专利名称：：一种具有抗炎活性的三萜类化合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，是从中药金樱叶中提取分离得到的7个新的具有抗炎活性的三萜类化合物。
背景技术：
：金樱叶为蔷薇科蔷薇属植物金樱子(RosalaevigataMichx.)的嫩叶。在我国分布很广，主要分布于华东、中南、西南等地区。金樱叶为民间常用中药，是古方“军中一捻金”的主要成分之一，主治金疮出血。已从金樱叶中提取到三萜类化合物乌苏酸、蔷薇酸、坡模酸、齐墩果酸、山楂酸、等三萜酸类活性成分和金樱子皂苷A、野蔷薇苷、委陵菜酸-28-0-β-D-吡喃葡萄糖苷等三萜皂苷类活性成分，它们的化学结构通式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中，R1表示氢或羟基，R2表示氢或羟基，R3表示氢或吡喃葡萄糖基，R4表示氢或甲基，R5表示氢或羟基，R6表示氢或甲基，R7表示甲基或羟甲基。但至今未见本发明提供的从金樱叶中分离得到的7个新的具有抗炎活性的三萜类化合物的报道。
发明内容本发明提供一种从中药金樱叶中分离得到的新的具有抗炎活性的7个三萜类化合物，它们的化学结构式分别如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物6<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物7经体外抗炎活性试验，它们均能显著抑制脂多糖(LPS)引起的293-nfkb细胞中荧光素酶表达，且呈现剂量依赖关系，表明具有明显的抗炎活性。因此，可用于制备新的抗炎药物。本发明化合物的制备方法如下1.制备金樱叶提取物将中药金樱叶按常规用4095%乙醇水溶液浸泡过夜，加热回流提取23次，每次13小时，合并提取液，减压回收溶剂，得提取物浸膏；2.提取三萜类化合物将浸膏加水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，分别得到石油醚和乙酸乙酯萃取液，取乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯部位粉末；3.分离纯化将乙酸乙酯部位粉末按常规上硅胶减压柱色谱，用二氯甲烷-甲醇系统以501-201-101-51-11进行梯度洗脱，共收集洗脱液20份，每份2000ml，将12-16份合并，减压回收溶剂后再次上硅胶减压柱色谱，用石油醚-丙酮系统以201-101-51-11进行梯度洗脱，共收集洗脱液10份，每份2000ml，将5-7份合并，减压回收溶剂后再用反相ODS填料开放柱进行柱色谱分离，用甲醇-水梯度洗脱，分别取60%甲醇-水洗脱部分，减压回收溶剂后进行反相高效液相，用70%甲醇-水洗脱，分离得到化合物1，化合物2，化合物3；取70%甲醇-水洗脱部分，减压回收溶剂后进行反相高效液相，用75%甲醇-水洗脱，分离得到化合物7；取80%甲醇-水洗脱部分，减压回收溶剂后进行反相高效液相，用85%甲醇-水洗脱，分离得到化合物4，化合物5，化合物6。具体实施例方式现结合实施例，对本发明作详细描述。实施例1.制备本发明三萜类化合物171.制备金樱叶提取物取中药金樱叶2公斤，用10倍体积量的70%乙醇水溶液浸泡过夜，加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂，得金樱叶提取物浸膏；2.提取三萜类化合物将浸膏加水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，分别得到石油醚和乙酸乙酯萃取液，取乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯部位粉末；3.分离纯化将乙酸乙酯部位粉末按常规上硅胶减压柱色谱，用二氯甲烷-甲醇系统以501-201-101-51-11进行梯度洗脱，共收集洗脱液20份，每份2000ml，将12-16份合并，减压回收溶剂后再次上硅胶减压柱色谱，用石油醚-丙酮系统以201-101-51-11进行梯度洗脱，共收集洗脱液10份，每份2000ml，将5-7份合并，减压回收溶剂后再用反相ODS填料开放柱进行柱色谱分离，用甲醇_水梯度洗脱，分别取60%甲醇-水洗脱部分，减压回收溶剂后进行反相高效液相，用65%甲醇-水洗脱，分离得到化合物120mg，化合物215mg，化合物315mg；取70%甲醇-水洗脱部分，减压回收溶剂后进行反相高效液相，用75%甲醇-水洗脱，分离得到化合物730mg，取80%甲醇_水洗脱部分，减压回收溶剂后进行反相高效液相，用85%甲醇-水洗脱，分离得到化合物413mg，化合物525mg，化合物620mg。经核磁共振检测分析，确定本发明各化合物的化学结构，它们的理化性质和波谱数据分别为化合物1白色无定型粉末，mp142146°C。[a]D2°+25°(c=0·16，MeOH)。UV(MeOH)Amax(log□)nm:243(4·26)；IR(KBr)□max:3420(OH)，2937，2837，1712(C=0)，1634，1384CHT1;HRESIMS，m/z481.3291[M+Na]+(calcdforC29H46O4Na,481.3294)；13Cand1HNMR数据见表1和表2。化合物2白色无定型粉末，mp220225°C。[α]D2°-13°(c=0.173，MeOH)。UV(MeOH)Amax(logD)nm240(4.26)；IR(KBr)□max3446(OH),2925,2873,2832,1636cm-1；HRESIMS,m/z465.3343[M+Na]+(calcdforC29H46O3Na,465.3345)；13Cand1HNMR数据见表1和表2。化合物3白色无定型粉末，mp259263°C。[a]D2°+10°(c=0·07，MeOH)。UV(MeOH)Amax(log□)nm240(4.26)；IR(KBr)□max3406(OH),2935,2868,1701(C=0)，1458，1384CHT1;HRESIMS，m/z525.3188[M+Na]+(calcdfOrC30H46O6Na,525.3192)；13Cand1HNMR数据见表1和表2。化合物4白色无定型粉末，mp248252C。[α]D18+0°(c=0.08，MeOH)。IR(KBr)□max:3421(OH)，2941，1698(C=0),1384cm-1；HRESIMS,m/z495.3451[M+Na]+(cacldforC30H48O4Na,495.3450)；13Cand1HNMR数据见表1和表2。化合物5白色无定型粉末，mp216220°C。[α]D20+24°(c=0·22，MeOH)。IR(KBr)□max3420(OH)，2940，1695(C=0),1384cm-1；HRESIMS,m/z527.3344[M+Na]+(calcdforC30H48O6Na,527.3349)；13Cand1HNMR数据见表1和表2。化合物6白色无定型粉末，mp292295C。[α]D20+63°(c=0.085，MeOH)。IR(KBr)□max3420(OH)，2946，1700(C=0),1384cm-1；HRESIMS,m/z511.3396[M+Na]+(calcdforC30H48O5Na,511.3399)；13Cand1HNMR数据见表1和表2。化合物7白色无定型粉末，mp290294°C。[α]D20+3°(c=0·173，CH2Cl2)。IR(KBr)□max:3425(0H),2939,1740(C=0)cm-1；HRESIMS,m/z611.3925[M+Na]+(calcdforC35H56O7Na,611.3924)；13Cand1HNMR数据见表1禾口表2。表1.化合物1-7的13C-WR谱数据(pyridine_d5，125MHz)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>aInCDCl3表2.化合物1-7的1H-NMR谱数据(pyridine_d5，500MHz)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>aInCDCl3本发明化合物抗炎活性试验采用化合物17对脂多糖(LPS)诱导的NF-KB-Iuc293CellLine细胞中荧光素酶强度的影响来证明其抗炎活性。1.药物溶液的配制1)将化合物17分别用DMSO配制成终浓度为20mg/ml溶液，置于_4°C保存；2)LPS:L2654(sigma)，用dH20配制成浓度为100μg/ml溶液，-20°C保存。2.细胞株使用抗炎药物筛选工具细胞株NF-κB-Iuc293CellLine，由第二军医大学药学院药理教研室提供。3.试验方法按常规复苏细胞并且传代培养，使用DMEM+10%FBS的完全培养基；取P2代对数生长期细胞，使用胰酶消化的方法制备细胞悬液，接种细胞到96孔细胞培养板，每孔细胞悬液为100μ1，细胞数为IXIO4个；每个化合物按每孔不同药物浓度分成6组，即0μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/m和200μg/ml组，每组3个复孔，S5%CO2培养箱于37°C培养细胞4小时，加入LPS(终浓度为1μg/ml)’继续培养48小时，按常规分别收集各组细胞样本，进行荧光素酶活性检测。对荧光素酶的检测数据进行统计分析，以确定药物预处理对于LPS诱导的炎症反应是否具有抑制作用。结果见表3。表3.化合物1-7对LPS(lug/ml)诱导的NF_kB_1uc293CellLine细胞中荧光素酶强度检测(RLU)(平均值土方差)组别药物浓度(μ^ηι)(η=3)0_1Ζ5_25_50_100_20068083.33±43781.00±31161.00±22865.67士15709.67±11618.33士化合物18264.194193.53*1650.81**2191.11**985.60**410.88**68083.33士29835.33±11658.33±8507.33±5730.00士4063.67土化合物28264.194090.25**966.93**819.38**614.14**874.08**68083.33±46232.51±42918.92士28463.82土18974.00士10639.83±化合物3°8264.194889.56*3233.07*2524.94**1214.71**606.23**68083.33士29257.67士19901.00士9263.33士5713.00士4927.00士化合物4_8264.194484.83**1849.31**932-47**1596.32**1379.15**68083.33±33725.13±28743.93±20746.61土13748.23士10295.42土化合物58264.193204.56**2264.87**1848.81**1000.47**6267.56**入^68083.33±52143.67土42646.67士35156.67±29839.00士21680.00士化合物68264.194485.46*2282.72**2098.09**2601.78**2026.83**,,68083.33±33879.67士25803.67士17191.00土11977.67士7953.00士化合物7_8264.193746.20**3078.08**1899.05**1273.49**1636.05**^—■\注*P<0·05，<0·01；药物预处理组vs模型组由表3可见，在293细胞中，化合物1_7可以明显抑制LPS引起的NF-κB激活，且呈现剂量依赖关系，表明本发明化合物具有显著的抗炎活性，因此，可用于制备抗炎药物。权利要求一种具有抗炎活性的三萜类化合物，其特征在于化学结构式分别为FSA00000126230700011.tif2.权利要求1所述的三萜类化合物在制备抗炎药物中的应用。全文摘要本发明涉及医药
技术领域：
，是从中药金樱叶中提取分离得到的7个新的具有抗炎活性的三萜类化合物。经体外抗炎活性试验，它们均能显著抑制脂多糖(LPS)引起的293-nfkb细胞中荧光素酶表达，且呈现剂量依赖关系，表明具有明显的抗炎活性。因此，可以用于制备新的抗炎药物。本发明为制备抗炎药物提供了新的来源。文档编号C07J63/00GK101830964SQ20101017955公开日2010年9月15日申请日期2010年5月21日优先权日2010年5月21日发明者曾娜,朴淑娟,林厚文,沈阳,陈万生申请人:中国人民解放军第二军医大学