抗adamts-5抗体,其衍生物和用途

抗adamts-5抗体,其衍生物和用途
【专利摘要】本发明涉及能够识别并结合表位的抗体、其重组或合成的抗原结合片段(所述表位包含于ADAMTS-5的间隔结构域中)、编码同一物质的核酸和表达载体、其生产方法和用途。
【专利说明】抗ADAMTS-5抗体，其衍生物和用途

【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗ADAMTS-5抗体，所述抗体用于软骨降解相关病症的治疗。
[0002] 具体而言，可在骨关节炎和其他类型的关节炎中观察到这类降解。

【背景技术】
[0003] 骨关节炎（0A)是一组重叠的不同疾病，其具有不同的病因但类似的生物、形态和 临床结果。疾病过程不仅影响关节软骨，还涉及整个关节，包括软骨下骨、韧带、关节囊、滑 膜和关节周围的肌肉。最终，关节软骨退化并伴随纤颤、裂缝、溃疡和失去关节表面的全部 厚度。该病症的特征为邻近病灶区滑膜关节内的关节软骨缺失，与骨的肥大（骨刺和软骨 下骨硬化）和关节囊的增厚相关。可将其解释为滑膜关节对损伤的反应。该现象可发生在 任何关节中，但在手、脊椎、膝、脚和臀的所选关节中最常见。严重时，该病理性变化会导致 辐射变化（失去关节间隙和骨刺），这被用于流行病学研究以估计在不同关节位点上0A的 普遍程度。目前，0A发作的分子和细胞机制仍未知；有假说指出异常的负荷以及外伤可能 起一定作用，但似乎可确定基因和遗传因素也涉及其中。若存在，炎症仅次于主要事件。
[0004] 0A是最常见的关节炎形式。世界卫生组织（WHO)估计，在全球范围内超过60岁的 人群中9. 6%的男性和18%的女性患有症状性0A，并将0A归类为女性残疾的第4大病因和 男性残疾的第8大病因。据信膝0A的残疾风险与心脏疾病相同。
[0005]另一种常见的关节炎形式，类风湿性关节炎（RA)是一种以导致软骨降解、骨侵蚀 和疼痛的关节滑膜炎为特征的慢性炎症疾病，导致严重的残疾和过早死亡。
[0006] 虽然0A和RA可由不同的病因引起并根据不同的途径发展，但它们仍共有由软骨 基质合成和分解失衡组成的基本过程，使得关节软骨破坏，继而导致关节活动受限、关节不 稳定、疼痛和慢性残疾。此外，尽管受0A和RA影响的患者人数令人注目，但对于其病原学、 发病机理和发展仍知之甚少。甚至更令人注目的是，对于这些疾病的治疗，只存在很少的疾 病改善性抗风湿性药物（DMARD)，且其主要限于RA。
[0007] 对于0A，在不存在疗法的情况下，治疗只能是缓解性的，限于使用C〇x-2选择性抑 制剂（如塞来考昔），以及传统的非甾体抗炎药（NSAID)(如萘普生和双氯芬酸），或者甚至 更老的用于疼痛控制的药物（如乙酰氨基酚）。其他类型的药物（包括诸如软骨素和硫酸 盐葡糖胺的化合物）也是针对0A的治疗选择，但许多医生对其效力仍不确信。
[0008] 关于RA，在过去十年中，通常由NSAID支持的DMARD(尤其是氨甲喋呤和新生物剂 的使用）和/或皮质类固醇的优化使用提供了疼痛缓解以及在一定程度上控制了炎症，显 著增加了控制的成功率。然而，传统DMAI?的起效缓慢且具有促进频繁监控的毒性。此外， 传统的NSAID药物的胃肠道副作用以及选择性C0X-2抑制剂的心血管和肾副作用使NSAID 的使用大为失色。
[0009]因此，用于防止软骨降解的新治疗剂的研究引起了极大兴趣，原因在于0A和RA影 响了全世界数以百万计的人，随着平均人口年龄的增长，预期发病率上升。
[0010] 〇A和RA中出现的软骨降解是酶对其结构组分进行切割的结果。软骨主要由软骨 细胞和胞外基质（ECM)构成，所述胞外基质由蛋白多糖（主要是蛋白聚糖聚合物）、胶原 和水组成。基质中，蛋白聚糖聚合物、透明质酸（HA)和II型胶原之间的相互作用为软骨 提供了独特的可压缩性和弹性，用于承重和关节活动功能的生物机械特性。蛋白聚糖聚合 物由三个球形区组成：靠近蛋白 N末端的G1和G2以及位于C末端的G3。G1和 G2区被短 的球G结构域（IGD)隔开，而G2和G3区被长的糖胺聚糖（GAG)附着区隔开。通过辅助蛋 白，G1结构域构成了蛋白聚糖聚合物与脱的结合区。蛋白聚糖聚合物的 GAG附着区提供 了结合水所需的高阴离子电荷密度并赋予软骨确保其功能所需的独特渗透特性。因此，对 导致蛋白聚糖聚合物切割的生物化学机制的理解有助于开发适用于阻断或控制 0A疾病的 治疗药物。关节炎中软骨完整性的缺失与蛋白水解切割所导致的蛋白聚糖聚合物完整性 的受损相关。最近，蛋白聚糖聚合物酶（主要是蛋白聚糖聚合物酶 _2(也称为ADAMTSj) 和蛋白聚糖聚合物酶-1(也称为ADAMTS_ 4))经鉴定属于软骨降解的关键酶。具体而言， 出版物（Glasson 等，2〇〇5· Nature. 434:644-64 和 Stanton 等，2〇〇5· Nature. 434:648-652) 显示ADAMTS-5在与小鼠中0A和RA的两个模型相关的病原性关节变化中起基础作用。 ADAMTS-4和-5都是谷氨酰内肽酶（glutamylendopeptidase)并在五个特定位点切割蛋 白聚糖聚合物：Glu373-Ala374(球间结构域-I⑶）、Glul545-Glyl546、Glul714-Glyl715、 Glul819-Alal820 和 Glul919-Leul920 键（人序列），导致软骨破坏。
[0011]人 ADAMTS-4(图 1，SEQ_ ID N0:1)和 ADAMTS-5 (图 1，SEQ. ID N0:2)是由细胞分泌 至胞外空间的多结构域金属蛋白酶。两种酶均具有类似的结构域排布，由信号序列（SS)、前 结构域（Pro)、催化金属蛋白酶结构域（Cat)、去整合素（Dis)结构域、血小板反应蛋白（TS) I型结构域、富半胱氨酸（CysR)结构域和间隔（Sp)结构域组成。此外，ADAMTS-5在间隔结 构域后包含额外的TS结构域。上文提到的所有催化结构域外的结构域都在天然蛋白底物 的识别和处理过程中其重要作用，称为"外位点"。
[0012] 例如，已证明蛋白聚糖聚合物酶的Sp和CysR结构域包含调节蛋白酶与其底物亲 和性的 GAG 结合基序（Kashiwagi 等，2004. J Biol Chem· 279:10109-10119) ;(Gendron 等， 2007. J Biol Chem. 282:18294-18306) ;(Flannery，Curr. 11:614-619) ;(Zeng 等，2006. Biochim Biophys Acta· 1760:517-524)。
[0013] 因此，人们对开发用于〇A和/或RA治疗的ADAMTS-4和-5抑制剂的兴趣日 益增强。已开发了多种金属蛋白酶抑制剂，且一些已经在患有癌症（Zucker等，2000. Oncogene. 19:6642-6650)和类风湿性关节炎（Milner 和 Cawston，2005. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4:363-375)的患者中进行临床测试，但这些药物未能显 示有效性并表现出副作用（如骨骼肌疼痛和轻度的血小板减少）（Zucker等，2000· Oncogene. 19:6642-6650)。这些失败被认为是由于缺少抑制剂的选择性和对生物学上重要 的脱靶金属蛋白酶的抑制以及其他副作用。因此，选择性是无毒治疗性抑制剂的前提条件。 增加针对特定金属蛋白酶选择性的一种方法是产生变构或外位点结合。结合至酶外位点的 抑制剂能够阻断与天然ECM底物的相互作用并可成为有吸引力的激活定点抑制剂的替代 选择（因为其具有高度特异性且能够有效地仅阻断针对靶底物的水解），从而最小化体内 副作用（Troeberg 等，2008. Faseb J· 22:3515-3524)。
[0014] 申请W0 2011/0〇2968公开了能够结合人ADAMTS-5催化结构域和粉碎蛋白 (desintegrin)结构域的抗体。文件 W0 01/11〇74 和 W0 00/53774 公开了 ADAMTS-5 蛋白并 一般地涉及了针对这类蛋白的抗体。
[0015] 发明描述
[0016]本发明中，发明人分离了识别并结合ADAMTS-5 (称为抗体抗Sp_ADAMTS-5)的间隔 结构域中所含表位的抗体。所述抗体可用于人类治疗应用。所述抗体通常是完全人抗体， 或嵌合或人源化的，以在给予患者时使针对所述抗体的免疫应答的风险最小化。如本文所 述，可从此类抗体设计或衍生出其它抗原结合分子，例如，抗原结合抗体片段、抗体衍生物 和多特异性分子。本发明的抗体显示了针对软骨基质退化的抑制活性，所述抗体控制软骨 基质降解酶的生成并增强软骨基质合成，从而治疗和/或预防软骨降解。因此，所述抗体可 用于软骨降解相关病症的治疗和/或预防。这类病症包括骨关节炎（ 0A)、类风湿性关节炎 (RA)、痛风、银屑病性关节炎、系统性红斑狼疮、脓毒性关节炎、风湿性多肌痛、强直性脊柱 炎、假痛风、多肌炎、纤维组织肌痛或莱姆病。
[0017] 具体而言，本发明的抗体可用于治疗和/或预防被归类为早期至晚期0A和RA的 疾病。0A从初期至晚期的各期是根据0ARSI和曼金分类法（Mankin classification)进行 分类的。
[0018] 在两种疾病中，被分类为任意上述等级或评分的疾病都伴随有作为疾病病症的软 骨退化。本发明的抗体可有效地用于治疗或预防被归类为初期至晚期0A和RA的疾病。 [0019] 这类抗体的抗体结合片段以及包含此类抗原结合片段的分子（包括工程改造的 抗体片段、抗体衍生物、双特异性抗体和其它多特异性分子）也是本发明的目的。
[0020] 包括本发明抗体的药物组合物和试剂盒或其它物品也是本发明的部分。
[0021] 因此，本发明的一个目的是能够识别并结合特定表位的抗体、其重组或合成的抗 原结合片段，所述表位包括在ADAMTS-5的SEQ ID No. 2的氨基酸732至氨基酸874区域中。 优选的表位包括在SEQ ID No. 2的氨基酸732至氨基酸745中、优选在SEQ ID No. 2的氨 基酸746至氨基酸763中、优选在SEQ ID No. 2的氨基酸764至氨基酸779中、优选在SEQ ID No. 2的氨基酸780至氨基酸795中、优选在SEQ ID No. 2的氨基酸796至氨基酸811 中、优选在SEQ ID No. 2的氨基酸812至氨基酸827中、优选在SEQ ID No. 2的氨基酸828 至氨基酸843中、优选在SEQ ID No. 2的氨基酸别4至氨基酸859中、优选在SEQ ID No. 2 的氨基酸860至氨基酸874中。更优选地，所述表位包括在SEQ ID No. 2的氨基酸757至 氨基酸771区域中。
[0022] 优选地，上述抗体、其重组或合成的抗原结合片段包括至少一个重链互补决定区 (CDRH3)氨基酸序列,所述⑶RH3氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相 同性：SEQ ID 恥:62、65、68、71、74、77、80、83、86、89和92。
[0023] 优选地，上述抗体、其重组或合成的抗原结合片段还包括重链互补决定区（CDRH2) 氨基酸序列，所述CDRH2氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少 8〇%的相同性：SEQ ID N0:61、64、67、70、73、76、79、82、85、88 和 91。
[0024] 优选地，本发明的抗体、其重组或合成的抗原结合片段还包括重链互补决定区 (CDRH1)氨基酸序列，所述CDRH1氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少8〇%的相 同性：SEQ ID 吣:60、63、66、69、72、75、78、81、84、87和90。
[0025] 在一个优选实施方式中，上述抗体、其重组或合成的抗原结合片段还包括至少一 个轻链互补决定区（CDRL3)氨基酸序列，所述CDRL 3氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列 具有至少 80%的相同性：SEQ ID 觀:29、32、35、38、41、44、47、50、53、56和59。 ?〇026]在一个优选实施方式中，本发明的抗体、其重组或合成的抗原结合片段还包括轻 链互补决定区（CDRL2)氨基酸序列，所述CDRL2氛基酸序列与选自下组的氣基酸序列具有 至少 80%的相同性：28、31、34、37、40、43、46、49、52、55 和 58。
[0027]在一个优选实施方式中，上述抗体、其重组或合成的抗原结合片段还包括轻链互 补决定区（CDRL1)氨基酸序列，所述CDRL1氨基酸序列与选自下组的氛基酸序列具有至少 80%的相同性：27、30、33、36、39、42、45、48、51、54和57。
[0028] 优选地，本发明的抗体、其重组或合成的抗原结合片段包括重链互补决定区 (CDRH1)氨基酸序列，所述CDRH1氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相 同性：SEQ ID敝6〇、63、66、69、72、75、7 8、81、84、87和9〇;以及重链互补决定区〇1)職） 氨基酸序列，所述CDRH2氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少 80 %的相同性：SEQ ID恥:61、64、67、70、73、76、79、82、85、88和91;以及重链互补决定区仰职3)氨基酸序列， 所述CDRH3氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少 80%的相同性：SEQ ID N0:62、 65、68、71、74、77、80、83、86、89 和 92。
[0029] 在一个优选实施方式中，上述抗体、其重组或合成的抗原结合片段还包括轻链互 补决定区（CDRL1)氨基酸序列，所述CDRL1氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少 80%的相同性：SEQ ID N0:27、30、33、36、39、42、45、48、51、54 和 57;以及轻链互补决定区 (CDRL2)氨基酸序列，所述CDRL2氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相 同性：SEQ ID 购:28、31、34、37、40、43、46、49、52、 55和58;以及轻链互补决定区（〇)1^3) 氨基酸序列，所述CDRL3氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80 %的相同性：SEQ ID 如：29、32、35、38、41、44、47、50、53、56和59。
[0030] 在另一个优选实施方式中，上述抗体、其重组或合成的抗原结合片段包括与SEQ ID No. 60具有至少80%相同性的CDRH1氨基酸序列、与SEQ ID No· 61具有至少80%相同 性的CDRH2氨基酸序列，以及与SEQ ID No· 62具有至少80%相同性的CDRH3氨基酸序列。
[0031] 在另一个优选实施方式中，本发明的抗体、其重组或合成的抗原结合片段还包括 与SEQIDNo.27具有至少80%相同性的CDRLl氨基酸序列、与SEQIDNo·28具有至少 800/^目同性的CDRL2氨基酸序列，以及与SEQ ID阶.29具有至少8〇%相同性的00此3氨基 酸序列。
[0032] 在另一个优选实施方式中，上述抗体、其重组或合成的抗原结合片段包括与SEQ ID No. 81具有至少80%相同性的CDRH1氨基酸序列、与SEQ ID No. 82具有至少8〇%相同 性的CDRH2氨基酸序列，以及与SEQ ID No. 83具有至少8〇%相同性的CDRH3氨基酸序列。 在另一个优选实施方式中，本发明的抗体、其重组或合成的抗原结合片段还包括与SEQ ID No. 48具有至少80%相同性的CDRL1氨基酸序列、与SEQ ID No· 49具有至少80%相同性的 CDRL2氨基酸序列，以及与SEQID No. 50具有至少80%相同性的CDRL3氨基酸序列。
[0033] 优选地，本发明的抗体、其重组或合成的抗原结合片段包括与SEQ ID No. 87具有 至少80°/^目同性的CDRH1氨基酸序列、与SEQ ID此.88具有至少80%相同性的00拙2氨基 酸序列，以及与SEQ ID No. 89具有至少80%相同性的CDRH3氨基酸序列。更优选地，所述 抗体、其重组或合成的抗原结合片段还包括与SEQ ID Νο· 54具有至少80%相同性的⑶RL1 氨基酸序列、与SEQ ID Νο·55具有至少80%相同性的⑶RL2氨基酸序列，以及与SEQ ID No. 56具有至少80%相同性的CDRL3氨基酸序列。
[0034] 在本发明中，"至少80%相同性"指所述相同性可以是与提及序列存在至少80%或 至少85 %或90 %或％ %或100 %的序列相同性。
[0035] 优选地，上述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段是单克隆抗体或嵌合或人源 化的，或去免疫化的或完全人抗体。
[0036] 本发明的另一个目的是上述抗体、其重组或合成的抗原结合片段的医疗用途。优 选地，用于治疗和/或预防软骨降解相关的病症，如骨关节炎和/或类风湿性关节炎。优选 地，上述抗体、其重组或合成的抗原结合片段可用于治疗多配聚糖-4介导的病理反应，尤 其是多配聚糖-4介导的软骨细胞的病理反应。
[0037]本发明的另一个目的是编码上文所定义的抗体、其重组或合成的抗原结合片段的 核酸分子。优选地，编码本发明的抗体、其重组或合成的抗原结合片段的核酸分子包括至少 一个选自SEQ ID No. 99至SEQ ID No. 120的核酸序列。优选地，所述核酸包括至少一个以 下序列：SEQ ID N0. :99、1〇〇、113、114、117 和 118。
[0038]本发明的另一个目的是编码本发明的抗体、其重组或合成的抗原结合片段的表达 载体。
[0039]本发明的另一个目的是包括上述核酸的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞产生本 发明的抗体、其重组或合成的抗原结合片段。
[0040]本发明的另一个目的是产生本发明的抗体、其重组或合成的抗原结合片段的方 法，所述方法包括培养产生上述抗体的细胞并从细胞培养物回收所述抗体。
[0041] 本发明的另一个目的是一种药物组合物，所述组合物包含至少一种上述抗体、其 重组或合成的抗原结合片段，以及药学上可接受的赋形剂。所述组合物包括有效量的抗体、 其重组或合成的抗原结合片段。药物组合物在该领域中是常规的，并且可由本领域技术人 员基于一般常识来制备。包含所述抗体和/或其片段和/或重组衍生物和/或偶联物与至 少一种药学上可接受的赋形剂和/或载剂混合的药物组合物包括在本发明的范围内。
[0042]在一个优选实施方式中，本发明的组合物用于关节内给药。
[0043]本发明的另一个目的是治疗和/或预防软骨降解相关病症（如骨关节炎、类风湿 性关节炎和其他形式的关节炎）的方法，所述方法包括给予治疗有效量的上述抗体、其重 组或合成的抗原结合片段。本发明的另一个目的是治疗和/或预防关节破坏、治疗和/或 预防自身免疫和/或炎症疾病的方法，所述方法包括给予治疗有效量的上述抗体、其重组 或合成的抗原结合片段。
[0044]本发明的一个目的是减少和/或抑制ADAMTS-5的方法，所述方法包括给予有效量 的上述抗体、其重组或合成的抗原结合片段。
[0045] ^在本发明中，公开的CDR的突变体可通过使所述CDR序列中的一个或多个氨基酸 失变来广生。已知位于CDR中适当位置的单氨基酸取代就足以改善亲和性。研究人员已采 用定点突变来使一些免疫球蛋白产物的亲和性增加约 1〇倍。这种通过使CDR突变来增加 或减少（即调节）抗体亲和性的方法是公知常识（参见例如 Paul，w. E.，1993)。因此，使本 发明CDR发生氨基酸取代、缺失或添加以增加或减少（即调节）结合亲和性或特异性也在 本发明的范围内。
[0046]为简便起见，本发明的优选抗体命名为CRB0017(包括SEQ ID Νο·3和SEQ ID No. 4)、CRB0102(包括 SEQ ID No. 17 和 SEQ ID No. 18)以及 CRB0123C 包括 SEQ ID No. 21 和SEQ ID No. 22)，如表III所示。虽然本发明着眼于此类抗体以作为本发明的示例，但本 领域普通技术人员应理解，一旦确定本公开内容，其它类似的抗体及其抗体片段，以及这些 类似抗体的抗体片段的产生和使用都落在本发明范围内。此类类似抗体可由本领域技术人 员通过合理量的实验来产生。
[0047] 更优选地，所述抗体是含有所述表位结合区的scFv、Fv片段、Fab片段、F(ab)2片 段、多聚体抗体、肽或蛋白水解片段。优选地，所述scFv片段包括选自SEQ ID No. 125至 132 和 SEQ ID no. 135、136、137 的序列。
[0048] 本发明的另一个目标是一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明的抗体或其功能 性衍生物，或与上述核酸杂交，或由其简并序列组成。
[0049] 制备单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的，所述方法包括根据标准流程培 养宿主细胞和分离抗体。
[0050] 对于本发明的工业方面而言，本文所公开的抗体可以该【技术领域】通用的方法在药 物组合物中适当地制备。
[0051] 本发明的抗体可包括至少一种上文所定义的CDRH，所述CDRH含有不超过4个氨基 酸，优选不超过2个氨基酸的一个或多个氨基酸取代、缺失或插入。本发明的抗体还可包括 至少一种上文所定义的CDRL，所述CDRL含有不超过4个氨基酸，优选不超过2个氨基酸的 一个或多个氨基酸取代、缺失或插入。
[0052] 本发明的抗体竞争与ADAMTS-5的结合。治疗或预防软骨降解相关病症的方法包 括给予需要治疗的患者有效量的至少一种上述抗体、其重组或合成的抗原结合片段。在一 些方面，本发明包括一种抑制对象中ADAMTS-5与蛋白聚糖聚合物结合的方法，所述方法包 括给予有效量的至少一种上述抗体、其重组或合成的抗原结合片段。
[0053] 本发明的抗体、其重组或合成的抗原结合片段选择性结合ADAMTS-5的间隔结构 域，优选Kd小于等于2nM。
[0054] 在一些方面，本发明包括治疗或预防对象中软骨降解相关病症的方法，所述方法 包括给予需要治疗的患者有效量的至少一种本发明的抗体、其重组或合成的抗原结合片 段，并同时或依次给予特异性止痛的药剂。
[0055] 本发明的抗体、其重组或合成的抗原结合片段是中和抗体（即降低或消除相关抗 原生物活性的抗体），所述中和抗体结合ADAMTS-5并降低ADAMTS-5与蛋白聚糖聚合物结合 的可能性。
[0056] 优选地，本发明的抗体、其重组或合成的抗原结合片段在SEQ. ID N0:2的残基 732-874位置上与ADAMTS-5结合。在一些实施方式中，与ADAMTS-5结合时，本发明的抗体、 其重组或合成的抗原结合片段位于距离ADAMTS-5的至少一种以下残基8埃或更小的距离 上：T732、K733、1734、V735、G736、T737、F738、N739、K740、K741、S742、K743、G744、Y745、 T746、D747、V748、V749、R750、I751、P752、E753、G754、A755、T756、H757、I758、K759、V760、 R761、Q762、F763、K764、A765、K766、D767、Q768、T769、R770、F771、T772、A773、Y774、L775、 A776、L777、K778、K779、K780、N781、G782、E783、Y784、L785、1786、N787、G788、K789、Y790、 M791、1792、S793、T794、S795、E796、T797、1798、1799、D800、1801、N802、G803、T804、V805、 M806、N807、Y808、S809、G810、W811、S812、H813、R814、D815、D816、F817、L818、H819、G820、 M821、G822、Y823、S824、A825、T826、K827、E828、1829、L830、1831、V832、Q833、1834、L835、 A836、T837、D838、P839、T840、K841、P842、L843、D844、V845、R846、Y847、S848、F849、F850、 V851、P852、K853、K854、S855、T856、P857、K858、V859、N860、S861、V862、T863、S864、H865、 G866、S867、Ν868、Κ869、V870、G871、S872、Η873 或 Τ874。
[0057] 在一些实施方式中，本发明的抗体、其重组或合成的抗原结合片段阻断抗体在距 离ADAMTS-5的残基8埃以内的位置上与ADAMTS-5结合。在一些实施方式中，所述ADAMTS-5 的残基选自至少一种以下 ADAMTS-5 残基：T732、K733、1734、V735、G736、T737、F738、N739、 K740、K741、S742、K743、G744、Y745、T746、D747、V748、V749、R750、1751、P752、E753、G754、 A755、T756、H757、1758、K759、V760、R761、Q762、F763、K764、A765、K766、D767、Q768、T769、 R770、F771、T772、A773、Y774、L775、A776、L777、K778、K779、K780、N781、G782、E783、Y784、 L785、1786、N787、G788、K789、Y790、M791、1792、S793、T794、S795、E796、T797、1798、1799、 D800、1801、N802、G803、T804、V805、M806、N807、Y808、S809、G810、W811、S812、H813、R814、 D815、D816、F817、L818、H819、G820、M821、G822、Y823、S824、A825、T826、K827、E828、1829、 L830、1831、V832、Q833、1834、L835、A836、T837、D838、P839、T840、K841、P842、L843、D844、 V845、R846、Y847、S848、F849、F850、V851、P852、K853、K854、S855、T856、P857、K858、V859、 N860、S861、V862、T863、S864、H865、G866、S867、N868、K869、V870、G871、S872、H873 或 T874。
[0058] 优选地，本发明的抗体、其重组或合成的抗原结合片段在与蛋白聚糖聚合物结合 ADAMTS-5的位置重叠的位置上结合ADAMTS-5。
[0059] 优选地，本发明的抗体、其重组或合成的抗原结合片段降低了蛋白聚糖聚合物结 合ADAMTS-5的可能性，所述结合发生距离至少一种以下的ADAMTS-5残基8埃以内的位置 上：T732、K733、1734、V735、G736、T737、F738、N739、K740、K741、S742、K743、G744、Y745、 T746、D747、V748、V749、R750、I751、P752、E753、G754、A755、T756、H757、I758、K759、V760、 R761、Q762、F763、K764、A765、K766、D767、Q768、T769、R770、F771、T772、A773、Y774、L775、 A776、L777、K778、K779、K780、N781、G782、E783、Y784、L785、1786、N787、G788、K789、Y790、 M791、I792、S793、T794、S795、E796、T797、I798、I799、D800、I801、N802、G803、T804、V805、 M806、N807、Y808、S809、G810、W811、S812、H813、R814、D815、D816、F817、L818、H819、G820、 M821、G822、Y823、S824、A825、T826、K827、E828、1829、L830、1831、V832、Q833、1834、L835、 A836、T837、D838、P839、T840、K841、P842、L843、D844、V845、R846、Y847、S848、F849、F850、 V851、P852、K853、K854、S855、T856、P857、K858、V859、N860、S861、V862、T863、S864、H865、 G866、S867、N868、K869、V870、G871、S872、H873 或 T874。
[0060] 本发明提供包含治疗有效量的本文公开的抗体、pH保持在约4. 5至约6. 5的缓冲 液和任选的表面活性剂的制剂。
[0061] 所述制剂通常用于本发明公开的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，其活性 浓度原则为约〇· lmg/ml至约100mg/ml。在某些实施方式中，所述抗体、其重组或合成抗原 结合片段的浓度是约〇· lmg/ml至lmg/ml ;优选为lmg/ml至10mg/ml，优选为10至l〇〇mg/ ml〇
[0062] 出于本文目的，"药物组合物"是适合且合适给予哺乳动物（尤其是人）的药物组 合物。因此，所述组合物可用于治疗哺乳动物中的疾病或病症。此外，所述组合物中的抗体 已经过一次或多次纯化或分离步骤，从而已将可能对其治疗应用产生千扰的污染物分离在 夕卜。所述药物组合物通常包括治疗性的蛋白质和药学上可接受的运载体或稀释剂。所述组 合物通常是无菌的，并且可被冻干。下文更详细地描述了药物制备。
[0063] 可通过混合具有所需纯度的抗体和任选的生理学上可接受的运载体、赋形剂或稳 定剂（Remington's Pharmaceutical Sciences (《雷明顿药物科学》）第 16 版，0sol，A. 编，1980)来制备冻千制剂或水溶液形式的所述一种或多种抗体的治疗制剂。可接受的运 载体、赋形剂或稳定剂就使用的剂量和浓度而言是对接受者无毒的，并且可包括缓冲液、抗 氧化剂、防腐剂、肽、蛋白质、亲水性聚合物、螯合剂（如EDTA)、糖类、成盐的反荷离子（如 钠）；金属复合物（例如Zn-蛋白质复合物）；和/或非离子表面活性剂（例如T寶EE_、 PLURONICS?或聚乙二醇（PEG))。
[0064] 活性成分也可包入通过例如凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊中，示例分别是羟 甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯）微胶囊，或包入胶体药物递送系统 (例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊）或包入乳池液（macroemulsion) 中。此类技术可参见Remington's Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》）第16 版，OsolA.编（1980)。用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可通过无菌滤膜过滤容易地 实现。
[0065] 在另一个实施方式中，就疾病预防或治疗而言，本发明的抗Sp-ADAMTS-5抗体的 合适剂量将取决于待治疗的疾病类型、所述疾病的严重性和疗程、所述抗体是否以预防或 治疗目的给予、先前的治疗、患者的临床史和对所述抗体的应答，以及主治医师的判断。所 述抗体适于以一次或经一系列治疗给予所述患者。根据疾病的类型和严重性，给予患者的 抗体或其片段的初始候选剂量是约1 μ g/kg至15mg/kg,例如，通过一次或多次分开给予或 通过连续输注来给予。对于经数天或更长时间的重复给药，可根据所述病症使治疗持续直 至疾病症状得到所需的抑制。然而，也可采用其他剂量方案。可通过常规技术和方法来容 易地监测治疗进展。
[0066]所述抗体组合物应以遵循良好医学实践的方式来制备、配剂和给予。本发明的抗 体/衍生物可通过任何合适的途径给予。这包括（但不限于）腹膜内、肌肉内、静脉内、皮 下、关节内、气管内、口服、肠内、肠胃外、鼻内或皮肤给药。优选的给药方式是关节内途径。 这种情况下，考虑的因素包括治疗的具体病症、治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状 况、所述病症的起因、试剂的递送位点、给药方法、给药安排，以及医学从业人员已知的其它 因素。待给予的抗体的"治疗有效量"将由此类考虑来决定，并且是所需的最小量，以预防、 改善或治疗疾病或病症。所述抗体不需要，但可任选地与一种或多种当前使用的试剂一同 配制以预防或治疗所针对的病症。此类其它试剂的有效量取决于所述制剂中抗体的量、病 症或治疗类型，以及上述其它因素。
[0067]本文的术语"抗体"以其最广泛含义使用，并且涵盖不同抗体结构，包括但不限于 单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体），和抗体片段（前提是它们显 示所需的抗原结合活性）。
[0068] "抗体片段"指除完整抗体以外的分子，所述分子包含完整抗体的部分，该部分结 合与所述完整抗体结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于，Fv、Fab、Fab'、Fab，-SH、 F(ab'）2 ;双抗体；线性抗体；单链抗体分子（例如scFv);和由抗体片段形成的多特异性抗 体。
[0069] 作为参考抗体的"结合相同表位的抗体"指在竞争试验中阻断参考抗体与其抗 原50%或更多的结合的抗体，或者相反地，在竞争试验中参考抗体阻断所述抗体与其抗原 50%或更多的结合。本文提供了示例性竞争试验。
[0070] 术语"嵌合"抗体指其中重链和/或轻链部分来源于特定来源或物种，而剩余的重 链和/或轻链来源于不同的来源或物种的抗体。
[0071] 抗体的"类别"指恒定结构域或其重链具有的恒定区的类型。有五种主要的抗体 类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几种还可分成亚类（同种型），例如IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。对应于不同类型的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为[α ]、 [δ ]、[ ε ]、[ γ ]和[μ ]。
[0072] 本文中术语"Fc区"用于定义包含至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C端区。 所述术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。除非本文中另有定义，Fc区或恒定区中氨基 酸残基的编号根据EU编号系统（也称为EU索引，参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(《免疫学感兴趣的蛋白质序列》），第5版，公共健康服务部 (Public Health Services)，国立卫生研究院（National Institutes of Health)，马里兰 州贝塞斯达，1991)。
[0073] "构架"或"FR"指高变区（HVR)残基以外的可变区残基。可变区的FR通常由四个 FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常出现在VH(或VL)的以下 序列中：FR1-H1 (L1) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4。
[0074] 术语"全长抗体"、"完整抗体"和"全抗体"在本文中可互换使用，以表示具有与天 然抗体结构基本类似的结构或者具有包含本文所定义的Fc区的重链的抗体。
[0075] 术语"宿主细胞"、"宿主细胞系"和"宿主细胞培养物"可互换使用，并且指已引入 外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括"转化株"和"转化细胞"，其包括最 初转化的细胞及其衍生的子代，不计传代次数。子代的核酸含量可不与亲本细胞完全相同， 并可包含突变。本文包括功能或生物活性与在初始转化细胞中筛选或选择的功能或生物活 性相同的突变子代。
[0076] "人抗体"是具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体，或具有的氨基酸 序列来源于非人来源但使用人抗体库的抗体，或具有其它编码人抗体的序列的抗体。人抗 体的这一定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
[0077] "人共有构架"是代表人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选择中最常出现的氨 基酸残基的构架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。 通常，序列的亚组是Kabat等定义的亚组，参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(《免疫学感兴趣的蛋白质序列》），第5版，NIH出版物，马里兰州 贝塞斯达（1991)，卷1-3)。
[0078] "人源化"抗体指含有来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的 嵌合抗体。在某些实施方式中，人源化抗体基本包含至少一个、通常两个可变结构域的全 部，其中，全部或基本全部的HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，并且全部或基本全部 的FR对应于人抗体的那些。人源化的抗体可任选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少 一部分。抗体的"人源化形式"，例如非人抗体，指已经过人源化的抗体。
[0079] "去免疫化"抗体是基于HLA结合（T细胞刺激的基本要求）破坏的免疫原性降低 的抗体。
[0080] 本文所用术语"高变区"或"HVR"指抗体可变结构域的各区域，其中序列高度可 变和/或形成结构上定义的环（"高变环"）。通常，天然的四链抗体包含六个HVR;三个 在VH(HI，H2, H3)，三个在VL(LI，L2, L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自"互补决 定区"（CDR)的氨基酸序列，后者具有最高的序列可变性和/或涉及抗原识别。示例性 高变环出现在氨基酸残基 26-32 (LI)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (HI)、53-55 (H2)和 96-101 (H3) (Chothia 和 Lesk，J_Mol_Biol_ 196:901-917, 1987)。示例性 CDR(CDR-L1、 CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)出现于L1的氨基酸残基24-34、L2的氨基酸残 基50-56、L3的氨基酸残基89-97、Η1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-65以及H3 的氨基酸残基 95-102 (Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest (《免 疫学感兴趣的蛋白质序列》），第5版，公共健康服务部（Public Health Services)，国立 卫生研究院（National Institutes of Health)，马里兰州贝塞斯达，1991)。除VH中的 CDR1外，⑶R通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含与抗原接触的"特异性决定残 基"或"SDR"。SDR包含在称为小型-CDR(abbreviated-CDR)或a-CDR的CDR区中。示例性 a_CDR(a_CDR-Ll、a_CDR-L2、a-CDR-L3、a _CDR_Hl、a-CDR-H2 和 a-CDR-H3)出现于 L1 的氛基 酸残基31-34、L2的氨基酸残基50-55、L3的氨基酸残基89-96、H1的氨基酸残基31-35B、 H2的氨基酸残基50-58以及H3的氨基酸残基95-102(参见Almagro和Fransson，Front. Biosci. 13:1619-1633, 2008)。除非另有说明，本文中根据Kabat等对可变结构域中的HVR 残基和其他残基（例如FR残基）进行编号。
[0081] 本文所用术语"单克隆抗体"指获自基本均一抗体群的抗体，即，除可能的变体抗 体（例如少量存在的包含天然发生的突变或在单克隆抗体制备生产过程中出现的变体）以 夕卜，所述群包含的单独抗体是相同的和/或结合相同的表位。不同于通常包含针对不同决 定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂中的各单克隆抗体均针对抗 原上的单一决定簇。因此，定语"单克隆"表明的抗体特征在于获自基本均一的抗体群，而 不应解释为需要通过任何特定方法产生所述抗体。例如，按照本发明使用的单克隆抗体可 以通过不同技术制备，所述技术包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法和使用 包含全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述用于制备单克隆抗体 的此类方法和其它示例性方法。
[0082] 术语"包装插页"指治疗性产品的商品包装中常包括的说明书，所述说明书包含关 于这类治疗性产品使用的说明、用法、剂量、给药、联合治疗、禁忌症和/或警告的信息。 [0083] 与参照多肽序列相关的"氨基酸序列相同性百分率"被定义为，在对齐所述 序列并引入缺口（如有需要）以达到最大序列相同性百分率之后，候选序列中与参照多肽 序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率，并且认为任何保守性取代都不作为所述 序列相同性的部分。以测定氨基酸序列相同性百分率为目的的比对可以本领域技术范围 内的不同方式实现，例如，使用公共渠道可获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或 Megal ign (DNASTAR)软件。本领域技术人员能够确定用于比对序列的合适参数，包括使比较 的序列实现全长最大对齐所需的任何算法。
[0084]术语"药物制剂"指此类形式的制剂：所述制剂允许其中所含活性成分的生物学活 性有效，并且不含具有待给予该制剂的对象不可接受的毒性的额外成分。
[0085] "药学上可接受的运载体"指药物制剂中活性成分以外的成分，其对对象无毒。药 学上可接受的运载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0086] 本文中所用的"治疗"（及其语法变化形式）指试图改变受治疗的个体的自然病 程，并且可供预防或在临床病理学的病程中采用的临床介入。所需的治疗效果包括但不限 于，预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理学结果、防止转移、 减缓疾病进展速率、改善或减轻疾病状态，和减轻或改善预后。在一些实施方式中，本发明 的抗体用于延迟疾病发展或减缓疾病进展。
[0087] 术语"可变区"或"可变结构域"指涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链结构域。 天然抗体的重链和轻链的可变区（分别为VH和VL)通常具有类似结构，其中各结构域包 含四个保守的框架区（FR)和三个高变区（HYR,参见例如Kindt等，Kuby Immunology (《免 疫学》），第6版，WHF公司（W. H. Freeman and Co.)，第91页，2007)。单个VH或VL结构 域足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用结合特定抗原的抗体的VH或VL结构域以分 离结合所述抗原的抗体来分别筛选互补VL或VH结构域的库（参见例如Portolano等， J. Immunol. 150:880-887, 1993 ;Clarkson 等，Nature 352:624-628, 1991)。
[0088] 本文所用术语"载体"指一种核酸分子，所述核酸分子能够增殖其连接的另一核 酸。该术语包括作为自复制核酸结构的载体以及整合至其引入的宿主细胞基因组的载体。 某些载体能够引导其操作性连接的核酸进行表达。这类载体在本文中称为"表达载体"。 [0089] 在另一个方面，所述抗体或其衍生物包含重链可变结构域（VH)序列，所述序列 与选自下组的氨基酸序列存在至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或 100%的序列相同性：SEQ ID N0:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 或 24。 [0090] 在另一个方面，所述抗体或其衍生物包含轻链可变结构域（VK或VL)序列，所述序 列与选自下组的氨基酸序列存在至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或 100%的序列相同性：SEQ ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21 或 23。 [0091] 在某些实施方式中，与所述SEQ ID No·具有至少80%、85%、90%、91%、92%、 93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %相同性的VH序列或VK/VL序列相对于参考序列 含有取代（例如保守性取代）、插入或缺失，但包含该序列的抗Sp-ADAMTS-5抗体保留了结 合ADAMTS-5的间隔结构域的能力。在某些实施方式中，在⑶ RH3的序列中（如在SEQ ID No. 62中）共取代、插入和/或缺失了 1至4个氨基酸。在某些实施方式中，取代、插入或缺 失发生在HVR外（即在FR中）。
[0092]优选地，本发明的抗体是抗体 CRB0017、CRB0093、CRB0094、CRB0102、CRB0123、 CRB0124,如表III所定义。
[0093]在某些实施方式中，本发明的抗体或其片段的解离常数（Kd)为小于ΙΟΟηΜ、小于 10nM、小于InM、小于(X lnM、小于〇· 〇1油或小于〇. 〇〇inM或更小，例如从10-8M至10-13M， 例如从10-9M至10-13M。
[0094]在一个实施方式中，如以下试验中所述，通过使用感兴趣的抗体的Fab进行了放 射性标记抗原结合试验（RIA)以测量Kd jab对抗原的溶液结合亲和性的测量方法如下：在 未标记抗原的滴定系列（titration series)存在的情况下，使用最小浓度的（I)-标记的 抗原平衡Fab,随后使用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原（参见例如 chen等，j. M〇1. Biol·293:865-881(1999))。
[0095] 通过参考以下附图的非限制性实施例来描述本发明。
[0096] 图1. ADAMTS-4和ADAMTS-5的示意图。两种酶都是从细胞分泌至胞外空间的多结 构域金属蛋白酶。两种酶都具有类似的结构域排布，由信号序列（SS)、前结构域（Pro)、催 化金属蛋白酶结构域（Cat)、去整合素（Dis)结构域、血小板反应蛋白（TS) I型结构域、富半 胱氨酸（CysR)结构域和间隔（Sp)结构域组成。此外，ADAMTS-5在间隔结构域后包含额外 的TS结构域。
[0097] 图2. FPLC纯化后ADAMTS_5p75的Western印记分析，使用抗蛋白的FLAG标签的 抗体。使用识别含有FLAG肽序列的融合蛋白的单克隆抗体探测Western印记（西格玛奥 德里奇公司（Sigma-Aldrich)，单克隆抗FLAG M2,1:1000稀释）。为使用化学发光的过氧 化物酶底物进行检测，使用了抗小鼠 IgG-过氧化物酶（1:10, 000)。TS5二ADAMTS-5转染 的细胞；NT =未转染的细胞；Μ =模拟对照。
[0098] 图3.分离的抗Sp_ADAMTS-5scFv与间隔结构域-GST和GST阴性对照的ELISA反 应性。以10 μ g/mL的浓度包被间隔结构域-GST和GST抗原。以50和/或5 μ g/mL的浓 度使用抗Sp_ADAMTS-5scFV (数据未显示）。显示了两个重复孔中所进行实验的450nm处平 均吸光度，SD以误差线的形式显示。
[0099] 图4.夹心ELISA。3(^8/11^浓度下溶液中包被的0?0017_18〇4与间隔结构 域-GST和/或GST结合的稀释曲线。作为二抗，使用了抗GST (1:1000)，随后使用抗兔IgG HRP(1:2000)进行最终检测。显示了两个重复孔中所进行实验的450nm处平均吸光度，SD 以误差线的形式显示。
[0100] 图5.使用Biacore X-100在溶液中进行的CRB0017_IgG4结合间隔结构域-GST 的动力学分析。将5610RU的CRB0017_IgG4固定在CM5芯片上。分别进行180s和800s的 结合和解离。下表显示了 CRB0017_IgG4/间隔结构域-GST相互作用所确定的动力学速率 常数和亲和性。
[0101] 图6.使用CRB0017_IgG4进行的ADAMTS-5全长（TS5-FL)的免疫沉淀（IP)。使用 抗Sp_ADAMTS-5CRB0017_IgG4抗体（在泳道1、2和3中分别使用11、22和:寒μ|)，或者使 用11μ g的不相关抗体作为阴性对照（泳道4)，对Mg透析/亲和纯化的TS5-FL进行免 疫沉淀（IP)。使用抗FLAG抗体（1:1000)通过免疫印记分析免疫沉淀。对应于TS5-FL p75 蛋白，观察到CRB0017_IgG4-免疫沉淀的约81kDa TS5-FL条带。免疫沉淀的TS5-FL蛋白 的分子量略高于由其氨基酸组成预测的值。该差异是因为Dis、CysR、Sp结构域中的N-糖 基化和C端结构域上的〇-糖基化。图左侧显示了分子量标记。
[0102] 图 7.使用 CRB0017_IgG4 进行的 ADAMTS-4 全长（TS4-FL)的 IP。使用抗 Sp_ ADAMTS-5CRB0017_IgG4抗体（在泳道1和2中分别使用30和60 μ g)，或者使用不相关抗 体（3() pg )作为阴性对照（泳道3)，对0.2yg透析/亲和纯化的TS4-FL进行免疫沉 淀（IP)。在泳道4中，加载了透析/亲和纯化的TS4-FL作为阳性对照。使用抗FLAG抗体 (1:1000)通过免疫印记分析免疫沉淀。对应于TS4-FL p68蛋白，观察到CRB0017_IgG4-免 疫沉淀的约75kDa TS5-FL条带。免疫沉淀的TS4-FL蛋白的分子量略高于由其氨基酸组成 预测的值，这主要是因为该蛋白中存在的N-和0-糖基化。图左侧显示了分子量标记。
[0103] 图8.抗Sp_ADAMTS-5IgG4在IL-1 α诱导的牛软骨体外蛋白水解中的作用。该图 代表了在CRB0017IgG4存在或不存在的条件下孵育48小时后IL_i α 5ng/ml活性（三个不 同的独立实验）。各实验中使用人天然的IgG4(赛罗泰克公司（Serotec))作为阴性对照。 各实验中使用合成的ADAMTS-5抑制剂（Cpd23)和天然的ADAMTS-5抑制剂（TIMP-3)作为 阳性对照。结果以糖胺聚糖（GAG)释放百分比的形式显示，即以蛋白聚糖聚合物片段的形 式从培养的软骨中释放的GAG的量；该方法测量了细胞因子在刺激软骨代谢中的效率。
[0104] 图9.在骨关节炎的STR/ort小鼠模型中螺旋B-ADAMTS-5结合蛋白CRB0016_IgG4 作用的评价。在各动物的两膝中经关节内给予CRB0016_IgG4,第一次在实验开始时给予并 在6周后再次给予，剂量为1、2和12 μ g/膝。第一次给药后三个月时，根据组织病理学评 估，CRB0016_IgG4没有改变STR八)rt小鼠品系中0A的过程。等级定义为通过关节软骨的裂 缝深度。阶段定义为与潜在等级无关的关节室一侧中所涉及软骨的水平程度。总之，两者 一起构建了骨关节炎过程的严重度或病理进展的指标，实际上0ARSI评分定义为等级X阶 段。细胞损失定义为特定关节室中经历细胞死亡的关节软骨细胞占比。GAG(糖胺聚糖）损 失定义为代表针对GAG的异染性的阳离子染色损失并由此进行评估，例如甲苯胺蓝或番红 OoMankin将他的评分定义为等级、细胞损失和GAG损失的总和，同时将总评分定义为0ARSI 评分和细胞损失和GAG损失的总和。所有上述参数构成了 〇A的特性，且其评分用于测量病 变的严重度和发展。
[0105] 图10.在骨关节炎的STR/ort小鼠模型中CRB0017_IgG4作用的评价。在各动物 的两膝中经关节内给予CRB0017_IgG4,第一次在实验开始时给予并在6周后再次给予，剂 量为1、2和12ug/膝。第一次给药后三个月时，在STR/ort小鼠模型中，CRB017_IgG4显 示出降低0A严重度方面剂量依赖的活性。所有参数由图9定义。
[0106] 图11. A)CRB0017_IgG4能够以剂量依赖的方式识别从透化或非透化细胞中分泌 的ADAMTS-5。作为对照，使用了抗ADAMTS-5商品化抗体催化结构域和两个抗ADAMTS-5商 品化抗体cys结构域的抗体。B)CRB0017_IgG4不与在HEK293细胞的细胞表面上的任何蛋 白发生交叉反应。
[0107] 图12.在夹心ELISA中使用以下文材料部分所述进行包被的mAb CRB0017_IgG4 攻击从 Hek293_ADAMTS-5 (ADAMTS-5 浓缩培养基（cond. Medium))和 Hek293 (Hek-293 浓缩 培养基）收获的上清液。"无 mAb CRB0017"是孔未包被CRB0017_IgG4的对照条件，"无培 养基"是孔中未加入上清液的对照条件，"Ab"是孔中仅加入二抗的对照条件。如图所示， CRB0017_IgG4能够以高特异性识别从表达HEK293的细胞中分泌的ADAMTS-5。
[0108] 图13.单侧内侧半月板撕裂模型（MMT)是一种广泛使用的膝0A的大鼠外科模型。 发生了快速进展的退行性变化，包括软骨细胞和蛋白聚糖损失、基质原纤化和产生裂缝、形 成骨刺。手术后一周，使用CRB001 7_IgG4 35ug/膝、CRBOOHYOyg/膝或载剂经关节内 给予大鼠。注射后三周时，处死动物并处理股胫关节用于组织学分析。与载剂相比，使用 CRB0017_IgG4治疗后所有组织学评分均出现了剂量依赖的下降。
[0109] 图14.游离的多配聚糖_4对mAb ADAMTS-5与mAb CRB0017包被平板结合的竞争 性抑制。阻断前使mAb CRB0017(包被缓冲液中2yg/ml)吸附至免疫板。加入经固定的 11^13〇^0017前，使六0六1?^-5(4以8/1111)在多配聚糖-4(0.1以8/1111)存在的情况下孵育。使 用抗FLAG商品化抗体显示ADAMTS-5与mAbCRB0017包被平板的结合。
[0110] 图 15. mAbs 抗间隔结构域CRB0017_IgG4、CRBO〇93_IgG4、CRB〇 94_IgG4和 CRB0124_ IgG4能够在夹心ELISA中以相当的特异性特异地识别全长ADAMTS-5。该试验中，mAb CRB0123_IgG4对ADAMTS-5的结合能力高于其他抗间隔结构域mAb。
[0111] 发明详述
[0112] 序列描述
[0113] SEQ· ID N0:1 :ATS4_A，具有血小板反应蛋白基序4的去整合素和金属蛋白酶 (UniProtKB/Swiss-Prot:075173. 3)
[0114] SEQ. ID N0:2 :ATS5_A，具有血小板反应蛋白基序5的去整合素和金属蛋白酶 (UniProtKB/Swiss-Prot:Q9UNA0. 2)
[0115] 下文中：VK =轻链，VH =重链，CDRL =轻链互补决定区，⑶RH =重链互补决定区。
[0116] SEQIDNO:3至SEQIDNO:94，SEQIDNO:125至132以及SEQIDNO:135至SEQ ID N0:137是氨基酸序列，SEQ ID N0:95至120是核苷酸序列。
[0117] SEQ. ID N0:3,CRB0017VK
[0118] SEQ. ID N0:4, CRB0017VH
[0119] SEQ. ID N0:5, CRB0018VK
[0120] SEQ. ID N0:6, CRB0018VH
[0121] SEQ. ID N0:7, CRB0019VK
[0122] SEQ. ID N0:8, CRB0019VH
[0123] SEQ. ID N0:9, CRB0091VK
[0124] SEQ. ID NO: 10, CRB0091VH
[0125] SEQ. ID NO: 11, CRB0092VL
[0126] SEQ. ID NO: 12, CRB0092VH
[0127] SEQ. ID NO: 13, CRB0093VK
[0128] SEQ. ID NO: 14, CRB0093VH
[0129] SEQ. ID NO: 15, CRB0094VL
[0130] SEQ. ID N0:16, CRB0094VH
[0131] SEQ. ID NO: 17, CRB0102VK
[0132] SEQ. ID NO: 18, CRB0102VH
[0133] SEQ. ID NO: 19, CRB0122VL
[0134] SEQ. ID NO: 20, CRB0122VH
[0135] SEQ. ID NO: 21, CRB0123VK
[0136] SEQ. ID NO :22, CRB0123VH
[0137] SEQ. ID NO :23, CRB0124VL
[0138] SEQ. ID NO :24, CRB0124VH
[0139] SEQ. ID NO :25, CRB0016VK
[0140] SEQ. ID NO :26, CRB0016VH
[0141] SEQ. ID NO :27, CDRL1-17
[0142] SEQ. ID NO: 28, CDRL2_17
[0143] SEQ. ID NO: 29, CDRL3_17
[0144] SEQ. ID N0:30, CDRL1-18 〔0145U gmpID NO: 310DRL2I18 〔0146U gmpΙο NO: 320DRL3I18 〔0147U gmpid NO: 330DRLI19 〔0148〕 SEPID NO: 340DRL2I19 〔0149U gmpΙο NO: 350DRL3I19 〔015s SEQ· ID NO: 360DRLI91 〔0151U gmpΙα NO: 370DRL2I91 〔0152U gmpΙα NO: 380DRL3I91 〔0153U gmpid NO: 390DRLI92 〔01541--1gmpid NO: 400DRL2I92 〔015s SEQ· ID NO :410DRL3I92 〔0156U gmpid NO: 420DRLI93 〔01571--1gmpid NO: 430DRL2I93 〔01581--1gmpΙο NO: 440DRL3I93 〔0152gmpΙο NO: 450DRLIM〔016Sgmpid NO: 460DRL2IM S161I--Igmpid NO: 470DRL3IM 〔0162U gmpΙα NO: 480DRLI102 〔0163U gmpid NO: 490DRL2I102 〔0164U gmpΙο NO: 500DRL3I102 〔0165〕 SEQ· ID NO: 510DRLI122 〔0166U gmpΙο NO: 520DRL2I122 〔0167U gmpid NO: 530DRL3I122 〔0168〕 SEQ· ID NO: 540DRL1I123 〔0169U gmpΙο NO: 550DRL2I123 〔017s SEPID NO: 560DRL3I123〔01711--1gmpid NO: 570DRLI1M 〔01721--1gmpid NO: 580DRL2I1M 〔01731--1gmpid NO: 590DRL3I1M 〔01741--1gmpid NO: 600DRHI17〔0175〕 SEPID NO :610DRH2I17 〔0176〕 SEPID NO: 620DRH3I17 〔0177〕 gmpid NO: 630DRHI18 〔0178〕 SEPID NO: 640DRH2I18 〔0179〕 SEPID NO: 650DRH3I18 〔0180〕 SEPID NO: 660DRHI19 〔0181〕 gmpid NO: 670DRH2I19 〔0182〕 SEPID NO: 680DRH3I19 〔0183U gmpid NO: 690DRHI91
[0184] SEQ. ID NO: 70, CDRH2_91
[0185] SEQ. ID N0:71, CDRH3_91
[0186] SEQ. ID N0:72, CDRH1_92
[0187] SEQ. ID N0:73, CDRH2_92
[0188] SEQ. ID N0:74, CDRH3_92
[0189] SEQ. ID N0:75, CDRH1_93
[0190] SEQ. ID N0:76, CDRH2_93
[0191] SEQ. ID NO: 77, CDRH3_93
[0192] SEQ. ID N0:78, CDRH1_94
[0193] SEQ. ID N0:79, CDRH2_94
[0194] SEQ. ID N0:80, CDRH3_94
[0195] SEQ. ID N0:81, CDRH1_102
[0196] SEQ. ID N0:82, CDRH2_102
[0197] SEQ. ID N0:83, CDRH3_102
[0198] SEQ. ID N0:84, CDRH1_122
[0199] SEQ. ID N0:85, CDRH2_122
[0200] SEQ. ID N0:86, CDRH3_122
[0201] SEQ. ID N0:87, CDRH1_123
[0202] SEQ. ID N0:88, CDRH2_123
[0203] SEQ. ID N0:89, CDRH3_123
[0204] SEQ. ID N0:90, CDRH1_124
[0205] SEQ. ID N0:91, CDRH2_124
[0206] SEQ. ID N0:92, CDRH3_124
[0207] SEQ. ID NO:93, lexA-间隔结构域
[0208] SEQ. ID NO:94,间隔结构域-GST
[0209] SEQ. ID NO :95, CRB0016_VK
[0210] SEQ. ID N0:96, CRB0016_IgG4
[0211] SEQ. ID N0:97, CRB0017_VK_CK
[0212] SEQ. ID NO:98, CRB0017_IgG4
[0213] SEQ. ID NO :99, CRB0017_VK
[0214] SEQ. ID NO: 100, CRB0017_VH
[0215] SEQ. ID NO: 101, CRB0018_VK
[0216] SEQ. ID NO: 102, CRB0018_VH
[0217] SEQ. ID NO: 103, CRB0019_VK
[0218] SEQ. ID NO: 104, CRB0019_VH
[0219] SEQ. ID NO: 105, CRB0091_VK
[0220] SEQ. ID NO: 106, CRB0091_VH
[0221] SEQ. ID NO:107, CRB0092_VL
[0222] SEQ. ID NO: 108, CRB0092_VH
[0223] SEQ. ID NO: 109, CRB0093_VK
[0224] SEQ. ID NO:110, CRB0093_VH
[0225] SEQ. ID NO: 111, CRB0094_VL
[0226] SEQ. ID NO:112, CRB0094_VH
[0227] SEQ. ID NO: 113, CRB0102_VL
[0228] SEQ. ID NO: 114, CRB0102_VH
[0229] SEQ. ID NO: 115, CRB0122_VL
[0230] SEQ. ID NO: 116, CRB0122_VH
[0231] SEQ. ID NO: 117, CRB0123一VK
[0232] SEQ, ID NO: 118, CRB0123_VH
[0233] SEQ. ID NO: 119, CRB0124_VL
[0234] SEQ. ID NO:120, CRB0124_VH
[0235] SEQ. ID NO: 121,人间隔结构域 _M
[0236] SEQ. ID N0:122,螺旋 _B_ADAMTS-5_M
[0237] SEQ. ID NO: 123,人间隔结构域
[0238] SEQ. ID N0:124,螺旋 _B_ADAMTS_5
[0239] SEQ. ID NO:125, CRB0017-scFv
[0240] SEQ. ID NO:126, CRB0018_scFv
[0241] SEQ. ID NO:127, CRB0019_scFv
[0242] SEQ. ID NO:128, CRB0091_scFv
[0243] SEQ.ID NO:129, CRB0092_scFv
[0244] SEQ. ID NO:130, CRB0093_scFv
[0245] SEQ. ID NO: 131, CRB0094_scFv
[0246] SEQ. ID NO:132, CRB0102_scFv
[0247] SEQ. ID N0:133,人 ADAMTS-5-cDNA
[0248] SEQ. ID N0:134,人 ADAMTS-4_cDNA
[0249] SEQ. ID NO:135, CRB0122_scFv
[0250] SEQ. ID NO:136, CRB0123_scFv
[0251] SEQ. ID NO:137, CRB0124-scFv
[0252] SEQ. ID NO: 138,小肽接头
[0253] SEQ. ID NO: 139-216,合成的引物
[0254] 材料和方法
[0255] 来自人淋巴细胞的SPLINT文库
[0256] 用于人类疾病治疗的治疗性抗体的开发长期以来始终是抗体领域许多研 究人员的目标。获得这类抗体的一种方法是通过由人淋巴细胞构建的胞内抗体的 单爸文库（Single Pot Library of Intracellular Antibodies)(SPLINT 文库）。 SPLINT 技术表达 pMVl 载体（来源于 pLinker220 载体（Visintin 等，2004. JImmunol Methods. 290:135-153))中克隆的人scFv(单链抗体片段）文库，其与Vpi6激活结构域融 合。可变区与小肽接头（SGGSTSGSGKPGSGEGSSGT，SEQ ID No. 138)连接。pMVl 含有 LEU2 基 因和bla基因，所述LEU2基因使质粒维持并在缺少亮氨酸的培养基上在酵母株系L40中进 行选择，所述bla基因使质粒在大肠杆菌中进行选择。
[0257] 为构建人SPLINT文库，使用了来自100个未免疫供体的外周血。收集了来自各供 体的约2-20ml血液样本。使用Ficoll plaque试剂（安玛西亚公司（Amersham)，美国）从 外周血中分离B淋巴细胞。简言之，将稀释的血液样本（血液与PBS的比例为1:1)小心叠 放在Ficoll plaque试剂顶部，随后将两相溶液以400 Xg离心30分钟。从两相之间的界面 处收集B淋巴细胞。使用RNeasy小型试剂盒（凯杰公司（Qiagen))根据生产商说明书从 B淋巴细胞中提取总RNA。从B淋巴细胞中制备总RNA，并在用于分离mRNA前收集总RNA。 使用Oligotex mRNA小型试剂盒（凯杰公司（Qiagen))根据生产商说明书制备mRNA。根 据生产商说明书使用Therm〇S CriptTMRT-PCR系统（英杰公司（Invitrogen))进行cDNA合 成反应。使用寡（dT)20以合成V-基因库的cDNA。为减少扩增偏置，发明人使用引物组中 所有可能的组合（对于huSPLINT_09参见表I ;对于huSPLINT_10参见表II)进行了 62次 (对huSPLINT_09)和75次（对huSPLINT_10)独立的PCR反应以扩增V基因片段。
[0258] 理论上涵盖整个人抗体基因库的引物序列获自頂GT/GENE-DB (Giudicel 1 i 等，2〇〇5· Stud Health Technol Inform. II6:3-8)，并根据先前公开的方法改良 (Sblattero 和 Bradbury,1998· Immunotechnology. 3:271-278) ; (Marks 等，1991. Eur J Immunol· 21:985-991) ; (Orlandi 等，1992.Biotechnology. 24:527-531)。在该 方法中，单个重排的重链和轻链可变区独立地扩增并通过一系列重叠的聚合酶链式反 应（PCR)步骤连接以得到用于克隆的最终 scFv产物（Visintin等，2004. J Immunol Methods. 290:135-153)。
[0259] 用于huSPLINT_9(表I)的PCR反应包括7个VH正向引物和与之配对的4个VH 反向引物，生成总共28个反应；而4个Vk正向引物和与之配对的4个反向引物生成了总 共16个反应；9个νλ正向引物和与之配对的2个νλ反向引物生成了总共18个反应。 [0260] 表I :人V-基因链的huSPLINT_09PCR反向（rv)和正向（fw)引物。
[0261]

【权利要求】
1. 一种能够识别并结合表位的抗体、其重组或合成的抗原结合片段，所述表位包含于 ADAMTS-5的SEQ ID No. 2的氨基酸732至氨基酸874的区域中。
2. 如权利要求1所述的抗体、其重组或合成的抗原结合片段，所述抗体、其重组或合成 的抗原结合片段包含至少一个重链互补决定区（⑶RH3)氨基酸序列，所述⑶RH3氨基酸序 列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID N0:62、65、68、71、74、77、80、 83、86、89 和 92。
3. 如权利要求2所述的抗体、其重组或合成的抗原结合片段，所述抗体、其重组或合成 的抗原结合片段还包含至少一个重链互补决定区（⑶RH2)氨基酸序列，所述⑶RH2氨基酸 序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID N0:61、64、67、70、73、76、 79、82、85、88 和 91。
4. 如权利要求3所述的抗体、其重组或合成的抗原结合片段，所述抗体、其重组或合成 的抗原结合片段还包含至少一个重链互补决定区（⑶RH1)氨基酸序列，所述⑶RH1氨基酸 序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID N0:60、63、66、69、72、75、 78、 81、84、87 和 90。
5. 如权利要求2-4中任一项所述的抗体、其重组或合成的抗原结合片段，所述抗体、 其重组或合成的抗原结合片段还包含至少一个轻链互补决定区（CDRL3)氨基酸序列，所述 CDRL3氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID N0:29、32、35、 38、41、44、47、50、53、56 和 59。
6. 如权利要求5所述的抗体、其重组或合成的抗原结合片段，所述抗体、其重组或合成 的抗原结合片段还包含至少一个轻链互补决定区（⑶RL2)氨基酸序列，所述⑶RL2氨基酸 序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：28、31、34、37、40、43、46、49、52、55 和58。
7. 如权利要求6所述的抗体、其重组或合成的抗原结合片段，所述抗体、其重组或合成 的抗原结合片段还包含至少一个轻链互补决定区（⑶RL1)氨基酸序列，所述⑶RL1氨基酸 序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：27、30、33、36、39、42、45、48、51、54 和57。
8. 如前述权利要求中任一项所述的抗体、其重组或合成的抗原结合片段，所述抗体、 其重组或合成的抗原结合片段包含至少一个重链互补决定区（CDRH1)氨基酸序列，所述 CDRH1氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID N0:60、63、66、 69、72、75、78、81、84、87和90;以及重链互补决定区（〇)冊2)氨基酸序列，所述〇)冊2氨基 酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID N0:61、64、67、70、73、76、 79、 82、85、88和91;以及重链互补决定区〇：0冊3)氨基酸序列，所述^冊3氨基酸序列与选 自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID N0:62、65、68、71、74、77、80、83、86、 89 和 92。
9. 如权利要求8所述的抗体、其重组或合成的抗原结合片段，所述抗体、其重组或合成 的抗原结合片段还包含至少一个轻链互补决定区（⑶RL1)氨基酸序列，所述⑶RL1氨基酸 序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80 %的相同性：SEQ ID NO: 27、30、33、36、39、42、 45、48、51、54和57;以及轻链互补决定区〇^此2)氨基酸序列，所述^此2氨基酸序列与选 自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性：SEQ ID N0:28、31、34、37、40、43、46、49、52、 55和58;以及轻链互补决定区（CDRL3)氨基酸序列，所述CDRL3氨基酸序列与选自下组的 氨基酸序列具有至少 80%的相同性：SEQ ID N0:29、32、35、38、41、44、47、50、53、56 和 59。
10. 如权利要求8所述的抗体、其重组或合成的抗原结合片段，所述抗体、其重组或合 成的抗原结合片段包含与SEQ ID No. 60具有至少80%相同性的⑶RH1氨基酸序列，与SEQ ID No. 61具有至少80%相同性的CDRH2氨基酸序列，以及与SEQ ID No. 62具有至少80% 相同性的CDRH3氨基酸序列。
11. 如权利要求10所述的抗体、其重组或合成的抗原结合片段，所述抗体、其重组或合 成的抗原结合片段还包含与SEQ ID No. 27具有至少80%相同性的⑶RL1氨基酸序列，与 SEQ ID No. 28具有至少80%相同性的CDRL2氨基酸序列，以及与SEQ ID No. 29具有至少 80 %相同性的⑶RL3氨基酸序列。
12. 如权利要求8所述的抗体、其重组或合成的抗原结合片段，所述抗体、其重组或合 成的抗原结合片段包含与SEQ ID No. 81具有至少80%相同性的⑶RH1氨基酸序列，与SEQ ID No. 82具有至少80%相同性的CDRH2氨基酸序列，以及与SEQ ID No. 83具有至少80% 相同性的⑶RH3氨基酸序列。
13. 如权利要求12所述的抗体、其重组或合成的抗原结合片段，所述抗体、其重组或合 成的抗原结合片段还包含与SEQ ID No. 48具有至少80%相同性的⑶RL1氨基酸序列，与 SEQ ID No. 49具有至少80%相同性的CDRL2氨基酸序列，以及与SEQ ID No. 50具有至少 80 %相同性的⑶RL3氨基酸序列。
14. 如权利要求8所述的抗体、其重组或合成的抗原结合片段，所述抗体、其重组或合 成的抗原结合片段包含与SEQ ID No. 87具有至少80%相同性的⑶RH1氨基酸序列，与SEQ ID No. 88具有至少80%相同性的CDRH2氨基酸序列，以及与SEQ ID No. 89具有至少80% 相同性的CDRH3氨基酸序列。
15. 如权利要求14所述的抗体、其重组或合成的抗原结合片段，所述抗体、其重组或合 成的抗原结合片段还包含与SEQ ID No. 54具有至少80%相同性的⑶RL1氨基酸序列，与 SEQ ID No. 55具有至少80%相同性的CDRL2氨基酸序列，以及与SEQ ID No. 56具有至少 80 %相同性的⑶RL3氨基酸序列。
16. 如前述权利要求中任一项所述的抗体、其重组或合成的抗原结合片段，所述抗体、 其重组或合成的抗原结合片段是单克隆抗体或嵌合或人源化的，或去免疫化的或完全人抗 体。
17. 用于治疗和/或预防软骨降解相关病症的前述权利要求中任一项所述的抗体、其 重组或合成的抗原结合片段。
18. 用于治疗和/或预防骨人关节炎或类风湿性关节炎的前述权利要求中任一项所述 的抗体、其重组或合成的抗原结合片段。
19. 一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1-18中定义的抗体、其重组或合成的 抗原结合片段。
20. 如权利要求19所述的编码抗体、其重组或合成的抗原结合片段的核酸分子，所述 核酸分子包含至少一个选自SEQ ID No. 99至SEQ ID No. 120的核酸序列。
21. -种表达载体，所述表达载体编码如权利要求1-18中任一项所述的抗体。
22. -种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求19或20所述的核酸。
23. 如权利要求22所述的宿主细胞，所述宿主细胞产生如权利要求1-18中任一项所述 的抗体。
24. -种产生如权利要求1-18中任一项所述抗体的方法，所述方法包括培养如权利要 求23所述产生抗体的细胞并从细胞培养物中回收所述抗体。
25. -种药物组合物，所述药物组合物包含至少一种如权利要求1-18中任一项所述的 抗体、其重组或合成的抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂。
26. 如权利要求25中所述的组合物在关节内给药中的用途。
【文档编号】C07K16/40GK104245737SQ201380019819
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年4月12日 优先权日:2012年4月13日
【发明者】R·秋萨洛利, M·维辛廷, G·卡塞利, L·C·罗瓦迪 申请人:罗达制药生物技术有限责任公司