专利名称：用于抑制癌细胞生长的含安卓幸的药学组成物的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种含式I化合物-安卓幸且可用于抑制癌细胞生长的药学组成物。
背景技术：
癌症一般可以视为恶性肿瘤，是一种疾病。其特征为恶性组织的不正常团块，起因于过度地细胞分裂。癌症细胞不具有正常细胞生长的限制，会侵入与占领正常留给其它细胞的范围。癌症治疗的种类包括化学治疗、手术、放射线以及这些治疗的结合。化学治疗通常包括使用一个或多个抑制癌细胞生长的化合物。虽然目前已经发展了许多癌症化疗药剂，但仍然需要更有效的化学治疗。
发明内容
本发明是基于发现式I化合物-安卓幸或其医药上可接受的盐，其可用于抑制癌细胞生长，甚至治疗或预防癌症，特别是乳癌。具体地，本发明是提供一种用于抑制癌细胞生长，甚至治疗或预防癌症的药学组成物，包括有效量的式I化合物-安卓幸或其医药上可接受的盐，与医药上可接受的载体。本发明是提供一种用于抑制癌细胞生长的药学组成物为主，经实验证实式I化合物-安卓幸对不同癌症细胞株(包括大肠直肠癌细胞-HT-四或HCT116 ；肝癌细胞株-Huh7 ；肺腺癌细胞株-A549及乳癌细胞株-MCF7或MDAMB231)具高度抑制性，但对正常细胞(包括纤维母细胞-HS68及正常乳腺上皮细胞-MCF10A)则几乎不具细胞毒性；再者， 经与癌症临床化学治疗药物(艾霉素(Doxorubicin)及顺钼(Cisplatin))进行对照实验， 评估式I化合物-安卓幸、艾霉素、顺钼对恶性乳癌细胞(MDA-MB-231)的相对抑制效果，实验证实在相同的使用剂量下，式I化合物-安卓幸抑制恶性乳癌细胞(MDA-MB-231)的效果优于艾霉素、顺钼，故其甚至可用于治疗或预防癌症。式I化合物-安卓幸可拥有一或多个对称中心，因此具有各种立体异构物形式。本发明中提及的式I化合物包括所有此等异构物。式I化合物具有选择性抑制癌症细胞生长的功效。由于其分子量极小，因此，可使用较低剂量的式I化合物及其医药上可接受盐，与医药上可接受载体，即可得到渴望的治疗效果。本发明为一抑制癌细胞生长，甚至治疗或预防癌症的药学组成物，是将一有效量的式I化合物及其医药上可接受盐，用于抑制癌细胞、 或投予所需的病患(此病患具有癌症、癌症的症状或倾向于癌症的体质)以治愈、恢复、减轻、缓和、改变、治疗、改善、改进或影响疾病、疾病的症状或倾向于疾病的体质为目的。此处使用的“有效量(an effective amount) ”指有效量的式I化合物-安卓幸及其医药上可接受盐，具有抑制或治疗功效的量。有效量的改变是根据给药的途径、辅药使用(excipient usage)以及与其它共同使用(co-usage)的活性药剂。此处的“癌症”意指细胞肿瘤。癌症细胞具有自主生长(autonomous growth)的能力，即在不正常的状态或条件下迅速增殖细胞生长。此处所指的癌症是包含所有种类的细胞不当增生(cancerous growth)或致癌过程(oncogenicprocesses)、转移性的组织或恶性转换的细胞、组织或器官(与组织病理学型态无关)或侵入阶段。癌症的例子包括，但不限定于癌症(carcinoma)与恶性肉瘤(sarcoma)，例如乳癌(breast cancer)、血癌(leukemia)、恶性肉瘤(sarcoma)、淋巴瘤(lymphomas)、恶性骨肉瘤(osteosarcoma)、 神经胶质瘤(glioma)、嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma)、肝恶性肿瘤(h印atoma)、黑色素瘤(melanoma)卵巢癌(ovarian cancer)、皮肤癌(skin cancer)、大肠癌(colorectal cancer)、胃· (gastriccancer) > I^lftfg (pancreatic cancer) > l^lftfg (renal cancer) > 前列腺癌(prostatecancer)、罩丸癌(testicular cancer)、头部与颈部的癌症、脑癌 (brain cancer) >^ilfg (esophageal cancer) >If Iffg (bladder cancer) > W-tl/li^Mlg (adrenal corticalcancer)、月市癌(lung cancer)、支气管癌(bronchus cancer)、子宫内月莫 (endometrialcancer) >^-BifS (nasopharyngeal cancer)、〒宫、月干(cervical or liver cancer)或未知起始位置的癌症。 式I化合物-安卓幸是以有机溶剂萃取牛樟椴木培养成长中的牛樟芝(一真菌类)，并经硅胶管柱分离纯化制备而得；或另以化学合成方法制备而得。例如由“牛樟椴木培养成长中的牛樟芝萃取”指自较适成长程度的牛樟芝所萃取出的牛樟芝萃取物。为取得该牛樟芝萃取物，可使用本技术领域中众所周知的萃取技术。例如可将经干燥与研磨的该牛樟芝悬浮在一溶剂或者两种或多种溶剂的混合液于一足够长的时间。适合的溶剂的例子包括，但不限定为水、甲醇、乙醇、二氯甲烷(methylene chloride)、三氯甲烷 (chloroform)、丙酮(acetone)、醚类(ether)(例如乙醚(diethyl ether))与乙酸乙酯酯类(ethyl acetate)与己烷(hexane)。之后移除固体残余物(例如通过过滤)得到该牛樟芝萃取物溶液，其可经硅胶管柱纯化制备得式I化合物-安卓幸。基本上，全世界近二十余年在牛樟芝所含天然化合物的研究，除多醣体等大分子外，总共发表了七十八个小分子化合物，其中包括三十一个三萜类化合物且大都有相关药理活性研究报告，尤其着重在该等的抗癌活性，惟三萜类化合物各别分子仍须在较高使用量，才能达到癌症临床化学夕台？？！^·白勺S^ItGeethifflgiIi M andTzeng YM, Review of pharmacological effects of Antrodia camphorata and itsbioactive compounds. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, published online on Aug. 17,2009 ；doi :10. 1093/ecam/ η印108。但是，式I化合物-安卓幸自1995年首度报导在牛樟芝中被发现后Chiang HC, Wu DP, CherngIff, Ueng CH. A sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds fromAntrodia cinnamomea. Phytochemistry, 1995 ；39 :613-616],迄今十五年间，未再有任何相关报导，其药理活性报告亦付诸缺如。究其原因乃该式I化合物-安卓幸在一般的牛樟芝子实体含量颇低而不易分离取得，本发明在特定成长程度的牛樟芝中可经萃取分离纯化而制备取得。同时，本发明发现式I化合物-安卓幸对不同癌症细胞株(包括 大肠直肠癌细胞-HT-四或HCT116 ；肝癌细胞株-Huh7 ；肺腺癌细胞株-A549及乳癌细胞株-MCF7或MDAMB231)具高度抑制性，但对正常细胞(包括纤维母细胞-HS68及正常乳腺上皮细胞-MCF10A)则几乎不具细胞毒性；再者，经与癌症临床化学治疗药物(艾霉素及顺钼)进行对照实验，评估式I化合物-安卓幸、艾霉素、顺钼对恶性乳癌细胞(MDA-MB-231) 的相对抑制效果，实验证实在相同的使用剂量下，式I化合物-安卓幸抑制恶性乳癌细胞 (MDA-MB-231)的效果优于艾霉素、顺钼，故其甚至可用于治疗及/或预防癌症。在此必须再强调的是式I化合物-安卓幸乃是牛樟芝所含各种天然化合物中，惟一经实验证实抑制癌细胞效果较诸癌症临床化学治疗药物(艾霉素及顺钼)为优的牛樟芝所含天然化合物。在本发明的治疗方法中，式I化合物-安卓幸或其医药上可接受的盐类可同时给药或分开给药，以口服、非口服、经由吸入喷雾(inhalation spray)或通过植入贮存器(implanted reservoir)的方式。此处所使用的“非口服”指皮下(subcutaneous)、 皮内(intracutaneous) ■ 1 内(intravenous)、月JL 肉内(intramuscular)、关节内 (intraarticular)云J] (intraarterial), if M ( )内(intrasynovial) > 1 # (intrasternal)蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位内(intraleaional)与头颅内 (intracranial)注射以及灌注技术。本发明所使用式I化合物-安卓幸及/或其医药上可接受的盐类可与至少一种固体、液体或半液体状的赋形剂或辅助剂一同形成适当的药剂形式。其形式包括，但不限定于，药锭、胶囊、乳剂(emulsions)、水性悬浮液(aqueoussuspensions)、分散液 (dispersions)与溶液。药锭一般所使用的载体(carrier)包括乳糖与玉米淀粉。一般也将润滑剂(lubricating agent)，例如硬脂酸镁(magnesiumstearate)加至药锭中。用于胶囊形式的稀释剂(diluents)包括乳糖与经干燥的玉米淀粉。当口服给药为水性悬浮液或乳剂时，可悬浮或溶解有效成分(activeingredient)于与乳化或悬浮剂结合的油相(oily phase)。如果需要，可加入特定甜味、调味与着色剂。本发明所使用的式I化合物-安卓幸或其医药上可接受的盐类亦可配制成无菌注射成分(例如，水或油的悬浮液)，例如利用本技术领域中已知的技术使用适合的分散或增湿剂(例如Tween 80)与悬浮剂。无菌注射调剂也可以将无菌注射溶液或悬浮液加入无毒性非口服的稀释剂或溶剂，例如1，3 丁二醇(l，3-BUtanediol)中。可使用的载具 (vehicles)与溶剂包括甘露醣醇(mannitol)、水、林格氏液(Ringer’ s solution)与等渗透压氯化钠溶液。此外，无菌、固定油常作为溶剂或悬浮媒介(例如合成的单-或双-甘油酯(glycerides))。脂肪酸，例如油酸(oleic acid)与其甘油酯衍生物亦可用在注射剂的调制，其为天然药学上可接受的油，例如橄栏油、蓖麻油(castor oil)，特别是于其聚氧乙基化的(polyoxyethylated)变化形式。这些油溶液或悬浮液也可包含一长链醇类稀释剂或分散剂，或者羧基甲基纤维素(carboxymethyl cellulose)或类似的分散剂。本发明所使用的式I化合物-安卓幸或其医药上可接受的盐类亦可根据此技术领域中所熟知的技术来配制成吸入成分。例如可制成盐类溶液，利用苯甲醇(benzyl alcohol)或其它适合的防腐剂、增强生物可利用性(bioavailability)的吸附促进剂、碳氟化合物(fluorocarbon)或其它本技术领域中熟知的助溶或分散剂来配制。用于药学组成物的载体必须是“可接受的”，其与配方的有效成分兼容(以及较佳为具有稳定有效成分的能力)以及不对病患有害。例如，助溶剂(例如环状糊精(cyclodextrins))(其与一个或多个萃取物的活性化合物形成特定更可溶解的复合物)，为了有效成分的传送而作为药理学上的辅药。其它载体的例子包括胶状二氧化硅(colloidal silicon dioxide)、硬脂酸镁、纤维素与烷基硫酸盐(sodium Iauryl sulfate)0另外，由于抗癌剂如以高剂量投予病患易产生毒性。是以，本发明医药组合物为含有安全有效量的式I化合物-安卓幸，用于抑制癌细胞生长，其中该安全有效量为0. 01 μ M至1000 μ Μ,较佳为0. 5 μ M至50 μ Μ。施予个别病人的特定剂量是依所有可能存在因素而定，例如所使用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、进食状况、施用时间与路径、排泄率、医药物质的组合、以及所欲治疗的疾病的严重程度等。
图1、以SRB分析评估式I化合物-安卓幸对不同癌症细胞株(包括大肠直肠癌细胞-HT-四或HCTl 16 ；肝癌细胞株-Huh7 ；肺腺癌细胞株-A549及乳癌细胞株-MCF7或 MDAMB231)的细胞毒性；图2、以SRB分析评估式I化合物-安卓幸对正常细胞(包括纤维母细胞-HS68 及正常乳腺上皮细胞-MCF10A)的细胞毒性；图3、以SRB分析比较式I化合物-安卓幸及癌症临床化学治疗药物(艾霉素及顺钼)评估对恶性乳癌细胞(MDA-MB-231)的细胞毒性；图4、式I化合物-安卓幸造成恶性乳癌细胞株(MDA-MB-231)的细胞型态改变；图5、式I化合物-安卓幸造成恶性乳癌细胞株(MDA-MB-231)的细胞周期改变并造成sub Gl期的细胞增多。
具体实施例方式为了让本发明的上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，作详细说明如下实施例一、式I化合物-安卓幸的制备将选取的牛樟芝经过冷冻干燥后粉碎，以甲醇热回流萃取后，将其过滤分别得到沉淀物以及甲醇萃取液两部分。将甲醇萃取液经过减压浓缩成黏稠状后，再利用氯仿和水萃取后，将氯仿层加入适量的硅胶共同减压浓缩至粉末后，填入硅胶管柱上端，进行硅胶管柱层析，纯化制备式I化合物-安卓幸。实施例二、生物活性分析方法1.冷冻细胞的活化冷冻细胞的活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞的死亡。细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。冷冻的细胞快速解冻的方法为将冷冻管由液氮或干冰容器中取出，立即放入37°C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在3分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管的外部，移入无菌操作台内。取出解冻的细胞悬浮液，缓缓加入有培养基的培养容器内(稀释比例为1 10-1 15)，混合均勻，放入C02培养箱培养。在解冻培养后隔日更换培养基。2.人类乳癌细胞的培养此实验选用三种不同的人类乳癌细胞株，分别为正常乳腺上皮细胞(MCF10A cells)、人类乳癌前细胞(MCF-7 cells)及人类恶性乳癌细胞(MDA-MB-231 cells)。 MDA-MB-231细胞株培养于5%胎牛血清(FBQ、2mM麸酰胺酸(glutamine)，100 μ g/ml链霉素(sti^ptomycin)禾口 100U/ml 盘尼西林(penicillin)的 DMEM(Dulbecco ‘ s Modified Eagle' s Medium)培养基中；MCF-7细胞株培养于5%胎牛血清、2mM麸酰胺酸，100 μ g/ml链霉素和100U/ml盘尼西林、0. 01mg/ml胰岛素(insulin)的DMEM培养基中；MCFlOA细胞株培养于5%马血清(Horse Serum)、肌肤表皮生长因子(EGF)(最终浓度20ng/ml)、氢羟肾上腺皮质素(Hydrocortisone)(最终浓度0. 5mg/ml)、霍乱毒素(Cholera Toxin)(最终浓度100ng/ml)、胰岛素(最终浓度10 μ g/ml)、4mM麸酰胺酸、100 μ g/ml链霉素和100U/ml 盘尼西林、0. 01mg/ml胰岛素的DMEM培养基中。以上MDAMB231及MCF7两种细胞以10%胎牛血清作继代培养。细胞株放置于37°C，5% C02，湿度95%的培养箱中培养。3.细胞药物处理所有实验的细胞皆培养于含10%胎牛血清的培养液中，待细胞长到约八成满时， 将旧培养液抽干并以PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)溶液清洗细胞后，加入10毫升不含血清的培养液。依实验目的不同加入不同的药物，于37°C恒温培养箱中进行反应。4、细胞毒性实验(cytotoxicity)将恶性乳癌细胞(MDA-MB-231 cells)、人类乳癌前细胞(MCF-7cellS)及正常乳房上皮细胞(MCF10A cells)放置于96孔培养盘(cultur印late) (2000细胞/孔)，以及将其隔夜培养于100 μ 1的完全DMEM中。将50 μ 1包含式I化合物-安卓幸(0. 5-10 μ Μ)的完全DMEM等量样品加入培养盘的不同孔中。另外，控制组则只加入100 μ 1的完全DMEM。于培养2天之后，以磺酰罗丹明Bkulforhodamine B)(—蛋白质结合染剂)分析测定每孔中的细胞数目。简单地说，固定细胞于10%三氯醋酸(trichloroacetic acid)中，与以0.4% 磺酰罗丹明B将其染色。染色20分钟后再以乙酸清洗，之后，将与细胞结合的磺酰罗丹明B溶解于IOmM的Tris base中。以微量滴定盘检测器(microtiter plate reader)在 562nm下测定吸光值(optical density)。上述的方法亦用来测试Huh7肝癌细胞、A549肺肿瘤细胞与HD9及HCT116大肠癌细胞株等细胞对式I化合物-安卓幸的敏感性。5.细胞型态变化的分析细胞凋亡(apoptosis)与细胞坏死(necrosis)在型态学上有很大的差异，特征有细胞萎缩、脱落，染色质浓缩等现象。将恶性乳癌细胞(MDA-MB-231)放置于petri dish培养盘(皮氏培养皿)，待细胞贴底后，给予适当包含式I化合物-安卓幸(0.5-10 μ M)的药物浓度，至于培养箱中一段时间后，以倒立显微镜观察细胞型态，并拍照记录。6.细胞周期与细胞凋亡检测恶性乳癌细胞(MDAMB231)经式I化合物-安卓幸处理后，以胰蛋白-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA)处理细胞，与培养液一起收集，离心后去掉上清液，并以4°C磷酸盐缓冲液清洗后，加入1毫升冰冷的75%酒精，放入4°C冰箱过夜，以固定细胞。离心后，续以1 毫升磷酸盐缓冲液悬浮，加入适量的核糖核酸A(RNase A)，于37°C作用30分钟，最后加入 40mg/ml 的碘化丙锭(propidium iodide) (PI, Sigma Chemical Co. , cat. No P-4170)避光作用半小时，以35mm尼龙网(nylon mesh)过滤后，以495nm波长激发后，于637nm波长侦测细胞荧光含量，以流式细胞仪进行分析。实施例三、生物活性测定的结果1.式I化合物-安卓幸可抑制不同肿瘤细胞的生长。挑选不同肿瘤细胞株包括大肠直肠癌细胞-HT-29或HCT116 ；肝癌细胞株-Huh7 ；肺腺癌细胞株-A549及乳癌细胞株-MCF7或MDAMB231来探讨式I化合物-安卓幸对不同癌细胞的毒杀作用。结果发现式I化合物可显著抑制不同肿瘤细胞的生长，对肿瘤细胞所造成的半抑制浓度(IC50值)分别介于0.6 4.5μΜ之间，其中又以对恶性乳癌细胞(MDA-MB-231 cells)的毒杀效果最强(图1)。值得注意的是，以纤维母细胞(HS68) 及正常乳腺上皮细胞(MCF10A cells)进一步分析式I化合物对正常细胞生长的影响，则发现式I化合物并不会造成两株正常细胞的生长抑制(图2)。由此得知，式I化合物-安卓幸的确具有选择性毒杀癌细胞的能力，其中又以乳癌的毒杀效果最为显著。2.式I化合物-安卓幸与化学治疗药物艾霉素及顺钼的比较利用SRB的方法来比较式I化合物-安卓幸、艾霉素与顺钼对于恶性乳癌细胞 (MDA-MB-231 cells)的效用。艾霉素与顺钼为市面上常使用的抗乳癌药物之一，艾霉素主要是嵌入DNA的含氮盐基中与DNA形成复合物、抑制聚合胸的活性，或是借着产生具有毒性的超氧游离根攻击DNA，都可影响癌细胞合成DNA ；顺钼的作用机转主要以共价键键结至癌细胞的DNA，造成双股DNA间交互连结，进而抑制肿瘤细胞DNA合成。在投与药物48小时后，在比较发现艾霉素在5 10 μ M之间，对于恶性乳癌细胞(MDA-MB-231 cells)维持了 60-70%的毒性，而式I化合物在浓度5 μ M以上毒性却比艾霉素高，在10 μ M竟高于30%。 顺钼对于恶性乳癌细胞(MDA-MB-231 cells)在5 μ M的浓度下细胞毒性与控制组相差无几，在10 μ M才有30%的毒性(图3)。3.式I化合物-安卓幸对恶性乳癌细胞及正常乳腺上皮细胞生长的影响。由实验结果得知式I化合物-安卓幸的确对乳癌细胞具有较佳的抑制作用。因此进一步将恶性乳癌细胞(MDA-MB-231 cells)、人类乳癌前细胞(MCF-7 cells)及正常乳房上皮细胞(MCF10A cells)利用Sulforhodamine B (SRB assay)分析的方法测定式I化合物对于细胞生长的影响。SRB分析法的原理是利用染剂(Sulforhodamine B, SRB)与细胞质蛋白质的碱性氨基酸键结而呈色，主要用于量测细胞的增生与存活率。结果发现，投与药物48 小时后，恶性乳癌细胞株(MDAMB231)及人类乳癌前细胞(MCF7)随着式I化合物浓度的上升其细胞毒性显著增加，在式I化合物浓度1 μ M处理下分别可抑制80%及60%细胞存活率(表一及表二)。而正常乳腺上皮细胞(MCFlOA)的细胞存活率并未随着式I化合物浓度的增加而有所影响(表三)。故由此可知式I化合物-安卓幸对于恶性乳癌细胞(MDAMB231 及人类乳癌前细胞(MCF7)有很高的细胞毒性反而对于正常乳腺上皮细胞(MCFlOA)并无太高的细胞毒性。表一为以SRB(Sulforhodamine B)分析评估式I化合物-安卓幸对恶性乳癌细胞(MDAMB231)的细胞毒性。表二为以SRB分析评估式I化合物-安卓幸对恶性乳癌细胞(MCF7)的细胞毒性。表三为以SRB分析评估式I化合物-安卓幸对正常乳腺上皮细胞(MCFlOA)的细胞毒性。表一、以SRB分析评估式I化合物对恶性乳癌细胞(MDAMB231)的细胞毒性
权利要求
1. 一种用于抑制癌细胞生长的药学组成物，其特征在于，包括有效量的式I化合物-安卓幸或其医药上可接受的盐，与医药上可接受的载体。
2.如权利要求1所述的药学组成物，其特征在于，可治疗或预防癌症。
3.如权利要求1所述的药学组成物，其特征在于，其中癌细胞包括大肠直肠癌细胞-HT-四或HCT116 ；肝癌细胞株-Huh7 ；肺腺癌细胞株-A549或乳癌细胞株-MCF7或
4.如权利要求2所述的药学组成物，其特征在于，所述癌症包括乳癌、血癌、恶性肉瘤、 恶性骨肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤、嗜铬细胞瘤、肝恶性肿瘤、卵巢癌、皮肤癌、睪丸癌、胃癌、胰脏癌、肾脏癌、前列腺癌、大肠癌、头部与颈部的癌症、脑癌、食道癌、膀胱癌、 肾上腺皮质癌、肺癌、支气管癌、子宫内膜癌、鼻咽癌、子宫颈癌、肝癌或未知起始位置的癌症。
5.如权利要求1所述的药学组成物，其特征在于，所述式I化合物-安卓幸是以有机溶剂萃取牛樟椴木培养成长中的牛樟芝，并经硅胶管柱纯化制备而得。
6.如权利要求1所述的药学组成物，其特征在于，所述式I化合物-安卓幸的安全有效量为 0. ΟΙμΜ至 1000 μ Mo
7.如权利要求6所述的药学组成物，其特征在于，所述式I化合物-安卓幸的安全有效量较佳为0. 5 μ M至50 μ Μ。MDAMB231。
全文摘要
本发明是关于一种用于抑制癌细胞生长的药学组成物，该组成物包含有效量的式I化合物-安卓幸(Sesquiterpene lactones，antrocin)或其医药上可接受的盐，与医药上可接受的载体(carrier)。
文档编号A61K31/365GK102204902SQ201010155329
公开日2011年10月5日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者叶淇台, 曾耀铭, 杨天生 申请人:朝阳科技大学