专利名称：喜树细胞中抗癌活性物质的制备及用于抑制癌细胞的方法
技术领域：
本发明属于植物生物技术和生物分离技术领域。
背景技术：
喜树(Camptocheca acuminata Decaisne)为山茱萸目(Cornales)珙桐科(Nyssaceae)乔木植物，是我国南方特有树种。在长江以南各省区广为分布，具有生长速度快、病虫害少等特点，是我国南方主要绿化树种。现有的大多是栽培树种，野生资源极其有限。喜树在一些少数民族地区自古以来即为重要药材，且全株入药，用于治疗恶性疔毒、肿瘤，效果很好。在我国的一些中草药著作里也有关于喜树用于治疗恶性肿瘤、肠痈等的记载。
1957年开始，美国国立癌症治疗服务中心(CCNSC)对农业部(USDA)东北地区研究实验室(ERRL)提供的两千余种植物的乙醇提取物进行了抗肿瘤活性分析，其中只有喜树提取物对CA-755标准分析系统表现出极高的生理活性。随后进行的小鼠L1210白血病生命延长率测定，喜树提取物仍表现出极高的生理活性。这引起了Monroe E.Wall博士等人的高度兴趣。1966年，他们从喜树提取物中分离得到了这种具有高抗癌活性的生物碱，并将这种生物碱命名为喜树碱(Camptothecin，CPT)。此后，美国生物化学家Horwitz博士经过几年实验研究，提示喜树碱极其衍生物的抗癌活性机制是对癌细胞DNA复制过程中酶的抑制。1985年，美国霍普金斯大学(Johns Hopkins)的Hsiang发现喜树碱是通过抑制拓扑异构酶I(Topoisomerase I，Topo I)发挥其抗癌作用，对白血病，胃癌、结肠癌、乳腺癌、直肠癌等有较高疗效。
尽管喜树碱具有很高的抗癌活性，但由于毒性较大在临床治疗中受到了极大的限制。因此，采用化学修饰的方法筛选活性高、毒性低的喜树碱衍生物作为抗癌药物成为目前研究的热点。此外，由于利用植物细胞培养技术生产次生代谢物质在很多种药用植物上都取得了成功，因此利用植物细胞培养方法筛选和生产具有低毒高效特点的喜树衍生物也具有一定的可能性。
我们在进行喜树细胞培养的研究中，发现喜树细胞培养物的乙醇提取液中含有具有较强的抗癌活性物质。因此，我们在提高这种抗癌活性物质的得率，抗癌活性组分的提取、分离、纯化等方面进行了系统的研究，并对其进行了体外实验，为新的抗癌药物开发及产业化打下基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种喜树细胞中抗癌活性物质的制备及用于抑制癌细胞的方法。
本发明的技术解决方案是，喜树细胞中抗癌活性物质，是喜树正碱和喜树异碱，分子式均为C16H10N2O3，分子量均为278，喜树正碱结构式为 喜树异碱结构式为 喜树细胞中抗癌活性物质的制备方法，是以喜树的嫩叶为外植体，将在固体培养基上诱导、继代培养的喜树愈伤组织，转入液体培养基上，进行喜树细胞悬浮培养；然后用色谱法分离纯化喜树细胞中抗癌活性物质。
愈伤组织的诱导和继代培养是在光照培养箱中进行的，光照10-20小时/天，培养温度为23-30℃，喜树愈伤组织每隔25-35天继代一次。
作为诱导、继代培养喜树愈伤组织的固体培养基，其基本培养基为MS培养基，其中附加了0.05-05mg/l 2，4-D、0.4-0.8mg/L 6-BA，碳源为蔗糖，20-40g/L，凝固剂为琼脂7g/L，pH为5.5～6.5。
喜树细胞是在120r/min的恒温旋转摇床上培养，温度为23～30℃，喜树细胞培养每隔7～14天继代一次。
进行悬浮培养的液体培养基，其基本培养基为MS培养基，其中附加了0.5～0.05mg/L 2，4-D、0.4～0.8mg/L 6-BA，碳源还是蔗糖，20～50g/L，pH值在5.5～6.5。
喜树细胞培养生产喜树正碱和喜树异碱，其培养周期为15～25天。
分离纯化喜树培养细胞中抗癌活性物质的步骤是A.抗癌活性物质的提取以乙醇为提取液，采用索氏提取，在95℃水浴中，提取喜树细胞物内的活性物质，得到含有抗癌活性物质的提取液，B.大孔树脂柱对提取液的粗分离在已活化大孔树脂301柱上，使用72％、90％和100％浓度的乙醇依次洗脱喜树细胞的提取液，收集其中乙醇浓度为90％的洗脱液，得到含有抗癌新物质的粗分离洗脱液，C.C18柱对洗脱液的再分离通过C18填料柱、以乙腈为洗脱液，采用0％、40％、45％、和100％四个浓度的己腈洗脱粗分离液，收集浓度40％的己腈洗脱液，得到含有抗癌活性物质含量更高，杂质较少的洗脱液，D.高压液相色谱的精分离高压液相色谱固定相采用C18反相色谱柱，在高压液相制备色谱上，以体积比为3∶7的己腈-水为流动相，流速4.5mL/min，检测波长254nm，定量参数为保留时间，对C步骤得到的洗脱液进行精分离，得到纯度在99％以上抗癌活性物质的纯品。
检测所得到的纯品的抗癌活性的方法，步骤是A.喜树培养细胞乙醇活性原液的制备；B.培养Hela细胞；C.喜树提取液处理Hela细胞；D.MTT及酶标仪测量，根据抑制率绘图，计算LD50；
被处理过的Hela细胞形态学观察方法(1)倒置显微镜观察(2)荧光显微镜观察(3)电子显微镜观察实验结果表明喜树细胞提取液对肿瘤细胞有抑制作用(1)喜树细胞提取液对Hela细胞有抑制作用，在一定范围内，随喜树细胞提取液的浓度的增加和作用时间的延长，抑制作用增加。作用24小时，LD50为406.18μg/mL；作用48小时，LD50为319.48μg/mL；作用72小时，LD50为112.84μg/mL。
形态学观察结果(1)倒置显微镜观察Hela细胞加入喜树正碱和喜树异碱乙醇液后，与对照组相比，细胞增加减缓，倒置显微镜下单位面积的细胞数量减少，细胞间连接消失，细胞体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。(2)荧光显微镜观察Hela细胞加入喜树正碱和喜树异碱乙醇液培养24小时后，与对照组相比，加药组细胞明显变小，细胞核固缩，碎裂。PI-Hochest33258染色，着色轻且均匀的绿色细胞为正常细胞；着色不均匀，颜色较深的绿色细胞为凋亡细胞；红色细胞是坏死细胞或继发性坏死细胞。从实验结果可知，在一定范围内，随着喜树正碱和喜树异碱乙醇液浓度和作用时间的增加，Hela细胞凋亡，细胞数量增加，坏死细胞量液增加，但当喜树正碱和喜树异碱乙醇液浓度降低，作用时间短时，坏死细胞数量少，数量增加速度缓慢。(3)电子显微镜观察加药组Hela细胞出现核碎裂、染色质固缩，聚集于核膜呈境界分明的块状，随着加药时间的延长，细胞变形，染色质边聚更明显。
本发明的有益效果是用喜树的嫩叶为外植体，不影响原植株的继续生长。所用的培养基廉价易得，操作过程简便明了；分离步骤少，分离方法简单，节省大量时间和溶剂，能够得到含量在99％以上喜树正碱和喜树异碱纯品；抑制癌细胞效果明显。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。1、喜树细胞培养物抽提物抑制人宫颈内膜瘤细胞株活性实验1)喜树细胞培养物抽提物制备将喜树细胞培养物磨成细粉，用95％乙醇为提取液，采用索氏提取，在95℃水浴下，提取喜树干细胞粉末内的活性物质，得到含有两种抗癌活性物质的提取液。在已活化大孔树脂301柱上，使用72％、90％和100％浓度的乙醇依次洗脱喜树细胞的提取液，收集其中乙醇浓度为90％的洗脱液，得到含有两种抗癌新物质的粗分离洗脱液。C18柱对洗脱液的再分离通过C18填料柱、以乙腈为洗脱液，采用0％、40％、45％、和100％四个浓度的己腈洗脱粗分离液，收集浓度40％的己腈洗脱液，得到含有两种抗癌活性物质含量80％以上的洗脱液，将其在旋转蒸发器中蒸干，重新溶于95％乙醇中，制成0.58mg/mL原液。2)MTT法(1)细胞培养Hela细胞采用添加10％小牛血清的含酚红指示剂的RPMI1640培养基，置于5％CO2孵箱中37℃培养。每48小时或培养液变黄表明培养液变酸时换液。当贴壁细胞Hela长满时，弃液体培养基，用0.25％的胰蛋白酶消化，吹打，收集传代。(2)喜树抽提液处理Hela细胞取对数生长期的细胞记数，以1×105个/mL加到96孔板中，每孔100μL，37℃，5％ CO2孵箱中培养18小时，换液，加入不同浓度提取液，处理不同时间，以仅添加培养液孔作空白对照，每组4复孔，重复3次。加入药物终浓度如下2.25、4.5、9.01、18.125、36.25、72.5、145、290、580μg/mL共9个浓度梯度。(3)加入MTT及酶标仪测量Hela细胞分别用药物处理24小时、48小时、72小时后，丢弃上清，用1×PBS洗涤2次。酶标仪测定吸光值，测定波长为570nm。 根据抑制率绘图，计算LD50。3)形态学观察(3)倒置显微镜观察将含有细胞的24孔培养板直接置于倒置显微镜下观察，比较诱导和未经诱导的细胞形态，观察有无凋亡小体的出现，拍照片。
Hela细胞接种量1×105个/mL，药物浓度600μg/mL，作用时间分别为0、4、12和24h。
(4)荧光显微镜观察收集细胞，离心，1×PBS洗2次，0.25％胰酶消化，涂于玻璃片上，4％甲醛固定，加入PI染液(终浓度50μg/mL)，于荧光显微镜下观察。
收集细胞，离心，1×PBS洗2次，加入Hochest33258(终浓度5μg/mL)及PI(终浓度5μg/mL)，避光染色15min，于荧光显微镜下观察并记数。
(3)电子显微镜观察接种量1×105个/mL，药物浓度400μg/mL，作用时间为8h和24h。收集细胞，置离心管中离心，800～1000r/min，10min。用0.01mol/LPBS5mL重悬细胞。将细胞悬液吸入装有琼脂空槽的离心管中。离心，800～1000r/min，10min。取出离心管内的琼脂，仔细切下尖槽内含细胞团的琼脂块。将含有细胞团琼脂块放入戊二醛固定液的小瓶中，4℃可长期保存。用0.1mol/LPBS缓冲液洗1次。1％锇酸固定30～60分钟。常规电镜样品制备程序脱水、渗透、包埋，超薄切片，铀铅染色。透射电镜观察并拍照。2、喜树细胞培养生产喜树正碱和喜树异碱1)喜树愈伤组织诱导诱导愈伤组织培养基的配制用蒸馏水配制MS培养基一升。附加30g/L蔗糖(分析纯)，0.15mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，0.6mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)，7g/L琼脂，pH值调到5.8。分装25个100mL三角培养瓶，加塞后，置于高压锅中，121°、15个大气压下，灭菌20分钟。
选取喜树嫩叶为外植体，先用清水清洗干净，浸入70％乙醇漂洗30min，取出后用清水冲洗三次，再在滴加了二滴吐温-80的0.1％次氯酸钠溶液中浸泡3～5min，无菌水冲洗三至四次(直至无泡沫时为止)。将叶片在无菌条件下剪成约0.8cm×0.8cm大小的小块，接入配制好的诱导培养基中。
在光照培养箱中培养，光照16小时/天，培养温度为25℃。培养8天，就会看到有愈伤组织产生。每隔30天继代一次(所用继代培养基与诱导培养基相同)。经过五次继代培养，就可以得到疏松易碎，生长状态良好，适于悬浮培养的喜树愈伤组织。2)喜树细胞悬浮系建立液体培养基的配制液体培养基的组成与固体培养基组成基本一致，只去除掉琼脂，将2，4-D浓度改为0.5mg/L。分装于500mL三角培养瓶中，每瓶200mL培养液，高压灭菌。
将五次继代培养以上的疏松易碎、生长旺盛的喜树愈伤组织转入液体培养基中，每瓶的接种量(鲜重)20克，为培养液重量的10％。于120r/min的恒温旋转摇床上培养，温度为25℃。经7天培养，用新鲜的液体培养基更换瓶中1/3体积的培养液。以后每隔7天，用新鲜培养基更换培养瓶中2/3体积的培养液。更换两次培养液后，愈伤组织已离散到培养液中分散成单细胞或小颗粒，并快速生长。经过1个月左右即可建成淡黄色、生长旺盛、单细胞与小细胞团均匀混合的喜树细胞悬浮培养系。称取20g继代培养10d的喜树细胞为“种子”，共20份，分别接入20瓶内含200mL液体培养基三角瓶中，上述条件下喜树细胞悬浮培养30d，喜树细胞培养物收获后，用清水冲洗干净，减压抽滤去除残液后置于恒温干燥箱中，60°烘干至恒重，磨成细粉，待用。3)喜树细胞培养物中抗癌新物质含量检测用高效液相色谱法检测喜树细胞培养物中新组分喜树正碱和喜树异碱的含量。色谱条件液相色谱分析采用WATERS高效液相色谱仪，色谱柱YWM-C18(10)200×4.6mm(大连化物所出品)，流动相己睛-水(体积比为3∶7)，流速1mL/min，波长254nm，定量参数为峰面积。称3克细粉，于索氏提取器中用95％乙醇40mL回流提取8小时，乙醇提取液经过过滤后直接进样分析。
两个新物质喜树正碱和喜树异碱含量用细胞培养物干重的百分含量来表示。经过分析，喜树细胞培养物中新物质含量喜树正碱为2％，喜树异碱为0.8％。分子式为C16H10N2O3。喜树正碱结构式为 喜树异碱结构式为 3、喜树正碱和喜树异碱的分离纯化1)喜树细胞培养物中新组分的提取称取80g喜树细胞培养物细粉，装入滤纸筒中，封好，将其放入500mL索氏提取器中，用200mL 95％乙醇、在95℃水浴下回流提取8小时，收集提取液，待用。2)大孔树脂301柱对提取液的粗分离将用乙醇活化好的产于天津南开大学化工厂的大孔树脂301，装入φ40×800的玻璃柱中，用蒸馏水清洗树脂柱，将树脂柱内的乙醇置换干净。将所得到的喜树细胞提取液加入蒸馏水，使提取液中乙醇的含量为65％～70％，取60mL倒入处理好的树脂柱中，以100mL 72％、100mL 90％以及100mL 100％的乙醇溶液进行洗脱，收集90％的乙醇洗脱液。用旋转蒸发器将90％的乙醇洗脱液进行浓缩，然后将浓缩后的乙醇液50mL用孔径为0.25μm滤膜过滤，超纯水稀释至五倍，待用。3)C18柱对洗脱液的进一步分离50mL酸式漏斗通过橡皮塞密封于瓶上，瓶上的另一接口通过胶管接在真空泵上。在50mL酸式漏斗中加入20mL C18填料，填料表面加盖滤纸。在酸式漏斗中先后加入40mL水、40mL 40％乙腈、40mL 100％乙腈将柱中的C18活化，然后将过滤好的样品液5mL倒入柱中，用真空泵在真空度为0.1下进行抽滤，待抽干后，倒入超纯水40mL，收集洗脱液于A瓶中、倒入40％乙腈40mL，收集洗脱液于B瓶中、倒入45％己睛40mL、收集洗脱液于C瓶中、最后倒入100％乙腈60mL，收集洗脱液于D瓶中。然后再上样，重复操作，直至完成所有样品的分离。将收集到的A、B、C、D瓶中的液体浓缩蒸干后，再重新溶于乙醇溶液中。得到细分后的A液、B液、C液、D液进行抗癌活性实验，得知活性组分存在于C中。将C样重新溶于100％乙醇溶液中，待分。4)高效液相色谱的精分离高效液相色谱制备与分析采用Waters高效液相色谱仪，大连化物所出品的制备色谱柱YWM-C18(10)200×10mm，流动相体积比为3∶7的乙腈-水，流速4.5mL/min，紫外检测波长为254nm，上样量为90μL。分别收集保留时间为36.56min和42.33min两个色谱峰组分，浓缩干燥后，得到两个淡黄色的纯品。经色谱和质谱检测，两种组分含量在99％以上。通过光谱分析鉴定，确定两种新物质的分子式为C16H10N2O2；结构式分别为 和 分子量同为278。我们将其命名为喜树正碱和喜树异碱。
权利要求
1.喜树细胞中抗癌活性物质的制备方法，其特征在于，以喜树的嫩叶为外植体，将在固体培养基上诱导产生、并继代培养5次以上的喜树愈伤组织，转入液体培养基中，进行细胞悬浮培养；为了获得喜树培养细胞中的抗癌活性物质，首先选用大孔树脂301对喜树细胞的提取液进行柱层析，得到活性物质含量较高洗脱液，然后通过C18柱对所获得的洗脱液分离纯化，最后用高压液相色谱获得喜树细胞中抗癌活性物质纯品。
2.根据权利要求1所述的喜树细胞中抗癌活性物质的制备方法，其特征在于，愈伤组织的诱导和继代培养是在光照培养箱中进行的，光照10～20小时/天，培养温度为23～30℃，喜树愈伤组织每隔25～35天继代一次。
3.根据权利要求1、2所述的喜树细胞中抗癌活性物质的制备方法，其特征在于，作为诱导、继代培养喜树愈伤组织的固体培养基，其基本培养基为MS培养基，其中附加了0.05～05mg/l 2，4-D、0.4～0.8mg/l 6-BA，碳源为蔗糖，20～40g/l，凝固剂为琼脂7g/l，pH为5.5～6.5。
4.根据权利要求1所述的喜树细胞中抗癌活性物质的制备方法，其特征在于，喜树细胞是在120r/min的恒温旋转摇床上培养，温度为23～30℃，喜树细胞培养每隔7～14天继代一次。
5.根据权利要求1、4所述的喜树细胞中抗癌活性物质的制备方法，其特征在于，进行悬浮培养的液体培养基，其基本培养基为MS培养基，其中附加了0.5～0.05mg/l 2，4-D、0.4～0.8mg/l 6-BA，碳源还是蔗糖，20～50g/l，pH值为5.5～6.5。
6.根据权利要求1所述的喜树细胞中抗癌活性物质的制备方法，其特征在于，喜树细胞培养生产喜树正碱和喜树异碱，其培养周期为25～35天。
7.根据权利要求1所述的喜树细胞中抗癌活性物质的制备方法，其特征在于，分离纯化喜树培养细胞中抗癌活性物质的步骤是A.喜树培养细胞中抗癌活性物质的提取以乙醇为提取液，采用索氏提取，在95℃水浴下，提取喜树细胞粉末内的活性物质，得到含有抗癌活性物质的提取液，B.大孔树脂柱对提取液的粗分离在已活化大孔树脂301柱上，使用72％、90％和100％浓度的乙醇依次洗脱喜树细胞的提取液，收集其中乙醇浓度为90％的洗脱液，得到含有抗癌新物质的粗分离洗脱液，C.C18柱对洗脱液的再分离通过C18填料柱、以乙腈为洗脱液，采用0％、40％、45％、和100％四个浓度的己腈洗脱粗分离液，收集浓度45％的己腈洗脱液，得到含有抗癌活性物质含量80％以上的洗脱液，D.高压液相色谱的精分离高压液相色谱固定相采用C18反相色谱柱，在高压液相制备色谱上，以体积比为3∶7的己腈-水为流动相，流速4.5ml/min，检测波长254nm，定量参数为保留时间，对C步骤得到的洗脱液进行精分离，得到含量在99％以上抗癌活性物质的纯品。
8.用权利要求1、7所述的喜树细胞中抗癌活性物质的制备方法制备的抗癌活性物质抑制癌细胞的方法，其特征在于，A.喜树细胞乙醇活性原液的制备将抗癌活性物质的纯品重新溶于95％乙醇中，制成0.58mg/mL原液，B.细胞培养Hela细胞采用添加10％小牛血清的含酚红指示剂的RPMI1640培养基，置于37℃、5％CO2孵箱中培养；每48小时或培养液变黄表明pH值变酸时换液；当贴壁细胞Hela长满时，弃液体培养基，用0.25％的胰蛋白酶消化，吹打，收集传代，C.接种与喜树提取液处理细胞取对数生长期的细胞记数，以1×105个/mL加到96孔板中，每孔100μL，37℃，5％CO2孵箱中培养18小时，换液，加入不同浓度提取液，处理Hela细胞不同时间，以仅添加培养液孔作空白对照，每组4复孔，重复3次；加入药物终浓度如下2.25、4.5、9.01、18.125、36.25、72.5、145、290、580μg/mL，共9个浓度梯度，D.MTT及酶标仪测定Hela细胞分别用药物处理24～72小时后，弃上清，用1×PBS洗涤2次；HLF细胞用药物处理24小时后，加90μL无酚红培养基及10μLMTT溶液(1×PBS配制，0.22μm微孔滤膜过滤，终浓度5mg/mL)，37℃孵育4小时，丢弃上清，加入含0.04MHCL的异丙醇100μL轻轻振荡，酶标仪测定吸光值，测定波长为570nm， 根据抑制率绘图，计算LD50，结果表明喜树细胞提取液对Hela细胞有抑制作用Hela细胞24h、48h、72h的LD50分别为406.18μg/mL、319.48μg/mL、112.84μg/mL。
9.权利要求1、8所述的喜树细胞中抗癌活性物质，其特征在于，是喜树正碱和喜树异碱，喜树正碱结构式为 喜树异碱结构式为 分子式均为C16H10N2O3，分子量均为278。
全文摘要
喜树细胞中抗癌活性物质的制备及用于抑制癌细胞的方法属于植物生物技术和生物分离技术领域。本发明用喜树嫩叶在MS固体培养基上诱导愈伤组织，转入液体培养基悬浮培养，获得喜树细胞培养物；用喜树细胞培养物提出液处理人宫颈内膜瘤细胞株细胞24小时后，MTT法测定细胞存活率变化，结果表明，喜树细胞提出物对肿瘤细胞有明显的抑制作用。通过粗分离和精致，从喜树细胞培养物中纯化得到两个抗癌活性新物质喜树正碱和喜树异碱纯品。本发明的优点是抗癌新物质喜树正碱和喜树异碱，其含量分别达到了2％和0.8％的水平。本发明的优点是所得到的新化合物喜树正碱和喜树异碱有抗癌活性，且含量高，有很好的发展前景。
文档编号C07D471/00GK1462749SQ03133489
公开日2003年12月24日 申请日期2003年6月21日 优先权日2003年6月21日
发明者安利佳, 张冬艳, 白凤武, 包永明, 于放, 关水 申请人:大连理工大学