专利名称：一种抑制癌细胞株的中药制剂及其制备方法
技术领域：
本发明是关于一种抑制癌细胞株的中药制剂及其制备方法，尤其指利用四种中药 材培养樟芝菌丝体发酵，并由萃取方法所取得的中药物。
背景技术：
樟芝(Antrodia camphorate)，为属于非褶菌目、多孔科、多年生蕈菌类。为珍 贵的药材或食材。迩来被重视用于养生保健。因为樟芝往往依附在牛樟树Cirmamomum kanehirai Hay，所以又称牛樟芝或牛樟菇。至于樟芝对于肝病的疗效，根据资料所称，土著 人饮酒导致肝病，都是饮用樟芝所制作的汤汁，得到很好疗效。因此在口耳相传之下，受到 极大的重视。此外也受到生化、中西医药界及政府、学界相关机构的重视与证实，例如(但 不限于)论文类1、牛樟芝不同极性区分保肝机能性之研究——中山医学大学营养研究所92硕士 论文。2、牛樟芝辅助肝癌化学治疗与改善抗药性表现的药理活性暨分子机制探讨—— 南台科技大学生科技所94硕士论文。3、牛樟芝辅助肝癌化学治疗与改善抗药性表现的药理活性暨分子机制探讨—— 南台科技大学生科技所94硕士论文。4、牛樟芝萃取物抑制微小胶质细胞发炎机制的探讨——台北医学大学医学研究 所94硕士论文。5、不同樟芝菌种发酵液在肝癌细胞的毒杀性比较——国立台湾海洋大学食品科 学所94硕士论文。6、以细胞培养模式评估固态培养牛樟芝菌取物的之抗肝癌生物活性及其机 制——国立台湾海洋大学食品科学所94硕士论文。7、樟芝的保肝功效与保肝有效成分纯化的研究——国立成功大学药理学研究所 94硕士论文。8、中草药对肝炎的研究探讨——实践大学食品营养所93硕士论文。台湾大学食 科所92硕士论文。期刊类1、生物科技——顾肝保肝牛樟芝，中华文化双周报，陈相训，94. 042、正确认识生技食品牛樟芝，中华文化双周报，陈俊志，94. 023、灵芝与樟芝之研发与市场现况，农业世界，王伯彻，民94. 01页20-32Taiwanofungus，A Polypore New Genus，中华真菌学会会刊，吴声华等，93. 124、樟芝活性成分的研究及应用，食品工业，王薇猗，93. 125、樟芝的牛樟树宿主专一性，食品工业，林永浩，93. 056、灵芝和牛 樟，明道文艺，徐基东，92. 12前案类
申请案号093113387 —种可抑制B型肝炎抗原之化合物及其医药或食品组合物申请案号092106890 —种可提高人体运动能力与抗疲劳的人工栽培樟芝萃取 制造方法与其新用途由上述等深入的研究以及临床实验，皆可证实樟芝良好的功效。虽然樟芝受到重视，但是因为樟树在家俱、雕刻业以及樟脑油业大量需求下遭大 量砍伐，以至实际上「樟芝子实体」的产量相当有限，所以目前实际上使用的比较多的「樟 芝菌丝体」的的产物。「樟芝子实体」与「樟芝菌丝体」的区别，根据日本东京农大生化应用资深研究员蓝 苍洲指出，所谓「樟芝子实体」指的是已出菇的樟芝，具备完整的「生理结构及活性」，是最 接近野生樟芝的；而「菌丝体」指的未出菇的樟芝，属于不成熟且不完整的生理结构，与野 生的成分相差非常大，原本樟芝的主要价值在「樟芝子实体」。由于前述野生樟芝数量极少，近年来更因为盗垦而濒临绝种，所以生物界积极投 入人工樟芝子实体的培育技术，经历十多年的研究。例如目前市面上所呈现的牛樟芝胶囊， 等即是由菌丝体作成，然而利用不同的液态或固态(如葡萄糖-液态五谷豆皮、洋菜等)培 养的菌丝商品，因为培养基不同，因此菌丝体功效并不相同，而有良窳之分。
发明内容本发明目的在于解决上述不足，提供一种抑制癌细胞株的中药制剂及其制备方 法，其能很好地培养樟芝菌丝体的培养基。为达成上述目的，本发明采用如下技术方案抑制癌细胞株的中药制剂，其特征在于以包括当归、川芎、熟地黄、白芍所混合的 四物中药材培养樟芝菌丝体发酵，并由萃取方法所取得。四物中药材培养樟芝菌丝体发酵方法，其培养至发酵的步骤包括A、取当归川芎熟地黄白芍为1 5 1 5 1 5 1 5种类以及重 量比例；B、用水煎煮萃取后过滤，过滤后药材的药渣备用；C、取药渣并为脱水，成为固形物；D、混入碳酸钙，该碳酸钙固形物重量为1 5% 100%;混入米糠，该米糠固 形物重量为1 30% 100%混入蛋白胴(ρ印tone)，该蛋白胴(ρ印tone)固形物重量为 1 5% 100%E、经灭菌后，该中间制备物加入樟芝菌丝体菌液，其重量比例为中间制备物樟 芝菌丝体菌液为1 50 1 ；F、发酵其发酵条件为温度15-50°C湿度30_95%培养天娄7_50天；取得樟芝四物药 材。本发明的有益之处在于提供一种抑制癌细胞株的中药制剂及其制备方法，这种抑 制癌细胞株的中药制剂，是以当归、川芎、熟地黄、白芍所混合的四种中药材培养樟芝菌丝 体发酵，并由萃取方法所取得。主要是以中药材为木质化的药材，加入具有强烈纤维素分解 酵素，而作为固体发酵用菌种，可有效将残留于中药药渣的一些成份，再予以分解及合成可能有功效性的特殊成份出来，本方案特别是以上述中药材中所混合的四物中药材培养樟芝 菌丝体发酵，并由萃取方法所取得。本发明主要是由具有强烈纤维素分解酵素及木质素分解酵素的高等真菌，特别是 菇类，作为固体发酵用菌种，可有效将残留于中药药渣的一些成份，再予以分解及合成可能 有功效性的特殊成份出来，透过功能性评估试验，可以有突破性的发现。领取四物药材(当归川弯熟地黄白芍=1 5 1 5 1 5 1 5) 用水煎煮萃取后过滤，过滤后药材的药渣备用。领取药渣，脱水(形成固形物)，混合(加 入碳酸钙、米糠、蛋白胴(peptone))，充填，取混合后四物药材(或药渣)，经灭菌后，取四 物药材，加入樟芝菌丝体菌液，其重量比例为1-50 1，发酵后收成，其发酵条件为温度 15-50°C湿度30-95%培养天数7_50天。 本发明的樟芝四物药材，可以利用以下几种萃取液来达到萃取的目的，例如第一 种萃取液为水酒精=100% 0%、第二种萃取液为水酒精=50士3% 50士3%、第三 种萃取液为水酒精=5士3% 95士3%，而经过实验证实，以第三种萃取液为较佳。本发明实验过程，可以容许第一种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度=1 30ml Ig;第二种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度=1 30ml Ig ；第三种萃取液 与该樟芝四物药材的萃取浓度=1 30ml Igo该樟芝四物药材由第一种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至发酵 物第一种萃取液1 30g Iml ；该樟芝四物药材由第二种萃取液与该樟芝四物药材 中以真空减压浓缩至樟芝四物药材第二种萃取液1 30g Iml;该樟芝四物药材由 第三种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材第三种萃取液1 30g 1ml。
以下结合附图对本发明详细说明
图1是本发明动物小鼠体内试验示意图一；图2是本发明动物小鼠体内试验示意图一；图3是灌食本发明萃取物的老鼠状态图；图4是尚未灌食本发明萃取物的老鼠状态图；图5是显示肝癌增生细胞的KI-67抗体染色图；图6是喂食樟芝四物(J20)萃取物后，KI-67抗体与肝癌增生细胞产生的红点减 少示意图；图7是本发明四物中药材培养樟芝菌丝体发酵方法流程示意图。
具体实施例方式以下结合附图及实施例对本发明详述本发明是关于一种抑制癌细胞株的中药制剂，是以包括当归、川芎、熟地黄、白芍 所混合的四种中药材培养樟芝菌丝体发酵，并由萃取方法所取得。而该四物、其功效以及其 主治，包括当归
功效补血活血，滋养强壮，调经止痛，润燥滑肠。主治风湿痹痛，经闭腹痛，崩漏眩晕，肠燥便难，痈疽疮疡，跌打损伤。川芎功效头痛眩晕，胸胁胀痛，筋挛寒痹，腰脚软弱，腹内冷痛，泻痢，痈疽，月经不调。主治行气开郁，驱风止痛，理气活血，排脓长肉，燥湿，上行头面，外达肌肤，为治 痛常用药。白芍功效泻肝火，和血脉，敛阴平肝，缓中止痛。主治血虚头晕，崩漏虚汗，胸腹疼痛，月经不调，四肢挛急，泻痢。熟地黄功效补精益髓，滋阴强壮，养肝明目。主治月经不调，胎产崩漏，遗精消渴，潮热盗汗，耳聋目昏。由于该四物具有高度营养，因此做为培养基极为恰当，该四物中药材培养樟芝菌 丝体发酵方法，其培养至发酵的步骤，请参阅第图7所示，包括A、取当归川芎熟地黄白芍=1 5 1 5 1 5 1 5种类以及重
量比例。B、用水煎煮萃取后过滤，过滤后药材的药渣备用；萃取温度可以选择为 50-150°C，2-5 小时。C、取药渣并为脱水，成为固形物；滤液可以供其它药品使用。该固形物仍然可以保 持部分水分于占固型量1_30%。该水分由于微量，仍然界定于该固形物的范围。D、混入碳酸钙，该碳酸钙固形物重量=1 5% 100%混入米糠，该米糠固 形物重量=1 30% 100%混入蛋白胴(ρ印tone)，该蛋白胴(ρ印tone)固形物重量= 1 5% 100%E、经灭菌后，该中间制备物加入樟芝菌丝体菌液，其重量比例中间制备物樟芝 菌丝体菌液=1 50 1 ；可以利用机器充填至发酵瓶。灭菌条件可以设为121°C，1_5小 时。F、发酵其发酵条件为温度15-50°C湿度30_95%培养天数7_50天；取得樟芝四物药 材。该培养较佳是在无尘室里(Hepa)中进行。即可得到发酵后的樟芝四种药材(后简称 为「樟芝四物」)。
本发明的樟芝四种药材，可以利用以下几种萃取液来达到萃取目的，例如第一种 萃取液为水酒精=100% 0%、第二种萃取液为水酒精=50士3% 50士3%、第三种 萃取液为水酒精=5士3% 95士3%，而经过实验证实，以第三种萃取液为较佳。至于 本发明实验过程，可以容许第一种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度=1 30ml lg； 第二种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度=1 30ml Ig ；第三种萃取液与该樟芝四 物药材的萃取浓度=1 30ml Igo该樟芝四物药材由第一种萃取液与该樟芝四物药 材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材第一种萃取液1 30g Iml;该樟芝四物药材由 第二种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材第二种萃取液1 30g Iml ；该樟芝四物药材由第三种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材第三种萃取液1 30g Iml0水及水酒以70-100°C萃取1_3小时，95%酒 精则以浸渍或超音波震荡方式萃取，浸渍方式为24-48小时，超音波的话为1-3小时。而本发明是一种以四物中药材培养樟芝菌丝体发酵方法，其步骤包括:A、取当 归川芎熟地黄白芍=1 5:1 5:1 5:1 5种类以及重量比例；B、 用水煎煮萃取后过滤，过滤后药材的药渣备用；C、取药渣并为脱水，成为固形物；D、混入 碳酸钙，该碳酸钙固形物重量=1 5% 100% ；混入米糠，该米糠固形物重量= 1 30% 100% 混入蛋白胴(P印tone)，该蛋白胴(ρ印tone)固形 物重量=1 5% 100% ;E、经灭菌后，该中间制备物加入樟芝菌丝体菌液，其重量比例为中间制备物 樟芝菌丝体菌液=1 50 1;F、发酵其发酵条件为温度15-50°C湿度30-95%培养天 数7-50天；取得樟芝四物药材。而本发明是一种以四物中药材培养樟芝菌丝体发酵的樟芝四物药材萃取方法， 其特征在于，该以四物中药材培养樟芝菌丝体发酵方法，其萃取液系选自第一种萃取液为 水酒精=100% 0%，第二种萃取液为水酒精=50士3% 50士3%第三种萃取液为 水酒精=5士3% 95士3%的一萃取液萃取。该第一种萃取液与该樟芝四物药材的萃取 浓度=1 30ml Ig;第二种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度=1 30ml Ig ；第 三种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度=1 30ml Igo该樟芝四物药材由第一种萃 取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材第一种萃取液1 30g Iml ； 该樟芝四物药材由第二种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材 第二种萃取液1 30g Iml ；该樟芝四物药材由第三种萃取液与该樟芝四物药材中以真 空减压浓缩至樟芝四物药材第三种萃取液1 30g Iml0值得一提的是，真空减压浓缩的原理主要系利用标准状况下，若大气压力降低时， 沸点也会呈现以倍数的比例降低，使溶剂在较低的温度(低于溶剂沸点)甚至是常温时， 即沸腾蒸发成气体，且在另一端冷凝成液态溶剂，而溶质由于沸点远大于溶剂，因而留在热 端，当溶剂量减少但溶质量不变时，则浓度就提高(浓缩)了，旨在移除溶液中多余的溶剂， 或是溶质在高温时容易分解，则采用此法，相当于减压蒸馏的原理。实验结果体外试验(细胞试验)结果参见下表 分别取三种萃取液(a 水萃、b :95%酒精、c 水酒(50% ))进行抑制血小板凝集 及癌细胞毒杀能力试验(三种癌细胞，肝癌、肺癌及乳癌)，其结果得知四物药材培养樟芝 以95%酒精萃取后，其抑制癌细胞能力的效果最佳。体内试验(动物小鼠试验)参见图1，樟芝四物(J20)萃取液能有效抑制癌细胞生 长，使得患有肝癌细胞的小鼠存活率提高。樟芝四物(J20)萃取液对肝癌细胞株有抑制作用，可抑制癌细胞的体积增大，图2 为喂食第17天后，对照组(PBS)与实验组(J20)的肝癌细胞体积的大小。图中横线为代表 平均值。该对照组(PBS)为磷酸缓卫溶液(phosphate-buffered Saline)，功用为类似生理 食盐水，以便作为常态的比较组。请参阅图3所示，显示利用本发明实施于老鼠，而灌食樟芝四物药材萃取物的老 鼠(第十七天)，肝癌细胞已明显缩小。请参阅图4所示，未灌食樟芝药材萃取物的老鼠(第十七天)，肝癌细胞体积未见缩小。请参阅图5所示，显示肝癌增生细胞的KI-67抗体染色，未喂食前，图中的红点为 肝癌增生细胞与KI-67抗体染色的后所产生。请参阅图6所示，喂食樟芝四物(J20)萃取物后，可以发现KI-67抗体与肝癌增生 细胞产生的红点已明显减少，代表细胞未有肝癌的增生细胞大量产生。另外也证明此萃取 液对正常细胞并也毒杀作用。
权利要求
抑制癌细胞株的中药制剂，其特征在于以包括当归、川芎、熟地黄、白芍所混合的四物中药材培养樟芝菌丝体发酵，并由萃取方法所取得。
2.如权利要求1所述的抑制癌细胞株的中药制剂，其特征在于该四物中药材培养樟芝 菌丝体发酵方法，其培养至发酵的步骤包括A、取当归川芎熟地黄白芍为1 5 1 5 1 5 1 5种类以及重量比例；B、用水煎煮萃取后过滤，过滤后药材的药渣备用；C、取药渣并为脱水，成为固形物；D、混入碳酸钙，该碳酸钙固形物重量为1 5% 100%;混入米糠，该米糠固形物 重量为1 30% 100%混入蛋白胴(ρ印tone)，该蛋白胴(ρ印tone)固形物重量为1 5% 100%E、经灭菌后，该中间制备物加入樟芝菌丝体菌液，其重量比例为中间制备物樟芝菌丝 体菌液为1 50 1 ；F、发酵其发酵条件为温度15-50°C湿度30-95%培养天娄7_50天；取得樟芝四物药材。
3.如权利要求1所述的抑制癌细胞株的中药制剂，其特征在于该樟芝四物药材的萃取 系选自第一种萃取液为水酒精为100% 0% ； 或第二种萃取液为水酒精为50士3% 50士3% ； 或第三种萃取液为水酒精为5士3% 95士3% ； 之一的萃取液萃取。
4.如权利要求3所述的抑制癌细胞株的中药制剂，其特征在于 第一种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度为1 30ml Ig ； 或第二种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度为1 30ml Ig ； 或第三种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度为1 30ml Igo
5.如权利要求4所述的抑制癌细胞株的中药制剂，其特征在于该樟芝四物药材由第一种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药 材第一种萃取液1 30g Iml ；该樟芝四物药材由第二种萃取液与该樟芝四物药材中 以真空减压浓缩至樟芝四物药材第二种萃取液1 30g Iml ；该樟芝四物药材由第三 种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至发酵物第三种萃取液1 30g Iml0
6.抑制癌细胞株的中药制剂的方法，其为一种以四物中药材培养樟芝菌丝体发酵方 法，其步骤包括A、取当归川芎熟地黄白芍为1 5 1 5 1 5 1 5种类以及重量比例；B、用水煎煮萃取后过滤，过滤后药材的药渣备用；C、取药渣并为脱水，成为固形物；D、混入碳酸钙，该碳酸钙固形物重量为1 5% 100%;混入米糠，该米糠固形物 重量为1 30% 100% 混入蛋白胴(P印tone)，该蛋白胴(ρ印tone)固形物重量为 1 5% 100% ；Ε、经灭菌后，该中间制备物加入樟芝菌丝体菌液，其重量比例为中间制备物樟芝菌 丝体菌液为1 50 1 ；F、发酵其发酵条件为温度15-50°C湿度30-95%，培养天数7_50天；取得樟芝四物药材。
7.如权利要求6所述的一种以四物中药材培养樟芝菌丝体发酵方法，其特征在于该樟 芝四物药材的萃取系选自第一种萃取液为水酒精为100% 0% ；或第二种萃取液为水酒精为50士3% 50士3% ；或第三种萃取液为水酒精为5士3% 95士3%之一的萃取液萃取。
8.如权利要求7所述的一种以四物中药材培养樟芝菌丝体发酵方法，其特征在于该第一种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度为1 30ml Ig ；第二种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度为1 30ml Ig ；第三种萃取液与该樟芝四物药材的萃取浓度为1 30ml Igo
9.如权利要求8所述的一种以四物中药材培养樟芝菌丝体发酵方法，其特征在于该 樟芝四物药材由第一种萃取液与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材第 一种萃取液1 30g Iml ；该樟芝四物药材由第二种萃取液与樟芝四物药材中以真空减 压浓缩至樟芝四物药材第二种萃取液1 30g Iml ；该樟芝四物药材由第三种萃取液 与该樟芝四物药材中以真空减压浓缩至樟芝四物药材第三种萃取液1 30g Iml0
全文摘要
本发明是关于一种抑制癌细胞株的中药制剂及其制备方法，主要是以中药材中所混合的四物中药材培养樟芝菌丝体发酵，并由萃取方法所取得作为抑制癌细胞株的中药制剂，并且关于其制备方法中的发酵以及萃取，提供较佳的方法。
文档编号A61K36/804GK101837027SQ20091011985
公开日2010年9月22日 申请日期2009年3月20日 优先权日2009年3月20日
发明者林嘉镇 申请人:华昌制药生化科技股份有限公司