人源化抗-C5aR抗体的制作方法

人源化抗-C5aR抗体的制作方法
【专利摘要】本发明提供了人源化抗-C5aR抗体。本发明涉及与人C5a受体结合的人源化抗体及其作为治疗和诊断药剂的用途。本发明进一步涉及编码所述人源化抗体的核酸序列，及其在重组宿主细胞中的表达。特别地，本发明涉及来源于与人C5a受体特异性结合的小鼠抗体7F3的人源化抗体。
【专利说明】人源化抗-C5aR抗体
[0001] 本申请是申请日为2009年2月19日的题为"人源化抗-C5aR抗体"的中国专利 申请No. 200980105691. 9的分案申请。

【技术领域】
[0002] 本发明涉及与人C5a受体结合的人源化抗体及其作为治疗和诊断药剂的用途。本 研究中进一步涉及编码所述人源化抗体的核酸序列，及其在重组宿主细胞中的表达。特别 地，本发明涉及来源于与人C5a受体特异性结合的小鼠抗体7F3的人源化抗体。

【背景技术】
[0003] 每种补体蛋白C3 - C5的蛋白水解都会产生称为过敏毒素的含有信号分子的氨基 末端阳离子片段。这些片段中最有效的片段C5a引发了最广泛的反应。认为炎症反应的 组成部分是白细胞边集（margination)和浸润、颗粒结合型蛋白水解酶（granule-bound proteolytic enzyme)的释放、活性氧和氮源自由基的产生、血流和毛细血管渗透性改变以 及具有收缩平滑肌的能力，C5a分子是"完全的"促炎性介质。C5a分子在次纳摩尔到纳摩 尔水平上引发的所有髓系细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞、巨噬细胞和 单核细胞）的化学趋化作用，并引起血管通透，前列腺素和循环白细胞显著地增强了血管 通透性。较高的纳摩尔浓度可以引发NADPH氧化酶的脱粒和活化。这种生物活性的广度与 其他炎性介质形成鲜明对比。C5a参与包括风湿性关节炎、牛皮癣、败血症、再灌注损伤和 成年呼吸窘迫综合症在内的各种疾病的发病机制（Gerard and Gerard, 1994 ;Murdoch and Finn,2000)〇
[0004] C5a通过与其受体（C5aR)的结合介导C5a的活性。C5aR属于七次跨膜的G-蛋白 偶联受体家族。C5aR是对C5a具有高亲和力的受体，其中Kd为?InM，其位于包括白细胞 在内的一些不同细胞类型上。每个细胞的受体数量都非常高，每个白细胞可高达200, 000 个位点。受体的生物活化发生在使结合饱和的范围内。
[0005] C5aR结构符合七次跨膜受体家族，紧接于细胞外N-末端之后的是七个跨膜螺旋， 七个跨膜螺旋通过螺旋间结构域连接，螺旋间结构域交互地作为细胞内和细胞外环，以细 胞内C-末端结构域为终点。C5aR含有延伸的N-末端细胞外结构域。这种大型的N-末端 结构域是典型的结合包括IL-8和fMet-Leu-Phe (FMLP)受体家族的肽的G-蛋白偶联受体。
[0006] 用C5aR拮抗剂抑制C5a反应可减少由C5a介导的急性炎性反应，而不影响其他 补体成分。为了这个目的，先前已经描述了 C5aR肽拮抗剂和抗_C5a受体抗体（Watanabe 等人，1995 ;Pellas 等人，1998 ;Konteatis 等人，1994 ;Kaneko 等人，1995 ;Morgan 等 人，1993)。例如，W095/00164描述了针对C5aR的N-末端肽（残基9-29)的抗体。
[0007] W003/062278也描述了针对C5aR的抗体。这些小鼠抗体中的三个称为7F3、6C12 和12D4。这些抗体显示出优异的性质，例如可非常有效地阻断C5a结合到它的受体，中止体 外中性粒细胞的C5a-定向迁移，并阻止动物模型中的炎症。为了控制慢性疾病，有必要在 数月或数年内连续几次给予小鼠抗体。然而，给予小鼠抗体的一个缺点是人免疫系统可产 生针对小鼠抗体（HAMA反应）其自身的抗体。HAMA反应通过从血液迅速清除小鼠抗体使它 们无效，从而阻止小鼠抗体与它的靶结合。
[0008] 为了避免形成HAMA反应，已采取的一个方法是通过用人序列取代非表位结合区 中的许多"外来"残基而"人源化"小鼠抗体。然而，这个过程通常导致抗原性的丧失。而 且，人源化抗体领域的研究人员一直在努力确定能可靠生产具有人治疗中使用的所有必需 要求的人源化抗体的合适方法。
[0009] 人源化步骤的主要问题在于对抗原的亲和力的丧失（Jones等人，1986)，在一些 情况下，损失到十分之一或更少，尤其当抗原是蛋白质时（Verhoeyen等人，1988)。当然，任 何亲和力的丧失都是及其不愿意看到的。至少，它意味着必需将更多人源化抗体以更高代 价和更大副作用的风险注射到病人中。更严重地，亲和力减小的抗体的生物功能如补体裂 解、抗体依赖的细胞毒性或病毒中和作用较差。因而，对基于人源化的治疗或诊断应用有用 的任何最后抗体的结构都是当前不可预知的，通常需要数个技术的多次重复和应用从而获 得有用的人源化抗体。
[0010] 需要可用于诊断和/或治疗方法中的可替换的和/或改进的C5aR拮抗剂。特别 地，需要开发用于所述人的诊断和/或治疗方法的适宜的人源化抗_C5aR抗体。


【发明内容】

[0011] 已生产了大量结合C5aR的人源化抗体，但具有结合特异性差和/或其他不期望的 特性。然而，本发明的发明人生产了几种相关的人源化抗体，其具有用于人的诊断和/或治 疗方法的合适活性。
[0012] 第一方面，本发明提供了基本上纯化的和/或重组的人源化抗体，其包含
[0013] i)包含可变区的免疫球蛋白轻链，该可变区包含与SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32、 SEQ ID N0:33和SEQ ID N0:48中的一个或多个序列至少93%相同的氨基酸序列，和/或
[0014] ii)包含可变区的免疫球蛋白重链，该可变区包含与SEQ ID N0:34、SEQ ID N0:35、SEQ ID N0:36和SEQ ID N0:39中的一个或多个序列至少90%相同的氨基酸序列，
[0015] 其中该抗体结合人C5aR。
[0016] 在优选的实施例中，免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含选自由SEQ ID N0:34、SEQ ID N0:35和SEQ ID N0:36组成的组的氨基酸序列。更优选地，免疫球蛋白重 链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID N0:36提供的氨基酸序列。
[0017] 在另一个优选的实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含选自由SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32和SEQ ID N0:33组成的组的氨基酸序列。更优选地，免疫球蛋白 轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID N0:31提供的氨基酸序列。
[0018] 在特别优选的实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID N0:31提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID N0:36 提供的氨基酸序列。优选地，免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID N0:41 提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID N0:42、SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:44或SEQ ID N0:45提供的氨基酸序列。更优选地，免疫球蛋白轻链包含 恒定区，该恒定区包含由SEQ ID N0:41提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区， 该恒定区包含由SEQ ID N0:43或SEQ ID N0:45提供的氨基酸序列，更优选SEQ ID N0:45。
[0019] 在一个实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID N0:31提 供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO: 34提供的氨 基酸序列。优选地，免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID N0:41提供的氨 基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID N0:42或SEQ ID N0:43 提供的氨基酸序列。
[0020] 在另一个实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID N0:32 提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID N0:34提供的 氨基酸序列。优选地，免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID NO:41提供的氨 基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID N0:42或SEQ ID N0:43 提供的氨基酸序列。
[0021] 在进一步的实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID N0:33提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID N0:34 提供的氨基酸序列。优选地，免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID N0:41 提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID N0:42、SEQ ID NO :43或SEQ ID NO :44提供的氨基酸序列。
[0022] 在又一个实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID N0:31 提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID N0:35提供的 氨基酸序列。优选地，免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID N0:41提供的 氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID N0:42、SEQ ID N0:43、 SEQ ID NO :44或SEQ ID NO :45提供的氨基酸序列。
[0023] 在另一个实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID N0:32 提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID N0:35提供的 氨基酸序列。优选地，免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID N0:41提供的 氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID N0:43提供的氨基酸 序列。
[0024] 在进一步的实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO:33提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO:35提 供的氨基酸序列。优选地，免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID N0:41提 供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID N0:43提供的氨 基酸序列。
[0025] 在另一个的实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO:32提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO:36提 供的氨基酸序列。优选地，免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID N0:41提 供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID N0:43提供的氨 基酸序列。
[0026] 在进一步的实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO:33提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含由SEQ ID NO:36提 供的氨基酸序列。优选地，免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID N0:41提 供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含由SEQ ID N0:43提供的氨 基酸序列。
[0027] 在优选的实施例中，该抗体可在人C5aR的第二细胞外环上结合抗原表位 EEYFPP(SEQ ID N0:38)。在进一步的实施例中，该抗体没有在人C5aR的N-末端上可检测 地结合抗原表位 PDYGHYDDKDTLDLNTPVDKT(SEQ ID N0:59)。
[0028] 在优选的实施例中，抗体结合人C5aR，该抗体的亲和力至少在7F3的8倍以内，更 优选至少在7F3的4倍以内，甚至更优选在7F3的3倍以内。
[0029] 在优选的实施例中，对于表达人C5aR的人中性粒细胞而言，本发明抗体的EC5Q小 于4. 5nM。在可替换的实施例中，本发明抗体的EC5Q小于3nM，小于2nM，或小于InM。用于 表达C5aR的人中性粒细胞抗体的EC 5(I可按实施例3中描述的方法确定。
[0030] 在另一个实施例中，本发明抗体能够使人中性粒细胞迁移降低至少40%，更优选 至少50%，更优选至少60%，更优选至少70%，以及甚至更优选80%。在进一步的实施例 中，本发明抗体阻断C5aR诱导的人中性粒细胞迁移的能力比7F3强，至少强2倍，甚至更优 选强5倍。人中性粒细胞迁移的降低可按实施例5中描述的方法确定。
[0031] 在进一步的实施例中，本发明抗体没有可检测地活化人中性粒细胞。中性粒细胞 活化可通过分析⑶62L和⑶lib表达，和/或超氧化物产生确定，如实施例7中所述。
[0032] 在又一个实施例中，本发明抗体没有可检测地消耗（deplete)回体法中来自血液 的中性粒细胞或单核细胞。回体法中（ex vivo)中性粒细胞或单核细胞的消耗可按实施例 8和9中描述的方法确定。
[0033] 在进一步的实施例中，本发明抗体能够阻断C5a诱导的Ca2+向人中性粒细胞的 流入，抗体的浓度小于30 μ g/mL，更优选小于10 μ g/mL，更优选小于5 μ g/mL，更优选小于 1 μ g/mL。阻断C5a诱导的Ca2+流入人中性粒细胞可按实施例6中描述的方法确定。
[0034] 在一个实施例中，本发明抗体是非消耗性（non-depleting)和非活化性 (non-activating)的。此处描述的此种抗体的实施例是hAb-Q。在可替换的实施例中，本 发明的抗体是消耗性的和非活化性的。此处描述的此种抗体的实施例是hAb-N。
[0035] 在优选的实施例中，
[0036] i)免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含与SEQ ID N0:40和SEQ ID N0:41 中的一个或多个序列至少90%相同的氨基酸序列，和
[0037] ii)免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含与SEQ ID N0:42、SEQ ID N0:43、 SEQ ID N0:44和SEQ ID N0:45中的一个或多个序列至少90%相同的氨基酸序列，更优选 地，
[0038] i)免疫球蛋白轻链包含恒定区，该恒定区包含与SEQ ID:41至少90%相同的氨基 酸序列，和
[0039] ii)免疫球蛋白重链包含恒定区，该恒定区包含与SEQ ID N0:45至少90%相同的 氨基酸序列。
[0040] 人源化抗体可以是本领域中已知的任何适宜的结构。实施例包括，但不限于， 由两条重链和两条轻链组成的四多肽链结构、单链抗体、双链抗体（diabody)、三链抗体 (triabody)或四链抗体（tetrabody)，以及抗体片段，例如，但不限于Fab片段或单域抗体。
[0041] 另一方面，本发明提供了包含可变区的基本上纯化的和/或重组的免疫球蛋白轻 链，该可变区包含与 SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32、SEQ ID N0:33 和 SEQ ID N0:48 中的一 个或多个序列至少93%相同的氨基酸序列。
[0042] 在优选的实施例中，免疫球蛋白轻链包含可变区，该可变区包含与SEQ ID N0:31 至少93 %相同的氨基酸序列。
[0043] 在进一步的实施例中，本发明提供了包含可变区的基本上纯化的和/或重组的免 疫球蛋白重链，该可变区包含与SEQIDN0:34、SEQIDN0:35、SEQIDN0:36和SEQID N0:39中一个或多个序列至少90%相同的氨基酸序列。
[0044] 在优选的实施例中，免疫球蛋白重链包含可变区，该可变区包含与SEQ ID N0:36 至少90 %相同的氨基酸序列。
[0045] 另一方面，本发明提供了包含本发明免疫球蛋白轻链和/或本发明免疫球蛋白重 链的基本上纯化的和/或重组的抗体，其中该抗体可结合人C5aR。
[0046] 也提供了包含本发明抗体和直接或间接结合到抗体的治疗剂的结合物。治疗剂的 实施例包括，但不限于，细胞毒素、放射性同位素（例如，碘-131、钇-90或铟-111)、免疫调 节药剂、抗血管新生（angiogenic)药剂、抗-新血管形成和/或其他血管形成药剂、毒素、 抗-增殖药剂、促凋亡（Pro-apoptotic)药剂、化疗剂，和治疗核酸。
[0047] 在一个实施例中，毒素是假单胞杆菌（绿脓杆菌，Pseudomonas)外毒素或其衍生 物。
[0048] 在进一步的实施例中，治疗剂经由接头（linker)间接结合到抗体。实施例包 括，但不限于4-(4'乙酰基苯氧基）丁酸（AcBut)、3_乙酰基苯基酸性酸（AcPac)、4_巯 基-4-甲基-戊酸（酰胺）和其衍生物。
[0049] 另一方面，本发明提供了包含本发明抗体和直接或间接结合到抗体的可检测标签 的结合物。适宜的标签的实施例包括，但不限于，放射性标签、荧光标签、酶标签和显像剂 (成像剂）。
[0050] 在进一步的方面，本发明提供了编码本发明抗体或其链、本发明的免疫球蛋白轻 链、本发明的免疫球蛋白重链和/或本发明的结合物的分离的和/或外源的多核苷酸。
[0051] 优选地，该多核苷酸包含由SEQ ID N052?57中任一个提供的序列。
[0052] 另一方面，本发明提供了包含本发明多核苷酸的载体。优选地，该载体是表达载 体。更优选地，该多核苷酸可操作地连接到启动子。
[0053] 另一方面，本发明提供了包含本发明多核苷酸和/或本发明载体的宿主细胞。该 宿主细胞可以是任何细胞类型，例如细菌、酵母、植物或动物细胞。
[0054] 也提供了包含本发明细胞的非人转基因生物。
[0055] 也提供了组合物，该组合物包含本发明抗体、本发明免疫球蛋白轻链、本发明的免 疫球蛋白重链、本发明结合物、本发明多核苷酸、本发明载体和/或本发明宿主细胞，以及 药用载体（carrier)。
[0056] 另一方面，本发明提供了生产抗体的方法，该方法包含培养本发明宿主细胞以表 达多核苷酸和生产该抗体，其中宿主细胞包含至少一种本发明的多核苷酸。
[0057] 在一个实施例中，免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链被一个连续多核苷酸上的两 个分开的开放阅读框编码。
[0058] 优选地，该方法进一步包含从宿主细胞培养物中回收（recover)抗体。
[0059] 在进一步的方面，本发明提供了抑制人C5aR与其配体相互作用的方法，该方法包 含使该细胞暴露到本发明抗体或本发明结合物中。
[0060] 优选地，该配体是人C5a。
[0061] 优选地，该抗体或结合物可阻止至少一些配体结合到该细胞。
[0062] 另一方面，本发明提供了抑制细胞中人C5aR活性的方法，该方法包含使细胞暴露 到本发明抗体或本发明结合物中。
[0063] 关于前述两个方面，该方法可在体外或体内执行。
[0064] 另一方面，本发明提供了治疗或预防对象中病症的方法，该方法包含给予所述对 象本发明的抗体、本发明的结合物、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞 和/或本发明的组合物。
[0065] 在一个实施例中，该病症是免疫病态病症，例如自身免疫疾病。
[0066] 在另一个实施例中，该病症是炎性疾病，例如急性炎症或慢性炎症。
[0067] 在另一个实施例中，免疫病态病症或炎性疾病涉及白细胞迁移和/或白细胞活 化。
[0068] 在进一步的实施例中，免疫病态病症或炎性疾病涉及补体活化。
[0069] 可被治疗或预防的病症实例包括，但不限于，过敏性鼻炎、肺过敏、超敏感性肺炎、 间质性肺病、过敏性反应、超敏感性反应、药物过敏、昆虫叮咬过敏、炎性肠病、脊柱关节病、 硬皮病、牛皮癣、皮炎、湿疹、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、风疹、血管炎、关节炎、多发性 硬化、系统性红斑狼疮、重症肌无力、青少年型糖尿病、肾炎、自身免疫性甲状腺炎、白塞氏 病（Behcet's disease)、移植排斥、动脉硬化症、具有皮肤或器官的白细胞浸润的癌症、、再 灌注损伤、中风、成人型呼吸窘迫综合征、恶性血液病、细胞因子诱导毒性、多肌炎、皮肌炎、 类天疱疮、阿尔茨海默氏病（Alzheimers diseas)、肉芽肿性疾病、血友病滑膜炎、痛风、与 感染有关的不良炎性反应、SAR、败血症、慢性阻塞性肺疾病（C0PD)、类风湿性关节炎、抗磷 脂综合征、年龄相关性黄斑变性、膜性增生性肾小球肾炎和致密沉积物病。
[0070] 本发明的方法可与其他已知治疗联合进行。因而，在实施例中，该方法进一步包括 给予至少一种其他化合物，用以治疗或预防病症。此种其他治疗可同时提供或相继提供。
[0071] 技术人员（addressee)应当理解，当给予对象本发明的多核苷酸、本发明的载体 和/或宿主细胞时，将在适当条件下，使得抗体或结合物在体内被表达。
[0072] 优选地，该抗体、结合物、多核苷酸、载体和/或宿主细胞以本发明的组合物的形 式给予。
[0073] 另一方面，本发明提供了递送治疗剂到对象的炎症部位的方法，该方法包括给予 所述对象本发明的结合物，或为此编码的多核苷酸。
[0074] 在进一步的方面，本发明提供了将遗传物质引入到呈递（preSent)C5aR细胞中的 方法，该方法包含使该细胞与根据本发明的抗体或本发明的结合物接触，其中该抗体或结 合物结合到遗传物质或与遗传物质联合。
[0075] 遗传物质的实例包括DNA、RNA或其组合。在优选的实施例中，遗传物质是至少部 分双链的DNA或至少部分双链的RNA。
[0076] 在优选的实施例中，呈递C5aR的细胞选自由下列细胞组成的组：白细胞，例如粒 细胞（例如，中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞）、单核细胞、肥大细胞和浆细胞 样树突状细胞，以及组织中的免疫细胞，例如巨噬细胞（例如，小胶质细胞、肝库普弗细胞 〇1印&丨。_1(即€€61'_〇611)、肾小球系膜细胞）、8淋巴细胞、1'淋巴细胞、血管内皮细胞、心 肌细胞、星形胶质细胞、神经干细胞、少突胶质细胞、滑膜细胞、关节软骨细胞（artiCular_ chrondocytes)、刺激肝细胞、支气管上皮细胞、角质形成细胞及胸腺细胞。在特别优选的实 施例中，呈递C5aR的细胞选自由下列细胞组成的组，即白细胞，例如粒细胞（例如，中性粒 细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞）、单核细胞、肥大细胞和浆细胞样树突状细胞，及组织 中的免疫细胞，例如巨噬细胞（例如，小胶质细胞、肝库普弗细胞、肾小球系膜细胞）。
[0077] 又一方面，本发明提供了检测样品中人C5aR存在与否的方法，该方法包含使样品 与本发明的抗体，和/或本发明的结合物接触，并分析样品中人C5aR与抗体或结合物的结 合。
[0078] 可被测试的适宜样品的实例包括，但不一定局限于，血液、血清、血浆，及细胞或组 织活检（tissue biopsy)。
[0079] 另一方面，本发明提供了诊断对象的病症的方法，该方法包含使对象，或从其获得 的样品与本发明的抗体，或本发明的结合物接触，并分析对象或样品中人C5aR与抗体或结 合物的结合。
[0080] 因而，该方法可在体外或体内进行。
[0081] 在一个实施例中，使用组织学标本或从对象获得的组织或流体的亚组分在体外执 行该方法。
[0082] 在另一个实施例中，该方法包含在可使抗体与对象中呈递C5aR的细胞之间形成 复合物的条件下给予对象用显像剂标记的本发明抗体，并使该复合物显像。
[0083] 优选地，该病症是免疫病态病症。
[0084] 也提供了本发明的抗体、本发明的结合物、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本 发明的宿主细胞和/或本发明的组合物在制备用于治疗或预防对象中的病症的药物方面 的用途。
[0085] 也提供了本发明的结合物或为此编码的多核苷酸在制备用于将治疗剂递送到对 象的炎症部位的药物方面的用途。
[0086] 也提供了本发明的抗体、本发明的结合物、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本 发明的宿主细胞和/或本发明的组合物作为治疗或预防对象中的病症的药物的用途。
[0087] 也提供了本发明的结合物或为此编码的多核苷酸作为将治疗剂递送到对象的炎 症部位的药物的用途。
[0088] 在进一步的方面，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包含本发明的抗体、本发明的结 合物、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞和/或本发明的组合物。
[0089] 显而易见地，本发明一方面的优选特征和特性也适用于本发明的许多其他方面。 [0090] 技术人员应当理解，在本发明的许多方面，优选定义的分子（抗体或免疫球蛋白 等）基本上由，或与包含所述序列相比，更优选由指定的SEQID N0序列组成。
[0091] 下文通过下面非限制性实施例并参考附图描述本发明。
[0092] 本发明的人源化抗体保存了亲本抗体的结合性质的重要部分，即单克隆抗体，该 亲本抗体也就是称为7F3的单克隆抗体，由杂交瘤产生，该杂交瘤于2000年11月6日保藏 在欧洲细胞培养物保藏中心（ECACC)(地址：健康保护机构细胞培养物保藏中心，波登当， 索尔兹伯里，英国），保藏编号为00110609,命名为"克隆7F3 (CLONE 7F3)"。

【专利附图】

【附图说明】
[0093] 图1.与小鼠7F3轻链Vk区的同源性最高的人Ig轻链序列的ClustalW比对。框 出了 7F3定义的Q)R。不出了共有框架序列（consensus framework序列），hVkFW Cons。
[0094] 图2a和2b.与小鼠7F3重链Vh序列同源性最高的人Ig重链V区序列（A)和J区 序列⑶的ClustalW比对。框出了定义为7F3的⑶R。示出的V区的共有框架序列（hVhvFW Cons)和J区的共有框架序列（hVhjFW Cons)相连，从而创建共有序列（hVhFW Cons)，用于 移植7F3⑶R (注意：D区包含在⑶R-H3内）。
[0095] 图3.图1中的共有人Vk框架序列与小鼠7F3Vk序列的比对用于创建人源化7F3Vk 轻链序列，h7Vk。小鼠7F3⑶R (框出的）被移植到hVkFW共有框架序列中。星号标记的三 个氨基酸回复突变为小鼠7F3框架序列。
[0096] 图4.人RN0K203VL序列与小鼠7F3Vk序列的比对用于创建人源化的7F3Vk轻链 序列，h7aVk。小鼠7F3⑶R(框出的）被移植到RN0K203VL框架序列中。
[0097] 图5.KV2F-人源的VLCD18-Q序列与小鼠7F3Vk序列的比对用于创建人源化的 7F3Vk轻链序列，h7bVk。小鼠7F3CDR (框出的）被移植到VLCD18-Q框架序列中。
[0098] 图6.人源化7F3Vk序列与小鼠7F3Vk序列的比对。共有序列h7F3VkCons是三个 人源化序列的共有序列。框出了 CDR。人源化7F3Vk序列之间的差异由黑色背景上的白色 子体表不。
[0099] 图7.图2a和2b中共有的人Vh框架序列与小鼠7F3Vh序列的比对用于创建人源 化7F3Vh重链序列，h7Vh。小鼠7F3⑶R(框出的）被移植到hVhFW共有的框架序列中。星 号（*)标记的氨基酸回复突变为小鼠7F3框架序列。用#标记的氨基酸突变成替代残基 (alternate residue)，如文中讨论的。
[0100] 图8.人SGI-VH序列与小鼠7F3Vh序列的比对用于创建人源化7F3Vh重链序列， h7aVh。小鼠7F3⑶R(框出的）被移植到SGI-VH框架序列中。星号（*)标记的氨基酸回复 突变为小鼠7F3框架序列。
[0101] 图9.人HG3序列与小鼠7F3Vh序列的比对用于创建人源化的7F3Vh重链序列， h7bVh。小鼠7F3⑶R(框出的）被移植到HG3框架序列中。星号（*)标记的氨基酸回复突 变为小鼠7F3框架序列。
[0102] 图10.人源化7F3Vh序列与小鼠7F3Vh序列的比对。共有序列h7F3VhCons是三 个人源化序列的共有序列。框出了 CDR。人源化7F3Vh序列之间的差异由黑色背景上的白 色字体表示。
[0103] 图11.竞争性配体结合试验，该试验比较了人源化7F3抗体和小鼠7F3从人中性 粒细胞上hC5aR中取代 125I_C5a的能力。
[0104] 图12a_12c.竞争性配体结合试验，该试验比较了人源化7F3抗体和小鼠7F3从 LI. 2/hC5aR转染子上hC5aR中取代125I-C5a的能力。
[0105] 图13.在4°C下抗_C5aR抗体对人中性粒细胞的饱和结合，用log1Q(上方图（top panel))和线性（下方图（bottom panel))比例对χ-轴作图。
[0106] 图14.肽ELISA:人源化抗-C5aR抗体hAb-J (图A)和hAb-Q (图B)对一系列重 叠肽（no. 1-22)的结合，该重叠肽包含来自人C5aR的第二个细胞外环的12mer序列（每个 被一个偏移），和包含来自SEQ ID N0:37 (no. 23)的残基173-205的33mer。hAb-J (图C) 和hAb-Q(图D)与来自人C5aR(no. A1)的第二个细胞外环的12mer序列的结合，一系列突 变肽（no. A2-A13)包含带有单个Ala突变和杂乱（scrambled)肽（no. A14)的12mer。
[0107] 图15.在不同稀释度下，人源化抗-C5aR mAb hAb-J和Q或抗-C5aR mAb S5/l(在 5yg/ml)与包被在ELISA板上的肽PEP1(SEQ ID N0:37的残基9-29)的结合。
[0108] 图16.化学趋化试验：在5 μ g/ml7F3和各种人源化7F3抗体的存在下人中性粒细 胞向InM C5a的迁移。
[0109] 图17.抗_C5aR抗体hAb-Q (闭合菱形，closed diamond)和7F3 (开放方形）对 C5a诱导的人中性粒细胞的化学趋化的抑制。4个单独实验的平均（土sem)结果表示为无 抗体对照样本（上图）的最大迁移的百分比，或表示为迁移细胞（下图）的平均数目。X轴 上的单位是l〇g 1(ly g/ml的Ab浓度，。
[0110] 图18.亲本小鼠抗体7F3和人源化抗体J和Q对C5a定向的hC5aR/L1.2转染子 细胞迁移的抑制。
[0111] 图19.在与高浓度的人源化抗-C5aR抗体hAb-Q-起孵育之后C5a诱导的人中性 粒细胞的化学趋化被抑制。
[0112] 图20.在C5a诱导的与各种浓度的人源化抗_C5aR抗体hAb-Q预孵育细胞的化学 趋化之前和之后，在游离C5aR和人中性粒细胞上结合的抗-C5aR抗体hAb-Q水平之间观测 到的反比关系。
[0113] 图21.人中性粒细胞上结合的抗-C5aR抗体hAb-Q水平（C5a诱导的化学趋化之 前和之后）与各种浓度的人源化抗_C5aR抗体hAb-Q预孵育的细胞迁移的抑制之间观测到 的关系。
[0114] 图22. C5a诱导的⑶lib在与各种浓度的人源化抗_C5aR抗体hAb-Q预孵育的人 中性粒细胞上的表达的抑制。
[0115] 图23. C5a诱导的⑶62L在与各种浓度的人源化抗_C5aR抗体hAb-Q预孵育的人 中性粒细胞上的下调的抑制。
[0116] 图24.在人全血与人源化抗-C5aR抗体hAb-Q和hAb-J、PBS或粒细胞活化剂fMLP 一起孵育1小时之后，中性粒细胞上⑶lib (图A)和⑶62L(图B)的表达。
[0117] 图25.在人全血与人源化抗_C5aR抗体hAb-G或hAb-J或C5a -起孵育20分钟 之后，相对PBS对照，中性粒细胞上⑶lib (图A)和⑶62L(图B)的表达。
[0118] 图26.在与hAb-Q、单独的hlgG同种型对照抗体，或hlgG抗体加 ΙΟΟηΜ人C5a - 起孵育的人全血中，以相对CDllb表达（图A)和CD62L表达（图B)中的变化表示的中性 粒细胞的活化。
[0119] 图27. hAb-Q (称为抗_C5aR ab)自身没有刺激结合在固体载体上的人中性粒细胞 从而生产超氧化物，但可阻碍C5a引起的生产。
[0120] 图28.与人源化抗_C5aR抗体hAb-Q或对照（利妥昔，不相关的人IgG4，PBS)回体 法中孵育4小时之后，每毫升人血液中B细胞、单核细胞和中性粒细胞的平均数目（±sd)。
[0121] 图29.与人源化抗_C5aR抗体hAb-Q或对照（利妥昔，不相关的人IgG4)回体法 中孵育4小时之后，相对每毫升人血液中B细胞、单核细胞和中性粒细胞的PBS对照的平均 消耗（土sd)百分数。
[0122] 图30.在存在1 %兔补体的情况下，与100μ g/ml hAb-Q、利妥昔和hIgG4或 20μ g/ml多克隆抗_C5aR抗体孵育之后，特异性⑶C(% ToPro3+ve(lysed)Ramos E2细 胞）。
[0123] 图31.在存在10%人血清的情况下，与1-100 μ g/ml hAb-Q、利妥昔和hIgG4孵育 之后，特异性CDC (不可存活的Ramos E2细胞％ )。与10 %热灭活的牛血清的每个样品的 非特异性裂解已被扣除。
[0124] 图32.特异性ADCC(在扣除'仅有介质'和'仅有靶'背景之后，'靶+效应子'样 品中的靶细胞裂解％ ):与人PBMC效应细胞及100 μ g/ml抗体在带有10 %热灭活的胎牛血 清的介质中孵育之后，不可存活的（TP3+ve)Ram〇s E2靶细胞％。
[0125] 图33.特异性ADCC(在扣除'仅有介质'和'仅有靶'背景之后，'靶+效应子'样 品中的靶细胞裂解％ ):与人供体PBMC效应细胞及1-100 μ g/ml抗体在带有10 %人供体血 清的介质中孵育之后，不可存活的（TP3+ve)Ram〇s E2靶细胞％。
[0126] 图34.在炎性关节炎模型中的疾病进展。在腹腔给药10mg/kg抗_hC5aR抗体G、M 和N之后第5天，组中平均临床得分的变化表明K/BxN血清诱导的hC5aR敲入（knock-in) 小鼠（每组η = 6)中炎症逆转。
[0127] 图35.在炎性关节炎模型中的疾病进展。在腹腔给药l-10mg/kg抗_hC5aR抗体C 和J之后第5天，组中平均临床得分的变化表明K/BxN血清诱导的hC5aR敲入小鼠（每组 η = 4-5)中炎症逆转。
[0128] 图36a和36b.在炎性关节炎模型中的疾病进展。在腹腔给药l-10mg/kg hAb-Q 之后第5天，组中爪尺寸平均变化（A)和平均临床得分（B)的平均变化表明K/BxN血清诱 导的hC5aR敲入小鼠（每组η = 10+)中炎症逆转。
[0129] 图37.体内给予各种剂量的人源化抗_C5aR抗体、对照抗体或PBS之后，随着时间 的推移占位（occupied)的C5aR的水平。
[0130] 图38.体内给予各种剂量的人源化抗_C5aR抗体、对照抗体或PBS之后，随着时间 的推移游离的C5aR水平。
[0131] 图39.在治疗性地给予带有关节炎症的小鼠后第5天，hAb-Q随时间推移的血清 浓度。
[0132] 图40.临床得分（爪和关节炎症水平）、在第0和2天用K/BxN血清注射，和在第 5天用10mg/kg人源化抗-C5aR抗体注射的小鼠中占位的C5a受体水平和hAb-Q的血清浓 度之间的关系。
[0133] 图41.临床得分（爪和关节炎症水平）、在第0和2天用K/BxN血清注射，和在第 5天用3mg/kg人源化抗-C5aR抗体注射的小鼠中占位的C5a受体水平和hAb-Q的血清浓度 之间的关系。
[0134] 图42.临床得分（爪和关节炎症水平）、在第0和2天用K/BxN血清注射，和在第 5天用lmg/kg人源化抗-C5aR抗体注射的小鼠中占位的C5a受体水平和hAb-Q的血清浓度 之间的关系。
[0135] 图43.在转基因小鼠的毒理研究和药理研究中，hAb-Q的整合PK/PD模型的图解 表不。
[0136] 图44.在毒理研究（图中以Tox表示）和药理研究（图中以KRN表示）中，对于 hAb-Q(称为抗-C5aR ab)的各种静脉给药、皮下给药，和腹腔给药剂量，相对时间预测的和 观测到的浓度（左）和占位（右）。对于毒理研究，在第1天给药之后和在第43天给药之 后取PK样品。第43天的数据假定处于平稳状态，并持续到第六次之后。平均组值：菱形， 单个小鼠：开放圆圈，通过祀隔室（target compartment)的模型拟合：粗线。
[0137] 图45.在药理研究中，用于hAb-Q对实验诱导的关节炎的抑制效果的PK/Η)模型 的图解表示。这个模型并入了图43中示出的PK/Η)模型中计算的占位率。
[0138] 图46.在转基因小鼠中在第0天发炎，在第5天以不同的剂量hAb-Q腹腔给药之 后，相对时间，占位率（左）和爪尺寸变化（右）。平均组测量：彩色的实线菱形，单个小鼠 值：彩色的开放圆圈。每组中的模型拟合：彩线。
[0139] 图47.应用于人预测的PK/Η)模型的图解表示。该模型由利用用靶介导的处理扩 大的典型IgG参数的两区室模型组成。Vl=中间体积。V2=周边体积。CL=清除率。Q =分配清除率。kof/kon=缔合/解离的速率常数。逆转（turnover)=更新祀和除去结合 抗体所需的时间。两个靶区室用于反映被认为在血液内部分配和在血液外部分配的靶。
[0140] 图48.在抗_C5aR(hAb-Q)的静脉给药之后，用于药物动力学（左）和占位率（右） 的模型预测。最低量化限由水平线表示。
[0141] 图49.在抗_C5aR(hAb-Q)的皮下给药之后，用于药物动力学（左）和占位率（右） 的模型预测。最低量化限由水平线表示。
[0142] 序列表说明
[0143] SEQ ID N0:1_7F3可变轻链蛋白序列。
[0144] SEQ ID NO: 2-7F3可变重链蛋白序列。
[0145] SEQ ID N0:3_7F3可变轻链编码序列。
[0146] SEQ ID N0:4_7F3可变重链编码序列。
[0147] SEQ ID N0:5_KV2F_人的人轻链可变区。
[0148] SEQ ID N0:6_KV2E_人的人轻链可变区。
[0149] SEQ ID N0:7_KV2D_人的人轻链可变区。
[0150] SEQ ID N0:8-KV2B_人的人轻链可变区。
[0151] SEQ ID N0:9-KV2A_人的人轻链可变区。
[0152] SEQ ID N0:10-X12691 的人轻链可变区。
[0153] SEQ ID N0:11_U41645 的人轻链可变区。
[0154] SEQ ID N0:12-U41644 的人轻链可变区。
[0155] SEQ ID N0:13-M31952 的人轻链可变区。
[0156] SEQ ID NO: 14-人轻链可变序列的hVkFW Cons共有序列，如图1中提供的。
[0157] SEQ ID N0:15_HvlAv_人的人重链可变区。
[0158] SEQ ID N0:16_HvlBv_人的人重链可变区。
[0159] SEQ ID N0:17_HvlCv_人的人重链可变区。
[0160] SEQ ID N0:18_HvlGv_人的人重链可变区。
[0161] SEQ ID NO: 19-M99641. aa 的人重链可变区。
[0162] SEQ ID N0:20-M99642. aa 的人重链可变区。
[0163] SEQ ID N0:21-X62109. aa 的人重链可变区。
[0164] SEQ ID N0:22-X92343. aa 的人重链可变区。
[0165] SEQ ID Ν0:23-Ζ12305· aa 的人重链可变区。
[0166] SEQ ID NO:24-人重链可变（V)区序列的hVhvFW Cons共有序列，如图2a中提供 的。
[0167] SEQ ID N0:25-Hvl Cj_人的人重链连接区。
[0168] SEQ ID N0:26-Hv2Ij_人的人重链连接区。
[0169] SEQ ID N0:27-Hv3Hj_人的人重链连接区。
[0170] SEQ ID N0:28-Hv3Kj_人的人重链连接区。
[0171] SEQ ID N0:29-Hv3Tj_人的人重链连接区。
[0172] SEQ ID NO:30-人重链连接（J)区序列的hVhjFW Cons共有序列，如图2b中提供 的。
[0173] SEQ ID N0:31-人源化7F3V区轻链h7Vk氨基酸序列。
[0174] SEQ ID N0:32-人源化7F3V区轻链h7aVk氨基酸序列。
[0175] SEQ ID N0:33-人源化7F3V区轻链h7bVk氨基酸序列。
[0176] SEQ ID N0:34-人源化7F3V区重链h7Vh氨基酸序列。
[0177] SEQ ID N0:35-人源化7F3V区重链h7aVh氨基酸序列。
[0178] SEQ ID N0:36-人源化7F3V区重链h7bVh氨基酸序列。
[0179] SEQ ID N0:37-、C5aR。
[0180] SEQ ID NO: 38-人C5aR的第二细胞外环上的抗原表位。
[0181] SEQ ID N0:39-本发明人源化7F3重链可变区的h7F3VhCons共有序列，如图10所 提供的。
[0182] SEQ ID N0:40_ 人轻链恒定区 hCK -R。
[0183] SEQ ID NO:41-人轻链恒定区 hCK。
[0184] SEQ ID NO:42-人重链恒定区 hCy 4。
[0185] SEQ ID N0:43_ 人重链恒定区 hC γ 4pe。
[0186] SEQ ID NO:44-人重链恒定区 hCy 1。
[0187] SEQ ID NO :45-人重链恒定区 hCy4p。
[0188] SEQ ID NO: 46-人源化 RN0K203VL 序列。
[0189] SEQ ID N0:47-KV2F-人源的 VLCD18-Q 序列。
[0190] SEQ ID NO: 48-本发明人源化7F3轻链可变区的h7F3VkCons共有序列，如图6中 所提供的。
[0191] SEQ ID N0:49-hVhFW Cons共有的人重链VJ框架序列
[0192] SEQIDN0:50-人SGI-VH序列。
[0193] SEQ ID NO: 51-人种系（germline)HG3 序列。
[0194] SEQ ID N0:52-编码人源化7F3V区轻链h7Vk氨基酸序列的多核苷酸序列。
[0195] SEQ ID N0:53-编码人源化7F3V区轻链h7aVk氨基酸序列的多核苷酸序列。
[0196] SEQ ID N0:54-编码人源化7F3V区轻链h7bVk氨基酸序列的多核苷酸序列。
[0197] SEQ ID N0:55-编码人源化7F3V区重链h7Vh氨基酸序列的多核苷酸序列。
[0198] SEQ ID N0:56-编码人源化7F3V区重链h7aVh氨基酸序列的多核苷酸序列。
[0199] SEQ ID N0:57-编码人源化7F3V区重链h7bVh氨基酸序列的多核苷酸序列。
[0200] SEQ ID N0:58-人C5aR的第二细胞外环的片段。
[0201] SEQ ID NO: 59-人C5aR的N-末端细胞外结构域的片段。

【具体实施方式】
[0202] 一般抟术
[0203] 除非另外具体限定，在本文中使用的所有科技术语应当理解为与本领域中（即细 胞培养技术，分子遗传学、抗体技术、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中）普 通技术人员通常理解的含义相同。
[0204] 除非另外指明，本发明中采用的重组蛋白、细胞培养和免疫技术均是标准操 作，是本领域中技术人员众所周知的。此种技术描述和解释在下面来源的文献中，这 些来源为，例如，J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons(1984), J. Sambrook 等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989), T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology:A Practical Approach, volumesland2, IRL Press (1991), D. M. Glover and B. D. Hames(editor), DNA Cloning:A Practical Approach, volumesl-4, IRL Press (1995 和 1996),and F.M.Ausubel 等人·（editor), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988,包括至今的所有更 新），Ed Harlow and David Lane(editor)Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988),以及 J. E. Coligan 等人·（editor)Current Protocols in Immunology, John Wiley&Sons (包括至今的所有更新）。
[0205] 诜择的定义
[0206] 如本文中使用的，"C5a受体"、"C5aR"、"C5aRl"或"人C5aR"和其变化形式是指人 补体成分5受体1，其在本领域中也叫做C5a过敏毒素受体和⑶88抗原。C5aR属于七次跨 膜G-蛋白-偶联受体家族，并结合C5a(Gerard和Gerard, 1991)。人C5a氨基酸序列的实 例提供在SEQ ID N0:37中，然而，技术人员将意识到还存在这些分子的天然存在的等位基 因变体，这些变体也包括在术语"C5aR"中。人C5aR的各种结构域定义如下：
[0207] _酸 1-37 _胞外结构域-N-末端 氨基酸 38-61 跨膜结构域
[0208] Μ接酸 62-71 细胞内结构域 氨基酸 72-94 跨膜结构域 Μ柚酸 95-110 细胞外结构域-细胞外环1 氨基酸 111-132 跨膜结构域 氨插酸 133-149 细胞内结构域 氨基酸 丨50-174 跨膜结构域 氨插酸 175-206 细胞外结构域-细胞外环2 氮基酸 207-227 跨膜结构域 氨基酸 228-242 细胞内结构域 Μ基酸 243-264 跨膜结构域 氨基酸 265-283 细胞外结构域-细胞外环3 氨基酸 284-307 跨膜结构域 氨基酸 308-350 细胞内结构域-C-末端
[0209] 术语"对象"，如在本文中使用的，是指任何动物，特别是哺乳动物，例如人、马、牛、 猫和狗，并在适当时，可以与术语"病人"交换使用。优选地，对象是人。
[0210] 如在本文中使用的术语"治疗"及其变化形式包括给予治疗有效量的本发明抗体， 该有效量足以减轻或消除病症的至少一个症状。
[0211] 如在本文中使用的术语"预防"或其变化形式是指保护对象不患疾病的至少一个 症状，或减轻病症症状的严重性。
[0212] 如在本文中使用的，术语"暴露细胞"是指提供抗体，以便能够接触/结合人C5aR， 条件是C5aR存在于细胞上。
[0213] 术语"有效浓度50%"（缩写为"EC5Q"）表示抗体靶向的分子特定效果（例如，抑 制/取代（displace)人C5a与人C5aR的结合）的50%所需的本发明抗体浓度。本领域人 员应当理解较低的EC 5(I值相当于更有效的抗体。
[0214] 如这里使用的，术语"抑制"是指降低，和可能彻底破坏确定的活性。优选地，确定 的活性被降低至少50%，更优选至少75%，甚至更优选至少90%。
[0215] 如在本文中使用的，术语"约"是指具体值的+/_5%的范围。
[0216] 整个本说明书中，术语"包含"，或其变化形式应当理解为包括陈述的成分、整体或 步骤，或成分、整体或步骤的组，但不包括任何其他成分、整体或步骤，或成分、整体或步骤 的组。在一个实施例中，分子"基本上由"定义的序列"组成"。在其它实施例中，分子"由" 定义的序列"组成"。
[0217] 人源化抗_C5aR抗体
[0218] 术语免疫球蛋白是指一类结构上相关的糖蛋白，该糖蛋白由两对多肽链组成，一 对低分子量的轻（L)链和一对重（Η)链，所有四条链通过二硫键互相连接。免疫球蛋白的 结构已定性清楚，参见例如 Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W.，ed·，2nd ed. Raven Press，N.Y. (1989))。简言之，每条重链典型地由重链可变区（在本文中缩写为VH)和重链 恒定区（在本文中缩写为C H)组成。每条轻链典型地由轻链可变区（在本文中缩写为') 和轻链恒定区（在本文中缩写为CJ组成。轻链恒定区典型地由一个结构域Q组成。 '区可进一步细分成高变的区（或序列上高变的高变区和/或结构确定的环的形式），也 称为互补决定区（CDR)，中间穿插着较其保守的区，称为框架区（FR)。在优选的实施例中， 本发明抗体至少包含\结构域和V H结构域。
[0219] 每个VH和 '典型地由三个⑶R和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按下 面顺序排布，FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(也参见 Chothia 和 Lesk, 1987)。典 型地，在这区中氨基酸残基的编号可通过Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)(短语可变结构域残基编号，如Kabat中或根据Kabat,在本文 中指用于重链可变结构域或轻链可变结构域的这种编号系统）中描述的方法执行。使用这 个编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可含有较少或另外的氨基酸，对应于可变结构域FR 或⑶R的缩短，或插入可变结构域FR或⑶R。
[0220] 术语"人源化抗体"，如在本文中使用的，在本文中指来源于非人抗体，典型地鼠科 动物的抗体，该抗体保留或基本保留亲本抗体（parent antibody)的抗原结合的性质但它 在人中的免疫性低。由于本发明抗体由结构和功能特征限定，因此术语"人源化抗体"可与 "抗体"交换使用。
[0221] 术语互补决定区（CDR)，如在本文中使用的，是指多种氨基酸序列，该多种氨基酸 序列共同限定免疫球蛋白结合位点的可变片段（Fv)区的结合亲和力和特异性。
[0222] 术语框架区（FR)，如在本文中使用的，是指插入在CDR之间的氨基酸序列。抗体的 这些部分用来将CDR保持在适当的位置（允许CDR结合抗原）。可变区，轻的或重的，均包 含框架区和典型地三个⑶R。
[0223] 术语恒定区（CR)，如在本文中使用的，是指赋予效应子功能的抗体分子的部分。题 述人源化抗体的恒定区来源于人免疫球蛋白。重链恒定区可选自五种同种型：α、δ、ε、 Υ或μ。进一步地，各种亚类的重链（例如，重链的IgG亚类）可引起不同效应子功能， 并因而，通过选择期望的重链恒定区，可生产具有期望的效应子功能的抗体。优选的重链 恒定区是 Yl(IgGl)、Y2(IgG2)、Y3(IgG3)和 Y4(IgG4)，更优选 Y4(IgG4)。更优选的 是Y4(IgG4)同种型的可结晶片段（Fc)区，带有突变Ser228Pro (称为"P"突变）和/或 Leu235Glu (称为"E"突变）。特别优选的重链恒定区序列由SEQ ID N042?45提供。轻 链恒定区可以是κ或λ型，优选为κ型。特别优选的轻链恒定区序列由SEQ ID N040和 41提供。
[0224] 在优选的实施例中，在本文中描述的免疫球蛋白轻链可变区直接连接到在本文中 描述的免疫球蛋白轻链恒定区。类似地，在进一步优选的实施例中，在本文中描述的免疫球 蛋白重链可变区直接连接到在本文中描述的免疫球蛋白重链恒定区。因而，在优选的实施 例中，由SEQ ID N0:31提供的氨基酸序列的C-末端直接连接到由SEQ ID N0:41提供的氨 基酸序列N-末端，由SEQ ID N0:36提供的氨基酸序列的C-末端直接连接到SEQ ID N0:45 的氨基酸序列N-末端。
[0225] 技术人员应当理解免疫球蛋白重链或轻链的可变区或恒定区可按照描述的通过 使用标准的重组DNA技术连接，从而创建可在适宜的宿主中被表达（从而产生所述免疫球 蛋白链（一种或多种））的多核苷酸，或可通过使用肽化学合成连接的可变区和恒定区。
[0226] 本发明的人源化抗体保存了亲本抗体的结合性质的重要部分，即单克隆抗体，该 亲本抗体也就是称为7F3的单克隆抗体，由杂交瘤产生，该杂交瘤于2000年11月6日保藏 在欧洲细胞培养物保藏中心（ECACC)(地址：健康保护机构细胞培养物保藏中心，波登当， 索尔兹伯里，英国），保藏编号为00110609。特别地，本发明的人源化抗体保留了特异性结 合亲本抗体识别抗原的能力，该亲本抗体用于生产此种人源化抗体。优选地，人源化抗体 展现出与亲本抗体相同或基本相同的抗体结合亲和力（affinity)和亲合力（avidity)。理 想地，抗体的亲和力（K D)将不大于亲本抗体亲和力的10倍，更优选不大于5倍，更优选不大 于亲本抗体亲和力的3倍。分析抗原结合亲和力的方法是本领域中众所周知的，并包括半 最大结合试验、竞争试验和Scatchard分析。适宜的抗原结合试验描述在本申请中（参见， 例如，实施例3)。
[0227] 技术人员应当理解，"亲合力（avidity)"是指两个分子之间，例如抗体和抗原之 间相互作用的总强度。亲合力取决于相互作用的亲和力和价态。而且，"亲和力"是指分子 (例如，抗体）的单个结合位点与配体（例如，抗原）之间结合的强度。分子X对配体Y的 亲和力可由解离常数（K d)表示，解离常数是占据溶液中存在的一半的X分子的结合部位所 需的Y浓度。更小的Kd表示更强或更高的亲和力相互作用，和需要更低的配体浓度来占据 该部位。
[0228] 术语"人源化抗体"或"抗体"，如本发明中使用的，包括完整分子以及能与表位决 定簇结合的它们的片段，例如Fab、F(ab'）2和Fv。这些抗体片段保留了选择性结合到人 C5aR的一些能力，这些片段的实施例包括，但不限于下面：
[0229] (l)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，该片段可通过酶木瓜蛋白酶 将全抗体（whole antibody)降解生成完整的轻链和一个重链的一部分；
[0230] (2)Fab'，可通过以下方式获得抗体分子片段，用胃蛋白酶处理全抗体，接着还原， 从而生成完整的轻链和重链的一部分；每个抗体分子可得到两个Fab'片段；
[0231] (3) (Fab'）2，可通过用酶胃蛋白酶处理但没有随后还原以获得抗体片段；(Fab)2 是通过两个二硫键结合在一起的两个Fab'片段的二聚体；
[0232] (4) Fv，定义为含有表示为两条链的轻链可变区和重链可变区的基因工程片段；
[0233] (5)单链抗体（"SCA")，定义为基因工程分子，其含有通过适宜的多肽接头连接成 基因融合的单链分子的轻链可变区和重链可变区，此种单链抗体可以是多聚体形式，例如， 双链抗体、三链抗体，和四链抗体等，这些抗体可以是或不可以是多特异性的（参见，例如， W094/07921 和 W098/44001)和
[0234] (6)单链结构域抗体，典型地无轻链的可变重链结构域。
[0235] 人源化抗体片段包括独立的重链、轻链、Fab、Fab'、F(ab'）2、Fc、无任何重链的可 变轻结构域、无轻链的可变重结构域和Fv。多种片段可通过重组DNA技术，或通过完整的免 疫球蛋白的酶分离或化学分离生产。
[0236] "人源化抗体"或本发明抗体也可以是异源结合抗体（heteroconjugate antibody)。异源结合抗体由两个共价连接的抗体组成。已提出，例如，此种抗体可使得 免疫系统细胞靶向不需要的细胞卬34,676,980)，和用于治疗!11￥感染（1091/00360、 W092/200373、EP586505)。考虑了，该抗体可通过使用合成蛋白质化学中包括涉及交联剂的 那些方法在内的已知方法在体外制备。
[0237] 关于效应子功能，理想的是修饰本发明抗体，以便增强，例如，该抗体治疗在本文 中描述的病症，例如关节炎的效力。例如，可将半胱氨酸残基（一种或多种）引入Fc区中， 从而允许这个区中链间二硫键的形成。因而产生的同种型二聚体人源化抗体可改进内化 能力和/或增大补体-介导的细胞杀伤和抗体-依赖性细胞的细胞毒性（ADCC) (Caron等 人，1992 ;Shopes，1992)。活性增强的同种型二聚体抗体也可使用异型双功能交联剂制备， 如Wolff等人（1993)描述的。可替换地，可改造具有双Fc区的抗体并可从而增强补体裂 解和 ADCC 能力（Stevenson 等人，I989)。
[0238] 如在本文中使用的，"非消耗性抗体"是指可结合到其靶，但不募集（recruit)影 响靶细胞裂解的免疫系统效应子功能的抗体。免疫系统效应子功能依赖于Fc-结构域与 Clq_补体级联的第一成分，和/或受体（FcR)的相互作用。补体依赖的细胞毒性（CDC)可 被与Clq相互作用的多Fc-结构域启动，该多Fc-结构域可最终导致靶细胞通过形成膜攻 击复合物（MAC)裂解。另外，免疫系统细胞，例如粒细胞、巨噬细胞和NK细胞，可通过FcR与 结合到靶细胞的mAb相互作用。靶细胞的裂解可通过抗体依赖细胞介导的细胞毒性（ADCC) 或吞噬作用引发。非消耗性抗体包括无 Fc结构域的抗体片段，该抗体片段包括例如，单价 (例如，Fab、scFv、纳米抗体和dAbs)、二价（例如，F(ab'） 2和双链抗体）和多价（例如，三 链抗体和五链抗体）形式。另外，非消耗性抗体包括被修饰从而除去效应子功能而不影响 药物动力学（pharmokinetic)的抗体，例如，可修饰在与Clq和FcR的相互作用中发挥着主 导作用的Fc-结构域中的氨基酸残基，或可除去CH2结构域中的N-连接的糖基化位点。技 术人员应当了解，改造非消耗性抗体的可能性与用于生产抗体的恒定区相联系。IgG3恒定 区比IgGl恒定区更有可能生产消耗性抗体，IgGl恒定区又比IgG2恒定区更有可能生产 消耗性抗体，而IgG4恒定区一般表示抗体是非消耗性的。技术人员也应当理解对恒定区的 修饰可使消耗性抗体转化成非消耗性抗体，反之亦然。
[0239] 如在本文中使用的，"非活化抗体"是指结合细胞表面受体，和否定（negate)或阻 断内源配体作用的抗体。
[0240] 本发明人源化抗体可通过人的介入生产。因而，并不期望它们是天然存在的。但 是，在优选的实施例中，本发明抗体或免疫球蛋白链是"基本上纯化的"或"纯化的"。"基本 上纯化的"或"纯化的"，表示从在天然状态上与其关联的一种或多种脂质、核酸、其他多肽， 或其他污染分子分离的抗体。优选基本上纯化的多肽的至少60%，更优选至少75%，更优 选至少90%不包含与其天然关联的其他成分。在另一个实施例中，"基本上纯化的"或"纯 化的"表示在组合物中为优势种类（predominant species)的分子，其中，它所属于的该类 分子即在该种组合物中发现（即，它构成组合物中该类分子的至少约50%，典型地构成组 合物中该种类的分子，例如肽的至少约70%，至少约80%，至少约85%，至少约90%，至少 约95%，或更多）。
[0241] 在抗体或免疫球蛋白链上下文中的术语"重组"是指细胞或在无细胞表达系统中 生产的，与天然状态相比，量或比率改变的抗体或免疫球蛋白链。在一个实施例中，该细胞 是不能天然生产抗体或免疫球蛋白链的细胞。然而，该细胞可以是包含非内源基因的细胞， 该非内源基因可改变，优选增大待生产的多肽量。本发明的重组抗体或免疫球蛋白链包括 未与生产它的转基因（重组）细胞，或无细胞表达的其他成分系统分离的多肽，和在本文中 细胞或无细胞系统中生产，随后从至少其他一些成分中纯化出来的抗体或免疫球蛋白链。
[0242] 多肤（免疫球蛋白链）的同一性％可通过GAP(Needleman和Wunsch, 1970)分析 (GCG程序）确定，其中缺口生成罚分（gap creation penalty) = 5,而缺口延伸罚分（gap extension penalty) = 0. 3。查询序列为至少50个氨基酸长度，GAP分析在至少50个氨 基酸的区上排列该两个序列。甚至更优选地，查询序列为至少100个氨基酸长度，GAP分析 在至少100个氨基酸的区中排列该两个序列。更优选地，将该两个序列在它们的全长上排 列。
[0243] 关于定义的免疫球蛋白链，应当理解，高于上面提供的那些的同一性％数字将包 括优选的实施例。因而，适当时，根据最小的同一性％数字，优选免疫球蛋白链包含这种氨 基酸序列，即，与指定的有关序列SEQ ID N0至少94%，更优选至少95%，更优选至少96%， 更优选至少97 %，更优选至少98 %，更优选至少99 %，更优选至少99. 1 %，更优选至少 99. 2 %，更优选至少99. 3 %，更优选至少99. 4 %，更优选至少99. 5 %，更优选至少99. 6 %， 更优选至少99. 7 %，更优选至少99. 8 %，和甚至更优选至少99. 9 %的同一性的氨基酸序 列。
[0244] 在另一个实施例中，指定的SEQ ID N0中添加了一个残基，指定的SEQ ID N0中删 除了一个残基，与指定的SEQ ID NO相比，添加了一个残基并删除了一个残基，指定的SEQ ID N0中添加了二个残基，指定的SEQ ID N0中删除了二个残基，指定的SEQ ID N0中改变 了一个残基，指定的SEQ ID NO中改变了两个残基，指定的SEQ ID NO中一个残基改变且删 除了一个残基，或者指定的SEQ ID N0中改变了一个残基且添加了一个残基，或者其任何组 合。
[0245] 在优选的实施例中，该序列比对中没有缺口。更具体地，该算法不需在氨基酸的毗 邻延伸（contiguous stretch)中创建缺口，从而获得理想的（最高的同一'注％)序列比对。
[0246] 本发明的抗体和/或免疫球蛋白链的氨基酸序列突变可通过引入适当的核苷酸 改变到本发明核酸中制备，或通过体外合成期望的多肽制备。此种突变包括，例如，氨基序 列内残基的缺失、插入或置换。可组合使用缺失、插入和置换，从而到达最后的构建体，条件 是最后的多肽产物具有期望的特性。
[0247] 突变的（改变的）多肽可使用本领域中已知的任何技术制备。例如，本发明多核 苷酸可经体外诱变。此种体外诱变技术包括将多核苷酸子克隆成适宜的载体，将载体转换 成"增变"菌株，例如E. coli XL-lred(Stratagene)，并繁殖该转化的细菌，以获得合适数 目的代数。可使用在本文中描述的技术快捷地（readily)筛选从突变/改变DNA获得的产 物，从而确定它们是否具有受体结合和/或受体抑制活性。
[0248] 在设计氨基酸序列突变时，突变位点的位置和突变的性质取决于待修饰的特性 (一种或多种）。用于突变的位点可单独修饰或成批地（in series)修饰，例如，通过（1)首 先用保守氨基酸选择物置换，然后根据获得的结果用更激进的选择置换，（2)删除靶残基， 或（3)插入与定位位点（located site)相邻的其他残基。
[0249] 氨基酸序列缺失范围一般为约1?15个残基，更优选为约1?10个残基，以及典 型地为约1?5个连续的残基。
[0250] 置换突变（substitution mutants)去除了抗体和/或免疫球蛋白链分子中的至 少一个氨基酸残基，并在该位置插入了不同的残基。对于置换突变，最感兴趣的位点包括被 鉴定为对抗原结合重要的位点。这些位点，尤其是属于人抗体和/或免疫球蛋白链中至少 三个其他相同的保守位点的序列的那些位点，优选以相对保守的方式被置换。此种保守置 换在标题为"示例性置换"的表1中给出。置换的具体实施例提供在图6和10中，其中在 给定位点处的氨基酸可被存于其他人源化链中相同位点处的另外的氨基酸置换。
[0251] 表1.示例性置换
[0252]

【权利要求】
1. 一种基本上纯化的和/或重组的人源化抗体，包括： i) 包括了包含与 SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32、SEQ ID N0:33 和 SEQ ID N0:48 中的 一个或多个序列至少93%相同的氨基酸序列的可变区的免疫球蛋白轻链，和/或 ii) 包括了包含与 SEQ ID N0:34、SEQ ID N0:35、SEQ ID N0:36 和 SEQ ID N0:39 中的 一个或多个序列至少90 %相同的氨基酸序列的可变区的免疫球蛋白重链， 其中所述抗体结合人C5aR。
2. 根据权利要求1所述的人源化抗体，其中所述免疫球蛋白重链包括了包含选自由 SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36组成的组中的氨基酸序列的可变区。
3. 根据权利要求1或2所述的人源化抗体，其中所述免疫球蛋白轻链包括了包含选自 由SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33组成的组中的氨基酸序列的可变区。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的人源化抗体，其中所述免疫球蛋白轻链包括了 包含由SEQ ID NO:31提供的氨基酸序列的可变区，免疫球蛋白重链包括了包含由SEQ ID NO:36提供的氨基酸序列的可变区。
5. 根据权利要求1至3中任一项所述的人源化抗体，其中所述免疫球蛋白轻链包括了 包含由SEQ ID N0:31提供的氨基酸序列的可变区，免疫球蛋白重链包括了包含由SEQ ID NO:34提供的氨基酸序列的可变区。
6. 根据权利要求1至3中任一项所述的人源化抗体，其中所述免疫球蛋白轻链包括了 包含由SEQ ID N0:32提供的氨基酸序列的可变区，免疫球蛋白重链包括了包含由SEQ ID NO:34提供的氨基酸序列的可变区。
7. 根据权利要求1至3中任一项所述的人源化抗体，其中所述免疫球蛋白轻链包括了 包含由SEQ ID N0:33提供的氨基酸序列的可变区，免疫球蛋白重链包括了包含由SEQ ID NO: 34提供的氨基酸序列的可变区。
8. 根据权利要求1至3中任一项所述的人源化抗体，其中所述免疫球蛋白轻链包括了 包含由SEQ ID N0:31提供的氨基酸序列的可变区，免疫球蛋白重链包括了包含由SEQ ID NO:35提供的氨基酸序列的可变区。
9. 根据权利要求1至3中任一项所述的人源化抗体，其中所述免疫球蛋白轻链包括了 包含由SEQ ID N0:32提供的氨基酸序列的可变区，免疫球蛋白重链包括了包含由SEQ ID NO:35提供的氨基酸序列的可变区。
10. 根据权利要求1至3中任一项所述的人源化抗体，其中所述免疫球蛋白轻链包括 了包含由SEQ ID NO: 33提供的氨基酸序列的可变区，免疫球蛋白重链包括了包含由SEQ ID NO:35提供的氨基酸序列的可变区。
【文档编号】C07K16/28GK104193824SQ201410315627
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2009年2月19日 优先权日:2008年2月20日
【发明者】彼得·惠特菲尔德, 戴维·扎赫拉, 查尔斯·麦凯 申请人:G2炎症私人有限公司