一种制备多肽药物的方法
【专利摘要】本发明涉及一种制备多肽药物DiaPep277的方法，包含：将Fmoc-Asp(OtBu)-OH与树脂P偶联，得到Fmoc-Asp(OtBu)-P；将Fmoc-Asp(OtBu)-P采用逐一偶联的方式固相合成，得到DiaPep277-P；将DiaPep277-P裂解，得到DiaPep277粗肽。
【专利说明】一种制备多肽药物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种制备多肽药物的方法，具体而言，涉及DiaPep277的制备方法。
【背景技术】
[0002] DiaP印277是源自人热休克蛋白60 (HSP60)序列上的一段含24个氨基酸的肽段。 DiaP印277的结构如下：
[0003] H-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser -Leu-Thr-Pr〇-Ala-Asn-Glu-Asp-〇H 〇
[0004] 研究证明，DiaPep277能够调节免疫系统，使胰岛细胞免受破坏并保护胰岛素分泌 功能。因此，DiaPep277为自身免疫性糖尿病患者的治疗带来实质性的突破，并且可以作为 这种糖尿病发病高危人群的预防性用药。这种药物可以明显提高I型糖尿病患者的生存质 量，延缓或阻止各种并发症的发生，以提高患者的预期寿命。
【发明内容】
[0005] 对于含有24个氨基酸的短肽，由于固相方法存在操作简便，溶剂使用量小，易于 自动化等优点，因此往往采用常规的保护氨基酸进行固相顺序偶联进行合成。但是，经分 析DiaPep277的肽链后，本发明人发现，该肽链存在一些特殊的情况，大量的疏水性基团 (特别是N端）及-Gly-Gly-Gly-结构的存在会使合成存在较大的困难。如果采用常规的 Fmoc-Gly-OH原料容易在合成-Gly-Gly-Gly-结构时产生土Gly的杂质等。
[0006] 本发明的目的在于采用特殊的氨基酸原料来解决上述困难，提高粗肽的纯度与收 率。
[0007] 本发明提供一种制备多肽药物DiaP印277的方法，包含以下步骤：
[0008] 1)以一种树脂P作为载体，将Fmoc-Asp(OtBu)-OH与树脂偶联，得到 Fmoc-Asp(OtBu)-P ;
[0009] 2)以Fmoc-Asp(OtBu)-P为原料，采用逐一偶联的方式与其他氨基酸原料进行固 相合成，得到DiaP印277-P ;
[0010] 3)将DiaP印277-P裂解，得到DiaP印277粗肽；
[0011] 其中Fmoc为9-芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氮原子相连，
[0012] 其中步骤2)所述的逐一偶联的方式中Asp-Ser结构采用的合成原料是 Fmoc-Asp (OtBu) -Ser ( ΨΜε' MePro) -0H，其为一个假脯氨酸二肽，使丝氨酸被保护成五元环， 结构如下：
[0013]
【权利要求】
1. 一种制备多肤药物DiaP巧277的方法，包含W下步骤： 1. W -种树脂P作为载体，将Fmoc-Asp(0tBu)-0H与树脂偶联，得到 Fmoc-Asp (0巧11) -P ; 2. W Fmoc-Asp(0巧u)-P为原料，采用逐一偶联的方式与其他氨基酸原料进行固相合 成，得到DiaP巧277-P ; 3) 将DiaP巧277-P裂解，得到DiaP巧277粗肤； 其中Fmoc为9-巧甲氧撰基，与氨基相连或与駿基所连的碳原子上的氮原子相连， 其中步骤2)所述的逐一偶联的方式中Asp-Ser结构采用的合成原料是 Fmoc-Asp (0巧U) -Ser ( vMe' Mepro) -0H，其为一个假脯氨酸二肤，使丝氨酸被保护成五元环， 结构如下：
其中-Gly-Gly-Gl}f-结构米用的合成原料为 Fmoc-(Hmb)Gl}f-〇H、Fmoc-(Dmb)Gl}f-〇H、 Fmoc-Gly-(Dmb)Gl}f-〇H 或 Fmoc-Gly-(Hmb)Gl}f-〇H 中的一种或两种。
2. 权利要求1的方法，还包括纯化DiaPep277的步骤，纯化优选通过重结晶方法或 HPLC (例如反相HPLC)而进行。
3. 权利要求1的方法，其中步骤1)-3)均在室温和常压下进行；步骤1)-2)的偶联反 应在固相反应柱中进行。
4. 权利要求1的方法，其中所述树脂P为2-CTC树脂或王树脂；其中所述树脂P的替 代度为 0.2-1. Ommol / g，优选为 0.3-0. 8mmol / g，更优选为 0.4-0. 6mmol / g。
5. 权利要求1的方法，其中步骤2)所述的逐一偶联的方式中-Gly-Gly-Gly-结 构采用的合成原料为选自Fmoc- (Hmb) G1厂0H和Fmoc- 〇)mb) G1厂0H的一种，W及选自 Fmoc-Gly-(Dmb) Gl}f-〇H 和 Fmoc-Gly-(Hmb) Gl}f-〇H 的一种。
6. 权利要求1的方法，其中步骤1)中的偶联剂为HOBt / Die ; 步骤。所述的Fmoc-Asp (0巧u) -Ser ( ￥ Me' Mepro) -OH的偶联体系为HATU /册At / DIPEA、PyBOP / HOBt / DIPEA 或 TBTU / HOBt / DIPEA 中的一种； 步骤2)所述的Gly合成原料的偶联体系为Die / H0At、HATU / BOAt / DIPEA或 PyBOP / HOBt / DIPEA 中的一种。
7. 权利要求1的方法，其中偶联中对树脂的洗涂和溶胀采用DMF进行； 优选地，将步骤1)-2)中物质中的駿基进行活化，活化优选在冰水浴中进行；优选活化 剂为DIPEA或DIC。
8. 权利要求1的方法，其中步骤1)-2)中脱除Fmoc的试剂为DBLK ;脱保护反应时间为 5-30分钟，优选10-20分钟。
9. 权利要求1的方法，其中步骤3)中的裂解试剂TFA、H异丙基娃焼和水的混合溶剂， 其中混合溶剂的配比为；TFA体积比为85-90%，H异丙基娃焼的体积比为1-5%，水的体积 比为1-5%，H者之和为100% ; 优选地，所述裂解试剂为TFA ;TIS化0 = 95 ;5 ;5 (V ;V)。
10.权利要求1的方法，其中在氨基酸Fmoc-Asp(0巧U)-0H偶联至载体树脂上之后， 还包括向其中加入一种封闭液除去树脂中过量的未反应基团的步骤；当所述载体树脂为 2-CTC树脂时，所加入的封闭液优选为甲醇；当所述载体树脂为王树脂时，所加入的封闭液 优选为摩尔比为1 ;1的己酸酢和化巧。
【文档编号】C07K14/47GK104418948SQ201310410636
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】宓鹏程, 潘俊锋, 马亚平, 袁建成 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司