914，1650，1450，1397，1059，1033，857；核磁共振碳谱13CNMR(C5D5N)ppm49.2(C-1)，63.8(C-2)，45.6(C-3)，40.9(C-4)，55.4(C-5)，22.6(C-6)，36.7(C-7)，138.0(C-8)，51.3(C-9)，39.7(C-10)，19.1(C-11)，32.7(C-12)，37.9(C-13)，129.7(C-14)，76.6(C-15)，63.8(C-16)，23.3(C-17)，28.2(C-18)，64.8(C-19)，16.9(C-20)；核磁共振氢谱 1HNMR(C5D5N)ppm5.50(1H，br，s，14-H)，4.14(1H，d，J＝11.8Hz，19-Ha)，3.64(1H，d，J＝11.8Hz，19-Hb)，δ4.01(1H，t，J＝11.7Hz，16-CH)，3.42(d，J＝11.7Hz，2H，H-17)，4.19(1H，m，1H)，2.85(1H，br，d)，1.26(3H，s，18-CH3)，1.15(3H，s，15-CH4)，0.81(3H，s，C20-CH3)；质谱EIMSm/z277[M-CH(OH)-CH2OH]+，259，241，151，121，109，81，43.FABMSm/z339(M+1)+。
对上述方法和步骤得到的奇任醇进行纯度检查，tR＝4.08min，215nm检测，纯度98.28％。
峰面积百分比峰号 保留时间 峰宽 峰高 峰面积百分比1 1.350 0.0530 187.32345 1.68372 4.057 0.1545 1364.72534 98.21383. 1.210 0.0324 152.34754 0.10243注2为溶剂残留峰，2为奇任醇峰硅胶TLC检测测定结果为点样量100μl，未见明显杂质斑。
展距9cm
显色剂10％硫酸液，加热110℃，5min.Rf值0.46本发明还提供奇壬醇在抗类风湿性关节炎药物中的应用。药物的剂型根据临床应用方式而定，可以是片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、喷雾剂、口服液、混悬剂、外用擦剂、透皮吸收制剂或注射剂。
本发明从植物、特别是从药用植物豨莶草中分离提取和纯化出奇壬醇，奇壬醇具有抗菌、抗炎作用，降压及舒张血的作用，免疫抑制作用，抗疟作用，抗生育作用等。以奇壬醇为有效成分制成的药品，对类风湿性关节炎具有明显作用。
实施例1通过下列方法和步骤分离提取和纯化奇壬醇1.取原料药材豨莶草腺梗豨莶的自然干燥地上部分1公斤，经粉碎，加入加热回流瓶中，再加石油醚8升，升温至回流，第一次回流时间为2小时；冷却，倒于布氏漏斗减压过滤去除回流液。在滤渣中再加入石油醚6升，重复上述回流1次，减压过滤去除回流液。
2.将步骤1中得到的滤渣在回流瓶中加95％乙醇6升，升温至回流2小时，冷却，减压过滤去回流液，滤渣再重复上述回流过程2次，合并滤液。滤液在旋转蒸发仪上控制温度45℃，经减压浓缩除去醇，得比重为1.3的浸膏状提取物A 120克。
3.将步骤2中得到的提取物A120克混悬溶解于360毫升水中，用石油醚100毫升于分液漏斗中萃取1次，接收水层，再重复上述萃取过程1次，接收水层，水层再用乙酸乙酯重复萃取3次，每次用100毫升乙酸乙酯，合并各次萃取后的乙酸乙酯提取液B，其中主含奇壬醇。
4.对步骤3中收集到的溶媒乙酸乙酯提取液B，在40℃温度下进行减压浓缩，得提取固体浓缩物B1约40克。
5.对步骤4中得到的提取浓缩物B140克，用10克100目硅胶拌样，凉干待用；在5×60cm玻璃柱中干法装200-300目硅胶400克，再将拌样硅胶装于柱内，上面再加2克硅胶，以体积比为1∶1的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂为洗脱液，收集含奇壬醇部位，于旋转蒸发仪上控制温度40℃，得到奇壬醇粗结晶约3.5克。将得到的奇壬醇粗结晶溶解在乙酸乙酯中，重结晶2次，得到奇壬醇结晶纯品约2克。
上述方法和步骤得到的奇壬醇纯度，用HPLC检测为98％。
实施例2通过下列方法和步骤分离提取和纯化奇壬醇1.取原料药材豨莶草腺梗豨莶的自然干燥地上部分1公斤，经粉碎，加入加热回流瓶中，再加环己烷8升，升温至回流，第一次回流时间为2小时；冷却，倒于布氏漏斗减压过滤去除回流液。在滤渣中再加入环己烷6升，重复上述回流1次，减压过滤去除回流液。
2.将步骤1中得到的滤渣在回流瓶中加溶媒丙酮6升，升温至回流2小时，冷却，减压过滤去回流液，滤渣再重复上述回流过程2次，合并滤液。滤液在旋转蒸发仪上控制温度40℃，经减压浓缩除去丙酮，得比重为1.6的浸膏状提取物A约100克。
3.将步骤2中得到的提取物A100克混悬溶解于300毫升水中，用环己烷100毫升于分液漏斗中萃取1次，接收水层，再重复上述萃取过程1次，接收水层，水层再用乙酸乙酯重复萃取3次，每次用100毫升乙酸乙酯，合并各次萃取后的乙酸乙酯液提取B，其中主含奇壬醇。
4.对步骤3中收集到的溶媒乙酸乙酯提取液B，在40℃温度下进行减压浓缩，得提取固体浓缩物B1约35克。
5.对步骤4中得到的提取浓缩物B1 35克，用10克100目硅胶拌样，凉干待用；在5×60cm玻璃柱中干法装200-300目硅胶350克，再将拌样硅胶装于柱内，上面再加2克硅胶，以体积比为2∶1的石油醚和丙酮混合溶剂为洗脱液，收集含奇壬醇部位，于旋转蒸发仪上控制温度40℃，得到奇壬醇粗结晶约3.5克。将得到的奇壬醇粗结晶溶解在无水丙酮中，重结晶2次，得到奇壬醇结晶纯品约2克。
上述方法和步骤得到的奇壬醇纯度，用HPLC检测为98％。
实施例3通过下列方法和步骤分离提取和纯化奇壬醇1.取原料药材豨莶草腺梗豨莶的自然干燥地上部分1公斤，经粉碎，加入加热回流瓶中，再加环己烷8升，升温至回流，第一次回流时间为2小时；冷却，倒于布氏漏斗减压过滤去除回流液。在滤渣中再加入环己烷6升，重复上述回流1次，减压过滤去除回流液。
2.将步骤1中得到的滤渣在回流瓶中加甲醇6升，升温至回流2小时，冷却，减压过滤去回流液，滤渣再重复上述回流过程2次，合并回流液。滤液在旋转蒸发仪上控制温度45℃，经减压浓缩除去甲醇，得比重为1.8的浸膏状提取物A约110克。
3.将步骤2中得到的提取物A约110克混悬溶解于350毫升水中，用环己烷100毫升于分液漏斗中萃取1次，接收水层，再重复上述萃取过程1次，接收水层，水层再用二氯甲烷重复萃取3次，每次用100毫升二氯甲烷，合并各次萃取后的二氯甲烷提取液B，其中主含奇壬醇。
4.对步骤3中收集到的二氯甲烷提取液B，在40℃温度下进行减压浓缩，得提取固体浓缩物B1约40克。
5.对步骤4中得到的固体提取浓缩物B1 40克，溶解于60毫升的20％(体积比)乙醇-水中，滤去不溶物，用以60-300目聚酰胺为填料，在30×200厘米的玻璃层析柱上，加入经预处理后的D101聚酰胺1000克，以水饱和之界面，加入B1的60毫升的20％乙醇-水，静置3小时后，用水洗脱至无色；再分别用10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％(体积比)的乙醇-水梯度极性洗脱，每极性度的洗脱量视洗脱液至无色后再增加极性梯度，收集含奇壬醇的洗脱液，然后控制温度在45℃，对收集到的洗脱液进行减压浓缩成固体B2；对得到的浓缩固体物B2 5克，用10克100目硅胶拌样，凉干待用；在5×60cm玻璃柱中干法装200-300目硅胶250克，再将拌样硅胶装于柱内，上再加2克硅胶，以体积比为2∶1的溶媒石油醚和丙酮混合溶剂为洗脱液，收集含奇壬醇部位，于旋转蒸发仪上控制温度40℃，得到奇壬醇粗结晶约3.0克。将奇壬醇粗结晶溶解于10毫升无水乙醇中，于冰箱中低温静置，进行重结晶1-4次，得到奇壬醇结晶纯品约2克。
上述方法和步骤得到的奇壬醇纯度，用HPLC检测为98％。
实施例4本实施例为应用实施例。
用实施例1中得到的奇壬醇纯品，进行抗风湿性关节炎和镇痛的药效研究，试验方法和结果如下材料和方法1.药品与试剂福氏完全佐剂(Freund’s Adjuvant complete)，RPMI-1640粉为美国Gibco公司产品，四甲基偶氮唑盐(MTT)，刀豆蛋白(Con A)，脂多糖(LPS)均为Sigma公司产品。
2.动物分组SD大鼠雌雄各半，2-3月龄，体重(250±30)克，C57BL/6小鼠，雌雄兼用，6周龄，体重(20±3)克，均由北京大学医学部实验动物部提供。将大鼠随机分为3组，每组10只，正常组每日每只灌服4ml水，于给水第1日给大鼠左后足跖皮内注射0.1ml生理盐水，模型组每日每只灌服4ml(0.24g/ml)奇壬醇，模型组与给药组于给水，给药第1日分别在左后足跖皮内注射0.1ml福氏完全佐剂，第18日将动物全部处死，取脾和腹腔巨噬细胞备用。
测定结果①奇壬醇对佐剂型关节炎大鼠淋巴细胞增值有促进作用，大鼠佐剂性关节炎大鼠淋巴细胞增值功能低下，与正常组比较下降28％，奇壬醇对AA大鼠模型淋巴细胞增值有促进作用增加20％。具体数据如表1所示。表1、奇王醇对佐剂性关节炎大鼠淋巴细胞增殖的影响(X±S)OD值(570nmmGroup Animal 5×106 splenGontrol 71.623±0.42AA 71.164±0.09## P＜0.05AA+奇王醇 71.400±0.15**P＜0.05＜##与正常组比较；**与AA组比较。
②奇壬醇可促进AA大鼠脾淋巴细胞IL-2的产生。佐剂性关节炎大鼠淋巴细胞产生IL-2功能低下，与正常组比较下降28％，给药后奇壬醇对AA大鼠模型淋巴细胞产生的IL-2在1∶2；1∶4；1∶8均有促进作用，与模型组比较，分别增加50％；52％；65％(P＜0.05)，并能恢复至正常大鼠水平。具体数据如表2所示。表2、奇王醇对AA大鼠脾淋巴细胞IL-2的影响-(X±S)IL-2 OD值570(nm)Group Animal1∶21∶41∶8Control 7 0.241±0.023 0.175±0.0230.143±0.012AA 7 0.174±0.017 0.122±0.0110.077±0.016AA+XXC 7 0.261±0.009 0.186±0.0240.127±0.021##与正常组比较＜0.05；**与AA组比较P＜0.05。
③奇壬醇可抑制LPS诱导的AA大鼠腹腔巨噬细胞IL-1的产生。
佐剂性关节炎大鼠腹腔细胞产生IL-1功能亢进，与正常组比较上升34％，给药后奇壬醇对AA大鼠模型腹腔巨噬细胞产生的IL-1在1∶10；1∶20；1∶40稀释毒均有抑制作用，与模型组比较，分别下降23％；33％；57％(P＜0.05)，并能恢复至正常大鼠水平。具体数据如表3所示。表3、奇王醇对AA大鼠腹腔巨噬细胞IL-1的影响(X±S)IL-1 OD 值570(nm)Group Animal 1∶10 1∶20 1∶40Control 7 0.164±0.013 0.097±0.015 0.055±0.014AA 7 0.219±0.016##0.141±0.040##0.106±0.063##AA+奇王醇7 0.168±0.020**0.108±0.023**0.046±0.009**##与正常组比较P＜0.05；**与AA组比较P＜0.05。
④奇壬醇对AA大属踝关节局部组织有恢复作用。AA大鼠踝关节切片局部滑囊细胞增生，纤维渗出，炎症细胞侵润。灌服奇壬醇后，充血减轻，炎症细胞渗出减少。
结论使用福氏完全佐剂制备的大鼠佐剂性关节炎，是免疫性炎症模型，常用的类风湿性关节炎试验模型之一。类风湿性关节炎是一种自身免疫性疾病，引起关节和全身的病变，与体液与细胞免致均有关，而T细胞直接参与这一病变。为此本试验采用上述免疫性炎症模型，探讨奇王醇抗风湿的作用机理。致炎后大鼠ConA诱导的脾淋巴细胞增殖功能低下，脾淋巴细胞产生的白细胞介素-2活性下降，LPS诱导的大鼠腹腔巨噬细胞产生的白细胞介素-1活性亢进，表明佐剂性关节炎大鼠细胞免疫功能下降，这与文献报道是一致的。给予奇王醇后，奇王醇可促进脾淋巴细胞增殖功能，并能使其产生的白细胞介素-2恢复至正常水平，见表2。提示奇王醇可通过增强T细胞的功能进而调整大鼠的机体免疫功能，从而改善机体的免疫状态。文献报道大鼠佐剂性关节炎的发生与巨噬细胞的异常活化有关，巨噬细胞的异常活化可产生过量的白细胞介素-1，而白细胞介素-1在佐剂性关节炎及人类风湿性关节炎的关节软骨和骨质的进行性破坏中起重要的作用。使新生正常软骨蛋白多糖损失，刺激滑膜细胞增殖，从而使软骨和骨质破坏。
本试验也证实佐剂性关节炎大鼠白细胞介素-1的产生亢进，同时表明奇王醇可抑制佐剂性关节炎大鼠产生的白细胞介素-1，见表3，从而可阻止白细胞介素-1对大鼠关节软骨及骨质的破坏进程，减轻全身及局部的病变进程。
佐剂性关节炎大鼠踝关节肿胀，活动受限。病理组织学检查表明踝关节滑囊细胞增生、炎症细胞侵润、纤维素渗出。灌服奇王醇的AA大鼠踝关节切片表明纤维素渗出减少，充血减轻。上述试验初步表明烯莶草可调整佐剂性关节炎大鼠的免疫功能，抑制局部组织炎症细胞渗出，减轻局部病理反映，使佐剂性关节炎得以恢复。
奇王醇镇痛作用药效研究奇王醇可明显减少疼痛模型小鼠的扭体次数，见表4。小鼠灌服奇王醇后可减轻醋酸的疼痛刺激，与模型组比较有显著的差异，镇痛率为65％，表明奇王醇有较好的镇痛作用。表4奇王醇对疼痛小鼠模型的镇痛作用动物数 剂量 扭体反应镇痛率组别 (n) (g/kg) (次数/只)(％)生理盐水模型 2010ml 29 0盐酸吗啡 200.01 0 100奇王醇 201.5 10 65注与生理盐水组比较，*P＜0.001
表5.东方烯莶和腺梗烯莶的镇痛作用组别 动物数 浓度 出现第一次扭体 扭体次数镇痛率 (只)(g/生药kg) 时间(min)(a±SD)(％)对照组 10 0 4.3 20.4±8.4东方烯莶10 28.39 3.2 12.1±6.9*40.710 9.46 4.4 15.4±12.724.5腺梗烯莶10 41.73 4.6 13.2±6.2*35.310 13.91 4.6 15.0±7.426.5注*P＜0.05从表5结果可以看出，东方烯莶和腺梗烯莶对冰醋酸诱发的腹痛均有镇痛作用，东方烯莶的作用强于腺梗烯莶。毒性结果根据中医临床应用，本发明对奇壬醇进行了最大耐受量的测定试验，实验动物为昆明小鼠。
最大耐受量实验结果表明，昆明小鼠对奇壬醇的最大耐受量分别为880.7mg/kg，结果提示奇壬醇的毒性极小，在推荐给药剂量范围内使用比较安全。
实施例5本实施例为应用实施例。
用实施例1得到的奇壬醇，制成药剂，建议临床推荐用量为15mg/日。片剂制备方法为取奇壬醇150克，粉碎成粉末，过400目筛，加1％硬脂酸镁，混合均匀，在压片机上压制10000粒，使每粒片剂中含15mg奇壬醇，患者每日服用1粒。主要功效为祛风湿，利关节，镇痛，解毒。用于风湿痹痛，筋骨无力，腰膝酸软，四肢麻痹，半身不遂，风疹湿疮。
权利要求
1.一种从药用植物豨莶草中分离提取和纯化化合物奇壬醇的方法，其特征在于该方法和步骤为(1)取原料药材豨莶草东方豨莶、腺梗豨莶或毛梗豨莶中的一种或两种或三种，将生药干品或新鲜药材粉碎后，称取干品或新鲜生药，向其中加入石油醚或环己烷，回流提取2-3次，每次回流时间为1-4小时，每次石油醚或环己烷的加入体积升数与生药干品重量公斤数之比＝6-12∶1，或石油醚或环己烷的加入体积升数与新鲜药材重量公斤数之比＝4-8∶1，每次回流后都进行过滤处理，去除回流液，再对滤渣进行下一次回流，最后一次的滤渣待用；(2)用溶媒回流提取或浸泡渗漉提取步骤(1)中得到的滤渣，溶媒可以是30-95％(体积比)乙醇水溶液、氯仿、二氯甲烷、己酸己酯、丙酮、甲醇或含有丙酮40-80％(体积比)的水液；溶媒的加入量按照步骤(1)中加入的原料加入量计算，每次加入溶媒的体积升数∶最初加入干品重量公斤数＝6-12∶1，或溶媒的体积升数∶新鲜药材重量公斤数＝4-8∶1；回流提取的方法是向滤渣中按比例加入溶媒，反复回流提取2-5次，每次回流时间为1-4小时；浸泡渗漉的方法是直接用上述溶媒、按上述比例在常温下对滤渣进行1-4次渗漉提取，每次渗漉4-6天；将上述操作得到的提取液过滤，收集滤液；在低于80℃温度下，对滤液进行减压浓缩，除去溶媒，得比重为1.1-1.4的浸膏状提取物A；(3)对步骤(2)中得到的提取物A，先加入水混悬溶解，提取物A的重量公斤数∶水的体积升数＝1∶3-6，然后以溶媒I萃取1-4次，溶媒I是石油醚或包括己烷、环己烷、正己烷在内的C6-C7烷烃，每次水相与溶媒相的体积比＝1∶0.2-2，分离出溶媒层，水层再用溶媒II萃取1-4次，溶媒II是乙酸乙酯或包括二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氯化碳在内的卤化烃或包括乙醚在内的醚或包括乙酸丁酯、乙酸戊酯在内的有机酸酯类或C3-C5的脂肪醇，每次水相与溶媒相的体积比例为1∶0.2-3；合并各次萃取后的溶媒II液，得溶媒液B，其中主含奇壬醇；(4)对步骤(3)中收集到的溶媒液B，在低于80℃条件下进行减压浓缩，得到提取固体浓缩物B1；(5)对步骤(4)中得到的提取固体浓缩物B1，用色谱法进行一次或多次的同种或不同种的层析法纯化，或对层析法的产品再进行重结晶纯化，得到奇壬醇纯品；色谱法层析纯化的具体步骤为取层析柱，用填料装柱，用洗脱液洗脱，收集含奇壬醇的部位，得到纯化了的奇壬醇；对于色谱法中使用的不同填料，采取不同的条件，具体为1)硅胶层析柱取常压玻璃层析柱，以60-400目硅胶为填料，提取固体浓缩物B1与硅胶重量份数比在1∶10-1∶300之间，以体积比在1∶0.5-1∶5之间的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂或石油醚和丙酮的混合溶剂为洗脱液，将收集到的含奇壬醇的洗脱液，在低于50℃温度下减压浓缩成固体；2)D101大孔树脂层析柱取常压玻璃层析柱，以D101大孔树脂为填料，提取固体浓缩物B1与填料的重量份数比在1∶20-1∶200之间，用水洗脱至洗脱流出液无色，然后再依次用体积百分比为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，每次洗脱至洗脱流出液无色再增加梯度，收集60％-80％的洗脱流出液，其中主含奇壬醇，再在低于60℃温度下将洗脱流出液减压浓缩成固体；3)中性氧化铝层析柱取常压或真空玻璃层析柱，以60-300目中性氧化铝为填料，提取固体浓缩物B1与中性氧化铝的重量份数比在1∶20-1∶200之间，以体积比在1∶0.5-1∶5之间的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂或石油醚和丙酮的混合溶剂为梯度洗脱液，即依次以2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的极性梯度增加，进行梯度洗脱，每一梯度洗脱至无样品检出，再增加至下一梯度，收集含奇壬醇的洗脱流出液，控制温度低于60℃，将洗脱流出液减压浓缩成固体；4)聚酰胺层析柱取常压玻璃层析柱，以60-300目聚酰胺为填料，提取浓缩物B1与聚酰胺的重量份数比在1∶20-1∶200之间，以体积比在1∶1-1∶10之间的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为梯度洗脱液即依次以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10为梯度洗脱液，或以体积比在1∶0.5-10之间的石油醚和丙酮的混合溶剂为梯度洗脱液即依次以2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10的混合液为梯度洗脱液，进行梯度洗脱，每一梯度洗脱至无样品检出，再增加至下一梯度，收集含奇壬醇的洗脱流出液，控制温度低于60℃，将洗脱流出液减压浓缩成固体；5)反相硅胶层析柱取常压柱或包括Lobar柱在内的制备型加压柱，以100-300目反相硅胶C-18或C-8为填料，提取固体浓缩物B1与反相硅胶C-18或C-8的重量份数比在1∶20-1∶200之间，以体积比在1∶9-4∶1之间的甲醇和水的混合溶剂为洗脱液，收集含奇壬醇的洗脱液，或以体积比在0∶1-1∶0之间的甲醇-水混合液为梯度洗脱液即依次以0∶1、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶1、8∶2、9∶1、1∶0为梯度洗脱液，进行梯度洗脱，每一梯度洗脱至无样品检出，再增加至下一梯度，收集含奇壬醇的洗脱流出液；然后控制温度低于60℃、将收集到的洗脱流出液减压浓缩成固体；所述的重结晶，就是将色谱法层析纯化后得到的固体，在分析纯级的有机溶媒乙酸乙酯或丙酮或包括乙醇在内的C1-C4醇或水中进行重结晶1-4次，得到奇壬醇结晶纯品。
2.奇壬醇在制备治疗抗类风湿性关节炎的药中的应用。
3.奇壬醇在制备镇痛药中的应用。
4.奇壬醇在制备抗菌药中的应用。
5.奇壬醇在制备抗疟药中的应用。
6.奇壬醇在制备降压药中的应用。
7.奇壬醇在制备舒张血管药中的应用。
8.奇壬醇在制备免疫抑制剂药中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种从植物、特别是从药用植物豨莶草中分离提取和纯化化合物奇壬醇的方法以及该化合物在医药中的应用,以奇壬醇作为先导化合物制成的药剂,具有抗类风湿性关节炎、镇痛、抗菌、抗疟、降压、舒张血管等功效,并具有毒性低、药效明显的优点。
文档编号C07C35/42GK1380277SQ02116909
公开日2002年11月20日 申请日期2002年4月26日 优先权日2002年4月26日
发明者林文翰, 付宏征, 李军 申请人:林文翰