专利名称：亲和保护活性区进行化学修饰蛋白质的方法、产品及用途的制作方法
技术领域：
本发明总的来说涉及蛋白质修饰领域，具体地说是涉及水溶性多聚物对蛋白质及其衍生物的化学修饰，特别涉及PEG对水蛭素定点修饰的方法、产品及治疗上的用途。
但蛋白的化学修饰存在较大的随机性，目前开发的专一性化学修饰试剂，其专一性只是针对蛋白质中的某一种或某一类基团，对蛋白质的活性区和非活性区并无选择性，从而使蛋白质活性区的基团被化学修饰，导致蛋白质活性降低或丧失。
水蛭素是凝血酶的直接的特异性抑制剂，可用于凝血系统功能紊乱导致的一些疾病的治疗。但水蛭素的半衰退期较短，有必要开发水蛭素的长效剂型。
PEG是一种水溶性多聚物，带有不同活化基团的PEG可以选择性修饰蛋白质中的某一种或某一类氨基酸，但不能选择性地修饰蛋白质活性区或非活性区的基团。
本项目在对水蛭素进行PEG修饰研究中，分析了水蛭素的氨基酸组成，发现分子中无游离的-SH供相应PEG修饰；其末端氨基是其活性所必需，故不能选择专一性修饰末端氨基的PEG；最终选择相应的PEG专一性地修饰水蛭素赖氨酸(Lys)。但在实验过程中，发现水蛭素接上4个PEG时，其生物学活性明显降低。从水蛭素与凝血酶的作用图看，其末端氨基和47位Lys都位于凝血酶与水蛭素作用的凹槽内，说明水蛭素47位Lys也部分影响其活性。在此基础上提出以下技术途径，通过凝血酶与水蛭素的亲和作用，对水蛭素末端氨基和47位Lys形成一个天然的保护屏障，避免被PEG修饰，而其它三个Lys则暴露在凝血酶保护区之外，供PEG修饰。
本发明的目的在于寻找一种对蛋白质的非活性区进行选择性修饰的方法，应用该方法用PEG选择性修饰水蛭素的非活性区内的基团，得到有活性的产品。
本发明概述本发明第一方面涉及通过亲和作用的方法，用配基保护蛋白及其衍生物的活性区，水溶性多聚物选择性修饰蛋白及其衍生物的非活性区的方法。
本发明的第二方面涉及通过凝血酶对水蛭素的亲和作用，保护水蛭素的活性区，PEG选择性修饰水蛭素的非活性区的方法及产品。
本发明的第三方面涉及用于治疗各种相关疾病的PEG化水蛭素药物组合物，其中包括PEG化水蛭素及与之混合的药用上可接受的稀释剂、载体或佐剂等。
本发明的第四方面涉及PEG化水蛭素药物用于治疗各种相关疾病中的用途。
本发明的第五方面涉及PEG化水蛭素的各种分析、分离方法，包括电泳、RP-HPLC、亲和层析。本发明详细描述根据本发明，第一方面涉及一种对蛋白及其衍生物进行选择性化学修饰的方法，具体说来，即把配基共价连接到固相载体上，通过配基与目的蛋白的亲和作用，保护蛋白及其衍生物的活性区，而对其非活性区进行选择性化学修饰的方法。
本发明的第二方面涉及把凝血酶共价连接到琼脂糖上，通过凝血酶对水蛭素的亲和作用，保护水蛭素的活性区中末端氨基和47位Lys，使PEG选择性修饰水蛭素的非活性区的方法及产品。
本发明的第三方面涉及用于治疗各种相关疾病的PEG化水蛭素药物组合物，其中包括PEG化水蛭素及与之混合的药用上可接受的稀释剂、载体或佐剂等。
本发明的第四方面涉及PEG化水蛭素药物用于治疗各种相关疾病中的用途，涉及深部静脉血栓、脑栓塞、肺栓塞、不稳定性心绞痛、急性心肌梗死、冠状动脉血栓形成后的再栓塞、弥漫性血管内凝血、体外循环或血液透析中的抗凝。
本发明的第五方面涉及PEG化水蛭素的各种分析、分离方法，包括电泳、RP-HPLC、亲和层析等。
权利要求
1.一种通过亲和作用保护活性区、暴露非活性区的方法用于蛋白或其衍生物的化学修饰。
2.权利要求1中的亲和保护，是指与目的蛋白或其衍生物有亲和作用的配基通过亲和作用保护目的蛋白或其衍生物的活性区。
3.权利要求2中的目的蛋白，包括细胞因子、人源化抗体、外源蛋白等，其中外源蛋白，优选的是水蛭素。
4.权利要求2中目的蛋白衍生物，包括具有氨基酸添加、缺失和/或替代的产物，包括水蛭素经氨基酸添加、缺失和/或替代产生的衍生物。
5.权利要求2中，与目的蛋白或其衍生物有亲和作用的配基，包括天然的、重组的和人工合成的细胞因子的受体、抗原、抗体、酶的作用底物、酶的可逆性竞争性抑制剂、外源蛋白的配基及上述配基的衍生物等，其中外源蛋白的配基优选的是凝血酶或其衍生物。
6.权利要求2中，与目的蛋白或其衍生物有亲和作用的配基或其衍生物通过亲和作用保护目的蛋白或其衍生物的活性区，优选凝血酶或其衍生物通过亲和作用保护水蛭素或其衍生物的活性区。
7.权利要求6中，与目的蛋白或其衍生物有亲和作用的配基或其衍生物通过亲和作用保护目的蛋白或其衍生物的活性区，涉及活性区内的所有基团。
8.与目的蛋白或其衍生物有亲和作用的配基或其衍生物共价连接到固相载体上。
9.权利要求8中的固相载体，包括硅胶、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺衍生物、磁性微球等，优选的固相载体是琼脂糖。
10.权利要求1中的化学修饰是指水溶性多聚物对蛋白及其衍生物的化学连接。
11.权利要求10中的水溶性多聚物选自葡聚糖、聚乙二醇(PEG)、丙二醇均聚体等，优选的水溶性多聚物是PEG。
12.权利要求11中的PEG分子量在2kDa到100kDa之间，优选的PEG分子量为5kDa。
13.权利要求11中的PEG包括PEG的各种活化形式。
14.一种通过配基或其衍生物与目的蛋白或其衍生物的亲和作用，保护蛋白或其衍生物的活性区、化学方法选择性修饰蛋白或其衍生物非活性区的方法。1)将目的蛋白或其衍生物的配基或其衍生物共价连接到固相载体上。2)目的蛋白或其衍生物通过亲和作用结合于配基或其衍生物上，保护目的蛋白或其衍生物的活性区，仅暴露目的蛋白或其衍生物的非活性区。3)水溶性多聚物选择性与目的蛋白或其衍生物非活性区中基团连接。4)改变洗脱条件，获得反应产物。
15.一种通过凝血酶保护水蛭素活性区、PEG选择性修饰水蛭素非活性区的方法。1)凝血酶共价连接到琼脂糖载体上。2)水蛭素通过亲和作用结合到凝血酶上，水蛭素与凝血酶作用的活性区被凝血酶保护。3)活化好的PEG选择性地修饰水蛭素非活性区的基团。4)改变洗脱条件，获得PEG化的水蛭素。
16.按权利要求15的方法生产的PEG化的水蛭素产品。
17.权利要求16中，PEG化水蛭素组合物在治疗深部静脉血栓、脑栓塞、肺栓塞、不稳定性心绞痛、急性心肌梗死、冠状动脉成形术后的再栓塞、弥漫性血管内凝血、体外循环或血液透析中的抗凝中的用途。
18.权利要求17中，PEG化水蛭素组合物中的PEG化水蛭素及药用上可行的稀释剂、载体和佐剂。
全文摘要
本发明涉及一种水溶性多聚物定点修饰蛋白或其衍生物的方法，具体而言是涉及一种亲和保护的方法用于水溶性多聚物定点修饰蛋白或其衍生物，特别涉及凝血酶或其衍生物亲和保护水蛭素或其衍生物后用聚乙二醇定点修饰的方法、产品、药物组合物及其治疗用途。
文档编号C07K14/81GK1453292SQ0211670
公开日2003年11月5日 申请日期2002年4月26日 优先权日2002年4月26日
发明者于爱平, 吴祖泽, 蒋中华 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所, 北京鲁银利华医药科技发展有限公司