专利名称：制备琥珀酸的方法
制备琥珀酸的方法本发明涉及制备广泛用于医药、营养和化妆品工业的生物学活性琥珀酸(H K) 的方法。琥珀酸是植物和动物的所有活有机体能量循环中必不可少的代谢物之一，在动物的有机体中，琥珀酸与孤独受体协作还提供许多信号功能。从15世纪开始就已知琥珀酸的医药性质，并且首先记载在1493年的亚美尼亚 AMacHauH 药典中(见 AMacHauH Α.ΗθηΥ>κηο e fl jt π
HeyHeH(CpeflHeBeKC)B ω 9Hu;HKJToneflHMecKHfi
C JT ο β a ρ L· )，http://libbox. info/book_reading_91900. html) [1] ο琥珀酸具有许多性质“催化地”促进能量交换活化，并具有强心、辐射防护、轻微利尿作用。但是实验指出“天然”(得自琥珀)和通过各种方法合成的琥珀酸在它们的生物学活性方面是不同的。合成样品主要具有明显的利尿性质以及一定程度的增能性质。我们进行了许多可以充分地确定琥珀酸的生物学活性的实验，其中有为所得的产物提供技术对照的那些实验。我们检查了通过各种技术获得的多于150种的样品。由于缺少允许揭示样品间差异的物理化学方法，所以我们研发了和应用了可靠地测量生物学活性的生物学测试。已知几种琥珀酸的制备方法，它们使用不同种类的原料首先是马来酸酐、马来酸、丁二烯橡胶、糠醛等。通常，这些发明人都未公开琥珀酸的生物学活性水平。“揭示不同种类的生物学活性”的琥珀酸制备方法(俄罗斯专利2236398号[2]和 2098804号[3])基于用过氧化氢将糠醛氧化，在可变的pH值(< 4_7)下添加碱性试剂，然后通过中和、蒸发及从丙酮和水中重结晶将产物纯化以除去痕量的马来酸、富马酸和草酸。 由于明显复杂的合成技术(步骤多，并且使用可燃的有机溶剂，这要求特别的操作条件)以及必需重结晶的额外阶段，所以几乎不实现本申请所公开的产率(90% )。用该方法得到的琥珀酸的生物学活性是有限的根据进行的测试，这种酸主要是利尿剂。此外，所述方法未产生满足食品安全要求的产物产物含有大量有害杂质。还有许多在升高的温度和压力下，通过马来酸酐(马来酸)的液相催化还原制备琥珀酸的方法。已知的琥珀酸制备方法中所用的催化剂是元素周期表中VIII族的金属(镍、钌、 钯、铑或钼)，它们为骨架接触或施用在各种载体上(活性炭、氧化铝、硅藻土、石棉等)的形式。所有这些方法的共同缺点是与高含量的贵金属接触，并且每单位重量活性组分的
产率不高。用上述方法获得的琥珀酸的生物学活性的数据尚未在专利中出现。在俄罗斯专利2129540号[4]中，在含钯的载体催化剂的存在下，并使用钯-镍或钯-铁催化接触，在水中进行马来酸酐或马来酸的氢化。该方法允许实现琥珀酸的高产率(高达99.7% )，并且实现高生产率和高质量(熔点为186. 8-187°C，主要物质含量高达 99. 8% ；无杂质马来酸和富马酸)。
根据我们的测试，该方法的缺点是通过氢化制备的高纯琥珀酸的生物学活性不同于通过琥珀碎屑的热解得到的天然琥珀酸的生物学活性。最接近本发明的方法的是高纯度的生物学活性琥珀酸的制备方法，所述方法通过以下步骤进行在水性介质中，于非均相催化剂上将马来酸酐(马来酸或富马酸)氢化，该催化剂的活性相是钯和铁与琥珀酸、马来酸或富马酸或它们的碱性盐的配合化合物(俄罗斯专利2237056号)[5]。制备配合物形式催化剂的方法包括一定的条件下的几个连续混合各种催化剂成分的阶段。将催化配合物在它们形成时施用于载体上。通过这种方法获得的琥珀酸的生物学性质类似于天然琥珀酸的生物学性质。这种方法的缺点是要求单独的初步多阶段步骤以合成催化剂，其包括-制备3-4种初始溶液；-使载体材料成为浆液；-在pH检测下连续定量给料初始溶液；-定量给料每种初始溶液后保持在一定的温度下；-过滤催化剂悬浮液；
-在滤器上洗涤催化剂；-将催化剂干燥至一定的残留水分。由于这些复杂的步骤会遇到这样的问题在从实验室转换至工业装置以及不同类型的装置上获得的琥珀酸的生物学活性不稳定(见本申请实施例13所述技术的测试结果)。低于60%的实验室合成的琥珀酸样品具有生物学活性。在根据上述步骤合成的工业生产样品中，仅12%的批次具有合适的生物学活性。本申请的目的是改进琥珀酸的制备方法，从而产物会具有高纯度，同时具有稳定的生物学活性和适应原性活性。本发明的目的通过以下方法实现⑴通过催化剂的初步分离消除催化剂合成的分离阶段；(2)改进(简化)获得氢化催化剂的步骤；和(3)在结晶阶段施用晶种，该晶种应当是具有高生物学活性的琥珀酸。换言之，我们要求保护一种制备具有稳定的高生物学活性和适应原性活性的琥珀酸的方法，所述方法包括利用酸制备改性的含钯催化剂、于升高的温度和压力下在所述改性的催化剂上进行不饱和酸化合物的液相氢化、然后分离所述催化剂以及琥珀酸，所述方法的特征在于所述改性于无氧气氛下，在琥珀酸、马来酸或富马酸和/或它们的混合物的 Pd2+/酸比率为1 1-1 100的水性介质中，在施用于载体的预制含钯催化剂上进行；然后进行选自马来酸、富马酸或它们的酸酐或它们的混合物的不饱和酸化合物的液相氢化； 并且通过从含有0.001-0. 01质量％的晶种的水溶液结晶获得得自所述氢化的产物，所述晶种为具有高生物学活性的琥珀酸。所得的酸具有高纯度(99% )，质量与所用的晶种无任何差别，不含马来酸和富马酸杂质，具有稳定的高生物学活性。对于工艺和应用，所述方法比已知的最接近的类似方法更简单，可以广泛使用已知载体上的含钯催化剂。在这种情况下，不需要多步骤分离催化剂来合成配合催化剂。在产物结晶过程中使用高生物学活性琥珀酸形式的晶种可以提高所得琥珀酸的质量和生物学活性的稳定性。我们的实验证实具有期望特征(将马来酸酐和马来酸/富马酸氢化为高生物学活性琥珀酸的活性和选择性)的催化剂可以通过用马来酸、富马酸或琥珀酸初步改性(就在氢化前)任何含钯的载体催化剂获得。用上述酸改性钯催化剂在这些酸的水溶液中，于无氧气氛下进行。水溶液中催化剂悬浮物的浓度和钯/酸比率分别保持在0. 1-4. 5质量％和1 1-1 400的限制内。可以使用较高的酸/钯比率，然而这不会产生任何额外的积极效果，还会导致钯从催化剂表面转移至溶液的危险，从而降低催化剂活性。根据本发明，负载的钯的浓度在0. 1-1.0质量％范围内，并且酸改性剂的浓度在0.01-0. 7%范围内，这取决于负载的钯的浓度和所选的钯/酸比率。改性的持续时间为0. 5-2小时。改性过程优选直接在氢化反应器中，于无氧气氛下进行，并且进行持续搅拌，温度的宽范围是5-70°C (优选15-40°C )。改性完成后，向反应器加入马来酸酐(马来酸或富马酸)，用氢气将系统换气，然后设定必需的温度条件和氢气压力。这个过程在100-120°C的温度且不超过25atm的压力条件下进行。更高的压力不会带来额外的积极效果。氢气吸收结束并将反应混合物保持一定时间后，通过“热”过滤分离催化剂，然后向加热的结晶器进料温度为80-100°C的催化产物(琥珀酸的水溶液)，该结晶器中预先提供了所谓的“晶种”，即天然来源的标准酸或生物学活性等同的标准酸。以调节的温度下降的方案进行结晶首先以3-4°C/分钟的速率(至 450C )，然后1_2°C /分钟(至25°C )，最后0. 3-0. 5°C /分钟(至5_15°C )。这样的步骤获得了琥珀酸的微晶体沉淀，然后将其过滤并在不超过100°C的温度下干燥。根据这种步骤获得的琥珀酸(母液分离并干燥后)具有高纯度(主要物质含量不低于99. 0% ；无马来酸和富马酸)，并且生物学活性与结晶中用作“晶种”的酸没有差别。本发明的方法的优点是明显的其实施时大大简化了制备琥珀酸的完整技术工艺 (包括催化剂的合成)，并降低了费用。测试证实，通过这种方法生产的琥珀酸的特征在于高生物学活性，即与原型一样高，甚至在某些情况下更高。通过所述方法获得的琥珀酸的特征在于其生物学活性的稳定性，其参数独立于工业生产的规模。通过实施例13的技术测试样品证实了高生物学活性。测试证实92%的情况下的样品符合要求，即独立于生产规模 (实验室或工业)。所述方法还允许以较宽范围的现代载体催化剂来实施生产过程，所述催化剂以钯作为它们的活性相。通过下文的实施例和所附的表1-8示例本发明的实施，实施例1、2和3示出类似物和原型的数据。实施例4-10示例了本发明。我们使用通过琥珀碎屑的热解获得的“天然”琥珀酸作为对照。实施例11-14表示实施例1-10样品的生物学活性的结果，使用“天然”琥珀酸作为对照。实施例1(现有技术[2])在实验室装置(带有回流冷凝器的置于沸水浴的烧瓶)中，通过糠醛的氧化合成琥珀酸。向烧瓶加入200Cm330%过氧化氢、250cm3水和48g糠醛。以这样的方式在搅拌下加入浓氢氧化钠将介质的PH维持在2-4的水平，保持45分钟。最后，将pH调节到7。残留的过氧化物分解后，向反应物中加入100Cm330%的盐酸，并蒸发至几乎干燥。 将剩余物连续地从丙酮和水重结晶，获得的琥珀酸熔点为182. 5-183. 5°C，产率为理论预期的 74%。
实施例2 (现有技术W])马来酸的氢化在批量操作的装置中进行，该装置由以下部分组成氢化反应器、分离催化剂的加热的滤器、带有冷却夹套和搅拌器的结晶器、用于分离琥珀酸或其盐的滤器以及蒸汽加热的干燥器。向反应器装入121水、4kg马来酸和32g镍-钯催化剂(钯含量为0. 2质量％ ；镍含量为0.2质量％)。在IOatm的恒定氢气压力下，氢化过程以多加热方案进行(Tft始为 25-30°C ;ΤΛ纟乡为95-105°C)。氢气吸收持续100分钟。用氮气将反应器换气，并在加热的滤器上通过过滤分离催化剂和结晶后，分离了琥珀酸(熔点为186. 0-186. 5°C )，并且总收率(3个循环后)达到理论预期的99. 5%。实施例3 (原型[5])实施例2A的再现实施例2A在装置中以钯0. 1 %和铁0. 1 % (按载体材料干重，炭O y - B )的额定含量制备催化剂，所述装置由具有用于制备初始溶液的混合器的4个容器、用于合成的反应器和滤袋组成。在容积V = 5dm3的容器中通过加入3. 25dm3蒸馏水和135. 5g氢氧化钠来制备IN 的氢氧化钠溶液(主要物质含量为99. 0% )。在容积V = 2dm3的容器中，将18. 4g氯化铁(FeCl3 · 6H20)溶于0. 9dm3的蒸馏水中，并搅拌。在容积V = O. 5dm3并具有搅拌器和回流冷凝器的可控加热容器中，制备钯配合盐 (钯的氯配合物)的溶液。在不断搅拌下向容器连续加入2dm3蒸馏水、0. 5dm3浓盐酸、2. 2g 氯化钠和6. 78g氯化钯(每次少量加入，钯含量为59质量％ )。将反应物加热到60-70°C 并搅拌，直到形成钯的氯配合物的溶液，然后，冷却到30-40°C后，水解，向溶液中缓慢地加入55ml IN氢氧化钠溶液，并保持2小时。在搅拌下，向用于合成的反应器加入40dm3水、37. Og马来酸酐或43. Sg马来酸， 然后加入4kg(干重)O y-B桦木炭澄清剂。向反应器的加热夹套送入蒸汽，将反应物加热至50 士 2°C。向加热的悬浮液中加入氢氧化钠溶液，直至pH值达到9，然后，缓慢地加入钯配合物的溶液和0. 9dm3氯化铁溶液，并且将悬浮液的pH保持为9-9. 5的水平。定量给料所有组分后，将悬浮液放置0. 5小时。然后将其冷却至30-40°C，并通过滤袋在氮气压力 (0. 2-0. 3MPa)下过滤，将滤液与催化剂分离，并直接送入收集器。将滤器上的催化剂分批用120dm3水洗涤，将洗涤的水也送入收集器。将洗涤的催化剂在滤器上用氮气干燥至残留水份为 55%，取下湿膏状物( 3. 8kg，干重)。根据原子吸收光谱测定法的数据，关于干重，催化剂含有0. 11%的钯和0. 15%的铁。在合成的钯-铁催化剂的存在下，在实验室批量操作装置上进行马来酸酐的氢化，所述装置由各自为IOOdm3的悬浮器和氢化反应器、加热的催化剂分离A P y K-滤器、 结晶器以及分离产物的H y T H-滤器。反应过程在40-105°C的温度和15atm的氢气超压下进行。通过热过滤分离催化剂并通过将氢化催化产物从90°C冷却至10°C将产物结晶，琥珀酸的产率为理论预期的80%和95. 8% (分别是母液的第一循环和第三循环后)。琥珀酸的质量是高的(Tm = 187-187. 50C ；主要物质含量99. 6% ；无不饱和酸)。下面示出示例本发明的方法的实施例。用做晶种的是初步测试了生物学活性的琥珀酸；其可以是合成或“天然”琥珀酸。在承受固定应激的大鼠上测试琥珀酸；测试的成分是血液的淋巴细胞成分，其在取自尾静脉的血涂片中于应激之前和之后进行测定。如果嗜酸性粒细胞的百分比超过0. 5% (最优)，这分别对应于25%和50%的初始水平，则酸适用于结晶过程。测试技术的详细描述见实施例13。实施例4在具有搅拌器的容器(V = 0. 3dm3)中进行催化剂的改性，向容器中加入IOOml 0.5%的马来酸溶液，用氩气排出容器中的空气，并加入ΗΠΦ-1催化剂(4.6g)，该催化剂的活性相(根据说明书)是用镍和铁化合物促进的多氯羟配合物形式的钯。钯的含量为 0. 2质量％，镍的含量为0. 2质量％，铁的含量为0. 07质量％。将马来酸水溶液中的催化剂悬浮液在室温( 20°C )下搅拌1小时。然后，将改性的催化剂悬浮液在氩气压力下转换到容积为1. Odm3的高压釜中，该高压釜中已预先加入了 600ml马来酸溶液(酸浓度为27. 7 质量％ )。在将反应器首先用氩气然后用氢气换气后，将其密封，向反应器的夹套中加入冷却剂。将氢气压力提高到20atm，开动搅拌器。氢化(氢的吸收)就在开启搅拌器后开始。 反应过程在< 90-100°C的温度下进行，在氢气吸收完成并保持在90-100°C的温度后，通过加热的滤器将琥珀酸溶液中的催化剂悬浮液挤压到结晶器中(温度)，向该结晶器加入0. 5ml含有提取自天然琥珀的0. 07g琥珀酸的溶液，以如下可调控的冷却方案从溶液中进行琥珀酸结晶1.以每分钟3°C的速率冷却到45°C的第一阶段；2.以每分钟1°C的速率冷却到25°C的第二阶段；3.以每分钟0. 30C的速率冷却到10°C的第三阶段。从母液分离沉淀并将其干燥，琥珀酸的产率为理论预期的81.2%，产物中主要物质含量为99. 95质量％，无不饱和化合物(马来酸、富马酸)。将母液循环三次后，琥珀酸的产率增加到理论预期的99. 5%。实施例5在悬浮器中制备401水中的20kg马来酸酐的溶液。向反应器(V = IOOdm3)中加入用琥珀酸酸化的201水。水中的酸浓度为0. 012 质量％。将反应器用氮气换气，然后充入氮气-氢气混合物(1 1体积)，然后加入 Π O y B-08催化剂(300g，干重)，根据说明书，催化剂活性相是还原形式的钯。将琥珀酸的稀释水溶液中的催化剂悬浮液连续搅拌30-40分钟，并将温度逐渐提高到40-50°C。完成催化剂改性后，从悬浮器(悬浮液反应器)用氮气将马来酸酐的水溶液(马来酸)压入反应器内。用氢气排出反应器中的氮气-氢气混合物，在IO-Ifetm下以多加热方案(通过反应热使温度升高到120°C )进行氢化。氢气吸收完后并在同样条件下(搅拌，氢气压力为10-15atm，温度为100-120°C ) 将反应物保持1小时后，用氮气将氢气从反应器排出，将催化产物通过α ρ y κ-滤器挤压到加热(90-100°C)的结晶器中，然后向结晶器中加入20ml晶种溶液(按实施例4所述获得，并证实了生物学活性的合成琥珀酸的溶液)。总物料中晶种的浓度为0. 001质量％。以可变速率温度降低的方案进行结晶过程。冷却速率是这样地调节经13-17分钟从溶液沉淀约一半的琥珀酸。然后，将冷却速度降至这样的水平自冷却开始的35-40分钟内，提供约70%的所有琥珀酸的沉淀。继续冷却至8-10°C的温度(整个结晶过程经历1. 5-2小时)，并将沉淀在η y τ η-滤器上与母液分离，把该母液返回至循环。母液可用来制备马来酸酐的初始溶液，也可用来改性“新鲜”的催化剂。在温度为90-95°C的托架干燥箱内将酸干燥。干燥后所得的琥珀酸的产率为理论预期的约80%，具有高质量主要物质含量 100% ；熔点为187-187. 5°C，无不饱和酸。母液经3次循环后，琥珀酸的产率达到理论预期的 99. 7%。实施例6在具有搅拌器的氢化反应器(V = 630dm3)中进行改性步骤，搅拌器的转速为2500 转/分。向反应器加入MOl水、210g琥珀酸、210g马来酸和4200g(以干重计)Π Φ催化剂，其活性相(根据说明书)是铁盐促进的钯的多氯羟配合物。用氮气排走反应器中的空气，然后用氢气替代氮气。在反应器密封后，将其中的物料加热到30°C，在不断搅拌下将催化剂改性进行1. 5小时。改性结束后，向反应器在氮气压力下加入加热至50°C的1201水中的120kg马来酸酐(马来酸)。用氢气排走反应器中的氮气-氢气混合物，达到20atm的压力后，开动搅拌和加热，在15-20atm的压力、50_110°C的温度下进行氢化，保持40分钟。在保持0. 5小时并用氮气换气后，将反应器中的物料通过用于分离催化剂的加热的Α Ρ y κ-滤器过滤挤压到结晶器中。向该结晶器加入用实施例4获得的琥珀酸作为晶种，总物料中晶种的浓度为0.01质量％。以可控冷却的方案进行结晶(见实施例5)。所得的产物为主要物质含量为99. 92%的琥珀酸(无不饱和化合物)，产率(母液三次循环后)为理论预期的99. 2%。实施例7为了将马来酸酐氢化，使用通过将钯羟配合物施用于焦炭上得到的 "C η 6 y η η τ e上的钯”催化剂。用比率为5 1的马来酸和富马酸改性催化剂。改性在具有搅拌器和夹套的容积V = O. 75dm3的设备中进行，向该设备中加入300ml水，0. 05g 酸混合物和5. Ig催化剂。用氮气-氩气混合物(体积比10 1)将设备换气。向设备的夹套中送入温度为5°C的冷却水，并在不断搅拌下进行改性，保持2小时。向容积V = Idm3的高压釜中加入300ml水和205g马来酸酐，然后用氮气将设备换气，并在搅拌下将设备中的物料加热到30-40°C，直至完全溶解。向设备中在氮气压力下加入改性的催化剂的悬浮液，在90°C的温度和IOatm的压力下进行氢化。通过“热”过滤分离催化剂后，将琥珀酸溶液转移入结晶器，向该结晶器中加入晶种溶液，即根据实施例6制备的琥珀酸(50% )与“天然”琥珀酸(50% )的混合物，总物料中晶种的浓度为0.008质量％。以逐步冷却的方案进行结晶(见实施例5)。获得的产物是高质量的琥珀酸(主要物质含量100%，熔点为187. 9_188°C)，并且产率为理论预期的98. 8% (母液三次循环后)。实施例8催化剂hcat-16 (可可树炭上的0. 5%还原形式的钯)的改性直接在氢化反应器(V = Idm3)中进行的。将催化剂(7. 5g)预先研磨到主要部分的粒径为63-100微米，置于高压釜中，然后向其中加入650ml 0. 06%的琥珀酸水溶液，将反应器用氮气换气，并充入氮气-氢气混合物(体积比为1 5)，开动搅拌器，将温度升高至40°C，并在这些条件下将催化剂悬浮液保持1小时。改性结束后，用氮气排出氮气-氢气混合物，加入250g马来酸，将设备密封，用氢气填充，在15atm的氢气压力和100°C的温度下进行氢化。氢气吸收结束后，将催化产物在氢化条件下保持约1小时，然后将氢气换成氮气， 并在加热的滤器上分离催化产物，将所得溶液直接转移至加热至90°C的结晶器。按实施例5所述进行琥珀酸的结晶。所用的晶种是通过琥珀碎屑的热解获得的琥珀酸，总物料中晶种的浓度为0.001质量％。在所述条件下得到琥珀酸产率为理论预期的80. 2% (1次循环)、理论预期的 90. 8% ( 二次循环)和理论预期的99. 1% (3次循环)，其中主要物质含量不低于理论预期的99.9%，并且无其他杂质。实施例9实验如实施例7所述进行，差别是所用的催化剂是硅胶(ACM ；粉碎的；主要部分粒径为60-100微米)上的钯(氧化物形式)。在25°C下，于氮气氢气混合物(5 1体积比) 的气氛中，将9. 2g催化剂在300ml琥珀酸的水溶液(琥珀酸浓度为0. 03质量％ )中搅拌 1. 5小时。所有后续操作与实施例7完全相同。结晶过程中所用的“晶种”在总物料中的浓度为0.001质量％。用作“晶种”的琥珀酸是合成的并证实过生物学活性的。从返回母液的第一循环至第三循环，琥珀酸的产率为理论预期的98. 9%。同时酸的质量保持很高(无不饱和酸，主要物质含量不低于99. 9质量％ )。实施例10使用实施例4所述的装置，改性的催化剂是石棉纤维上的镍-钯(钯为镍盐促进的氢氧化物形式)。改性条件100ml水；1. 035g催化剂；Ig富马酸；于70°C下，在氦气氢气混合物 (体积比1 5)气氛中搅拌。将改性的催化剂压入反应器中，该反应器预先用氦气换气，并加入了加热至80°C 的207. Ig富马酸在600ml水中的悬浮液。向反应器充入氢气，并在25atm的压力和120°C 的温度下进行氢化。结晶条件与实施例4相同。所得产物中没有马来酸和富马酸，主要物质含量99. 7 质量％，琥珀酸的产率为理论预期的99. (母液三次循环后)。实施例4-10的附加信息列于表1。实施例11所得样品急毒测试测试在重量为220_250g的白色雌性大鼠上进行。在14天中每天一次，用导管向大鼠胃中注入2. 2-2. 5ml的5000mg/kg体重的5%琥珀酸溶液。每个实施例的动物的组为10个，结果列于表2。从表2可见，首先的两个样品不具有致死效果，属于低危险化合物。第三个样品较毒。为了进一步检查，以10000mg/kg体重的剂量(10%琥珀酸溶液)，在类似的大鼠组中， 对实施例1和2的产物进行了测试。没有一个动物死亡。这个实验还证实，实施例4-10所获得的琥珀酸的毒性特征与天然琥珀酸相同。实施例12产物样品的遗传毒测试及辐射防护性质的确定在实验室雄性(18_20g)幼小鼠上进行遗传毒性测试，一组中有6个动物。实验分 2个阶段进行。首先测试琥珀酸样品的诱变性质。向对照动物提供水。在实验组中，向动物提供标准饮食，该标准饮食中加入了 20mg/kg体重的实施例1-10获得的琥珀酸和“天然” 琥珀酸。在下一个阶段中研究了样品的辐射防护性质。将动物暴露于1.3Gy剂量的照射， 然后在48小时内提供含有20mg/kg体重的实施例1-10获得的琥珀酸和“天然”琥珀酸的食物。阳性对照是一组照射后48小时的动物。这个对照组没有接受琥珀酸。利用分离自动物后肢骨髓的红细胞涂片，通过微核测试(通过细胞中微核的存在，即光致密细胞形成)来评价遗传毒性。对每个动物分析了 2000个细胞，计数200个细胞后测定了多色/常色红细胞的比例。结果列于表3。突变标准是每2000个细胞5. 0+1. 0微核。从表3可见，所有样品都不具有遗传毒性。突变数16士2是照射后形成不可逆结果的临界值。从表4可见，实施例1和2获得的样品不具有明显的辐射防护效果，实施例3的样品是接近边界，而实施例4-10的样品和“天然”琥珀酸的样品则把动物带入安全区，即它们具有明显辐射防护效果，这有助于动物不经治疗而存活。实施例13适应原性质的测试(生物学活性的测试)测试分析了重量为200_250g的Wistar雄性大鼠6小时固定应激的效果。使动物仰卧，并固定它们的爪子。通过外周血的白细胞模式的特征性变化证实急性应激的发展(血取自尾静脉10微升用于计数血细胞；20微升用于制备随后通过POMaHoBCKOMy-rHM3 a染色的涂片)。白细胞数目(每微升血液)由5600 士 600增到8800 士 800 (π = 8，P < 0. 02)，而且，嗜中性分叶核粒细胞 (Ηβ τροφΗ ,Ηωχ c erMeHTO-flAepHUX)的百分比由 24+4 % 增到37 士 5 %，而相反地，淋巴细胞的百分比则由75 士 7 %降低到61 士6 %，并且血流中嗜酸性粒细胞完全消失。应激组的动物6小时固定后处死时，发现了全范围的三合一应激-在所有动物的胃和小肠的粘膜发现了大量的出血；-胸腺的重量从400+50mg(对照动物)降至100士50mg (经受应激的动物)；-肾上腺的重量从16士 3mg增加到25+%ig。利用急性应激模型，我们不处死动物就测试了实施例1-10所获得的样品和“天然”琥珀酸的样品，这通过测量外周血液白细胞模式的特征性变化完成。研究了 12组动物， 每组9个重量为200-250g的Wistar雄性大鼠。第1组固定前10分钟用导管向动物胃中注入1.5ml 淀粉溶液。第2组至第12组在固定前10分钟用导管向动物胃中注入 1.5ml 的通过实施例1-10获得的琥珀酸和“天然”琥珀酸。在固定时和6小时后，从尾静脉采取血液，并制备染色的血液涂片以计算白细胞模式。结果列于表5。从表5可见，实施例1和2的琥珀酸样品具有轻微的适应原性质，实施例3的样品在边界，而实施例4-10的样品和“天然”酸的样品是明显的适应原，这几乎完全补偿了固定应激的后果。这个测试是最有信息量的、廉价的以及确保质量控制工艺是可重现的。如果嗜酸性粒细胞的百分比不低于0. 5% (初始水平的25% )，则获得的酸是较好的。实际上， 用做结晶过程的“晶种”的琥珀酸批次保证了嗜酸性粒细胞的百分比保持在1.0% (初始水平的50%)或更高的水平。将相同的方法用预分选产物样品和琥珀酸的批次。在转换到来自其他饲养场的动物或不同品系的大鼠时进行了处死动物的固定应激的对照实验。这是为了证实，所选的条件保证外周血应激模式和经典三合一应激的出现具有淋巴细胞减少的白细胞增多、胸腺退化和肾上腺肥大。该测试的结果定义了背景参数。实施例14产物样品的强心性质测试首先，各种琥珀酸批次的生物学活性的差别是在治疗心脏病人的过程中发现的。 在用合成琥珀酸代替“天然”琥珀酸时，病人开始发现琥珀酸效果有明显的下降或完全无效，但不是在所有批次的制剂中都是如此。搞清楚这个效果使得需要研究保证高生物学活性的琥珀酸合成技术。通过测量心力衰竭的功能等级改变的效果，测定了所得样品的强心活性。通过根据特定的活性范围来分析每日活动可以非常准确地确定功能等级。这种技术的作者认为，按照纽约心脏协会(NYHA)的标准不能准确地确定心力衰竭患者的功能等级，因为广泛使用的术语“每日身体活性”、“亚每日身体活性，，是不够明确的。作者利用患者进行踏板(τ P e A Μ Η π e)锻炼的多次研究计算了每种生命活动形式的代谢消耗等级表(见 Goldman L. , Hashimoto B. , Cook F. et al. Comparative reproducibility and validity of systems for assessing cardiovascular functional class !advantages of a new specific activity scale//Circulation. 1981 ；64(6) :1227-34) [6] 调查表设计为由与被研究病人谈话的医务人员填写。在计算可能的能量消耗总和后，按照特定活动的标准范围，确定患者的功能等级(表6)。在测试中，患者的分组使得相同功能等级的人均勻分布于不同的组中。实验不充许的严重患者具有如下的指标IV功能等级；患有肿瘤疾病或测试前60天以内有心肌梗死或中风的那些患者。利用随机数发生器将患者按每组20人分组。测试如下进行在医生规定的标准疗法的背景下，于3个月内，每个患者在早餐和中餐后每天服用两次IOOmg制剂。 一组服用安慰剂(葡萄糖)；其他组服用实施例1-10和“天然”琥珀酸的制剂。所有参与测试的患者、医生、医务人员、测试的管理人员都不知道样品的性质，因为样品和安慰剂在随机分配临床前是加密的。测试开始前、给药30天、60天和90天后测定患者的功能等级。基于活性等级进行评价(表7)。解密的功能等级变化的动力学列于表8。从表8可见，实施例1和2的样品表现出轻微的积极效果；实施例3的样品的积极效果明显；但是这比表现出高强心性质的实施例4-10的样品和“天然”琥珀酸低得多。从实施例11-14的生物学测试可见，实施例1和2所得的琥珀酸样品不具有高生物学活性。实施例3的样品表现出较高的活性，但是与“天然”琥珀酸的活性差距很大。实施例4-10的样品则完全对应于“天然”的酸。同时，使用生物学活性的酸作用“晶种”，可以保证稳定获得具有高生物学活性并表现出明显的适应原性质的琥珀酸。
权利要求
1.一种制备具有稳定的高生物学活性和适应原性活性的琥珀酸的方法，所述方法包括利用酸制备改性的含钯催化剂、于升高的温度和压力下在所述改性的催化剂上进行不饱和酸化合物的液相氢化、然后分离所述催化剂以及琥珀酸，所述方法的特征在于所述改性于无氧气氛下，在琥珀酸、马来酸或富马酸和/或它们的混合物的Pd2+/酸比率为 1:1-1: 100的水性介质中，在施用于载体的预制含钯催化剂上进行；然后进行选自马来酸、富马酸或它们的酸酐或它们的混合物的不饱和酸化合物的液相氢化；并且通过从含有 0. 001-0. 01质量％的晶种的水溶液结晶获得得自所述氢化的产物，所述晶种为具有高生物学活性的琥珀酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无氧气氛为氮气、氢气、氩气、氦气和 /或它们的混合物，并且所述改性在5-70°C的温度范围内进行，所述水性介质中的催化剂浓度在0. 1-1. 5质量％范围内。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述改性在选自15-40°C范围内的温度下进行，所述水性介质中催化剂浓度在0.1-1.0质量％范围内，并且改性酸化合物溶液的浓度在0.01-0. 7%范围内。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于结晶的晶种为天然来源的琥珀酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于结晶的晶种为合成的琥珀酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于结晶的晶种为天然来源的琥珀酸与合成的琥珀酸的混合物。
全文摘要
一种改进的用于制备具有稳定的高生物学活性和适应原性活性的琥珀酸的方法，所述方法包括利用酸制备改性的含钯催化剂、于升高的温度和压力下在所述改性的催化剂上进行不饱和酸化合物的液相氢化、氢化后除去所述催化剂以及分离所得的琥珀酸，所述方法的特征在于所述改性于无氧气氛下，在琥珀酸、马来酸或富马酸和/或它们的混合物的Pd2+/酸比率为1∶1-1∶100的水性介质中，在施用于载体的预制含钯催化剂上进行；然后进行选自马来酸、富马酸或它们的酸酐或它们的混合物的不饱和酸化合物的液相氢化。通过从含有0.001-0.01质量％的晶种的水溶液结晶获得得自所述氢化的产物，所述晶种为具有高生物学活性的琥珀酸。
文档编号C07C55/10GK102177128SQ200980134050
公开日2011年9月7日 申请日期2009年8月24日 优先权日2008年8月28日
发明者D·卡赛因诺娃, E·I·马埃夫斯基, L·P·皮翁恩科娃, M·L·乌奇捷利, R·A·特鲁宁, T·B·鲁比莫娃, V·I·海费茨 申请人:D·卡赛因诺娃, E·I·马埃夫斯基, M·L·乌奇捷利, R·A·特鲁宁, V·I·海费茨