专利名称：：1,4－二氢吡啶衍生物在预防和治疗动脉壁的动脉粥样硬化恶化中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及使用1，4-二氢吡啶来对抗在动脉粥样硬化血管损伤中起作用的几个过程，例如肌细胞增生与迁移，巨噬细胞中胆固醇代谢和低密度脂蛋白的氧化改性。上述生物过程的有利效果被认为是预防人体动脉血管壁的动脉粥样硬化恶化的基础。本发明亦涉及1，4-二氢吡啶在制造预防、停止与逆转人体动脉血管壁的动脉粥样硬化恶化的药物中的用途。动脉粥样硬化是一种动脉血管壁增厚及硬化的总称，它导致美国及其它西方社会的许多死亡病例，一类动脉硬化为动脉粥样硬化，此乃较大的动脉病症，它是大多数冠状动脉病，主动脉瘤及下肢动脉病的基础，也在脑血管病中起重要的作用。动脉粥样硬化至目前为止为美国65岁以上及以下人的主要死因。业已了解动脉粥样硬化为一种多重因素过程，它在一导致临床后遗症时，是基于患部动脉血管内膜的迁移的平滑肌细胞广泛增生。动脉粥样硬化斑的生成被认为为三个基础重物过程的结果，包括(1)血管内膜平滑肌细胞以及不等数目堆积的巨噬细胞及T淋巴细胞的迁移与增生；(2)由增生的平滑肌细胞生成大量结缔组织母体，包含胶原、弹性纤维及蛋白多糖；及(3)脂质主要以胆固醇酯及游离胆固醇形式堆积于细胞及周围结缔组织内。此外，许多实验报告提示低密度脂蛋白(LDL)的氧化改性在人体动脉粥样硬化早期阶段起关键作用，血中胆固醇过高代表与疾病发生率增高有关的主要危险因子。有资料提示LDL进行氧化改性，氧化的LDL会通过多种机制促进动脉粥样硬化，包括增加组织巨噬细胞的摄取，结果导致脂质堆积及单核细胞的趋化活性，以及对动脉壁内皮细胞的细胞毒性。业已出乎意外地发现某些1，4-二氢吡啶(美国专利4705797已知具有冠状动脉扩张及抗高血压活性)可对抗多种导致动脉粥样硬化病变的生物过程，因此可用于人体来预防及治疗动脉壁及动脉粥样硬化，血中胆固醇过高以及由此引起的多种疾病例如局部缺血性心脏病，例如心肌梗塞，及脑血管疾病如脑梗塞及脑中风。本发明化合物也可用于经皮穿管腔动脉血管形成术(PTCA)后抑制血管再度缩窄以及抑制高血压造成的血管肥厚。在这些1，4-二氢吡啶衍生物中，最好的是德卡利平(lercanidipine)，其对映异构体及其药学上可接受的盐。德卡利平为甲基1，1，N-三甲基-N-(3，3-二苯丙基)-2-氨基乙基1，4-二氢-2，6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-吡啶-3，5-二羧酸酯。一方面，德卡利平的(S)-对映体及外消旋化合物都具有抗高血压活性，可用于需要治疗高血压及动脉粥样硬化现象相关疾病的病人。另一方面，(R)-德卡利平实际上不具有抗高血压活性，可用于治疗平滑肌细胞迁移与增生，但没有心血管作用。因此此种对映异构体可用于不希望低血压的病人。本发明提供使用一种具有通式I化合物，或其盐、对映异构体、水合物或溶剂合物其中Ph表示苯基Ar表示2-硝基苯基，3-硝基苯基，2，3-二氯苯基或苯并呋咱-4-基，A表示含有3至6个碳原子的支键烷基，R表示含1至6个碳原子的直键或支键烷基，可被含1至6个碳原子的烷氧基任意地单取代，R1表示氢原子，羟基或含1至4个碳原子的烷基，及R2表示氢原子或甲基，它们可用于制备预防、停止或逆转病人动脉血管壁的动脉粥样硬化恶化的药物。本发明又一种预防、停止或逆转病人动脉血管壁的动脉粥样硬化恶化的方法，该方法包括对病人给予治疗有效量的通式I化合物或此种化合物的盐、对映异构体、水合物或溶剂合物。较佳的用于对病人给药或用于制备供对病人约药的药物的1，4-二氢吡啶衍生物I为德卡种平及其(R)-和(S)-对映异构体。德卡利平可经由下面的反应流程1显示的方法，使用1，1，N-三甲基-N-(3，3-二苯丙基)-2-氨基乙基α-乙酰基-3-硝基肉桂酸酯(2)使3-氨基巴豆酸甲酯(1)进行汉兹(Hantzsch)环化反应制备，US4707797更完整地叙述了该方法。反应流程1另外，德卡利平可经由下面反应流程2显示且实施例3作更完整叙述的方法，使用2，N-二甲基-n-(3，3-二苯丙基)-1-氨基-2-丙醇(4)使1，4-二氢-2，6-二甲基-5-甲氧羰基-4-(3-硝基苯基)-吡啶-3-羧酸(3)酯化来制备。反应流程2德卡利平对映异构体可这样制备通过使用合适的同手性的酚存在时以1∶1比构成前述酸3，用于上述反应流程2中的酯化方法。这些同手性的酸(后文为方便起见称为酸5[(R)-对映异构体]及酸6[(S)-对映异构体])，可容易地根据A.Ashimori等.，药物化学公报(Chem.Pharm.Bull.)39，108(1991)报告的方法通过化学拆分外消旋酸3来制备。反应流程2的酯化反应可这样进行在偶合剂如二环己基碳化二亚胺、N，N’-羰基二咪唑或二乙基氰基膦酸酯存在下，及选择性地在促进剂如N-羟基琥珀酰亚胺或4-二甲氨基吡啶存在下，于质子惰性或氯代溶剂如二甲基甲酰胺或氯仿中，于-10至140℃的温度下，根据如下众所周知的合成方法进行Albdrtson，有机反应(Org.React.)12，205(1982)；Doherty等，药物化学杂志(J.Med.Chem.)35，2(1992)；Staab等，有机化学制备较新方法(NewerMethodsPrep.Org.Chem.)5，81(1988)；Ishihara，药物化学公报(Chem.Pharm.Bull.)39.3238(1991)。另外，德卡利平对映异构体可通过首先于叔胺如三乙胺存在下使酸5(或6)与氯甲酸烷基酯进行反应，然后于0-80℃添加中间物(4)来制备。选择性的是可在添加中间物(4)之前加入促进剂如1-羟基哌啶，参见Albertson，有机反应(Org.React.)12，157(1982)。也可这样制备德卡利平对映异构体使用无机酰卤例如五氯化磷，草酰氯，三氯化磷，磷酰氯或亚磺酰氯，在氯代溶剂例如氯仿，二氯乙烷，二氯甲烷，或1，1，1-三氯乙烷中，选择性地在促进剂如二甲基甲酰胺存在下，于-10-85℃温度下将酸5(或6)转化成相应的酰卤。酰卤可以，但非必需于添加中间物(4)之前分离。如此所得德卡利平对映异构体，可根据现有技术已知方法纯化为碱(例如藉柱层析)或盐(例如藉再沉淀或再重结晶)。前述方法也可用于全部其它通式I化合物。根据本发明，1，4-二氢吡啶衍生物I可就此，或呈其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物的任一种形式给予病人。较佳药学上可接受的酸加成盐包括与盐酸，硫酸，顺丁烯二酸，丁二酸，柠檬酸，甲磺酸及甲苯磺酸生成的盐；可以用常规的方式由游离碱制备。无论何种形式(碱，盐，水合物或溶剂合物)，活性成分通常与药学上可接受的载体混合给药。口服给药时，1，4-二氢吡啶衍生物可掺混赋形剂并以片剂，糖衣锭，胶囊，酏剂，悬浮液剂，糖浆剂，圆锭剂，口香胶等剂型使用。此等制剂需含至少0.5％活性化合物，但活性成分数量依据具体剂型而改变，合适的是占单位重量约5％至约70％。这类组合物中活性化合物是是可获得适当剂量的量，但所需剂量可藉多个剂型给药获得。本发明化合物之口服剂量为0.1至400mg，以1至200mg剂量范围为佳。片剂，丸剂，胶囊，糖衣锭等也可含有例如下列成分粘结剂如微晶纤维素，西黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩散剂如藻酸，淀粉乙醇酸钠，玉米淀粉等；润滑剂如硬脂酸镁或氢化蓖麻油；及滑动剂如胶体二氧化硅。如蔗糖或糖精的甜味剂也可包含其中，同时也可包含调味剂如薄荷脑，水杨酸甲酯或橘子香精。当剂型为胶囊时，除前述类别物质外，还可含有液体载体例如脂肪油。口服剂型也可含有多种其它可修改剂型单位的物理形式的物质，例如包衣。如此，片剂或丸剂可用糖，虫胶或其它肠包衣剂包衣。糖浆剂除活性化合物外，可含有蔗糖作为甜味剂及某些防腐剂，染料，着色剂及调味剂。用于制备此等组合物的材料必须为医药物纯且使用量时无毒的物质。供非胃肠道给药时，1，4-二氢吡啶衍生物可掺混于溶液或悬浮液。这些制剂含有至少0.1％活性化合物，但活性成分数量可于0.5％至约30％重量间改变。在这类组合物中的活性化合物量为可得合适剂量的量。较佳的非胃肠道给药剂量单位含有0.05至100mg活性化合物。溶液剂或悬浮剂也包含下列成分无菌稀释剂例如注射用水，盐水，固定油，聚乙二醇类，甘油，丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醛或甲基对羟苯甲酸酯类；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螫合剂如亚乙基二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐；及渗透压调节剂如氯化钠或右旋糖。非胃肠道给药的多剂量小瓶可由玻璃或塑料材料制成。此处，涵盖的剂型，其它成分及给药途径包括于US4089969及US5091182所揭示的内容(并入本文以供参考)。下列实施例举例说明(R，S)-德卡利平及其(S)及(R)对映异构体的制备。实施例1(S)-(+)-甲基1，1，N-三甲基-N-(3，3-二苯丙基)-2-氨基乙基1，4-二氢-2，6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-吡啶-3，5-二羧酸酯[(S)-德卡利平]盐酸盐半水合物。将0.13ml亚磺酰氯于-10℃加至0.54g(R)-1，4-二氯-2，6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-5-甲氧基羰基-吡啶-3-羧酸于2.9ml无水二氯甲烷及0.75ml无水二甲基甲酰胺维持于氮气氛下且避开直接光照的搅拌好的悬浮液内，于0℃经1小时后，于-5℃加入0.48g2，N-二甲基-N-(3，3-二苯丙基)-1-氨基-2-丙醇(如US4705797所述制备)在1ml二氯甲烷中的溶液。在0℃下搅拌3小时，在20-25℃下放置过夜后，真空蒸发去除溶剂，残余物溶解于20ml乙酸乙酯。有机相依次以盐水(4ml)，10％碳酸钠水溶液(5×4ml)，盐水(4ml)，1N盐酸(5×5ml)，盐水(4ml)，10％碳酸钠水溶液(2×5ml)及最终以盐水(4ml)洗涤。有机相以盐水硫酸钠脱水及真空蒸发至干。残余物藉快速层析纯化(使用矽胶柱以石油醚∶丙酮85∶15洗脱)。整个TLC洗脱组分(石油醚∶丙酮7∶3体积比及氯仿∶5N甲醇氨99∶1.1体积比)蒸发获得残余物，残余物溶解于75ml含3％丙酮的乙醚。过滤后，溶液以3N醚制盐酸酸化，于78℃/15mmHg下抽取和干燥收集沉淀获得0.66g标题化合物。M.p.115-125℃；[α]D25＝+70.56°(MeOH；c＝0.981)。元素分析(％)C36H41N3O6.HCl.0.5H2O实测值C，65.47；H，6.57；N，6.29；Cl，5.32；H2O，1.68计算值C，65.79；H，6.60；N，6.39；Cl，5.39；H2O，1.37碱于200MHz的1H-NMR光谱(CDCl3，δ)8.10(m，1H)硝基苯基1，2-CH7.97(m，1H)硝基苯基1，4-CH7.62(m，1H)硝基苯基1，6-CH7.33(dd，1H)硝基苯基1，5-CH7.29-7.10(m，10H)CH(Ph)2的芳族H原子CH(Ph)25.79(bs，1H)吡啶，NH5.05(s，1H)吡啶，4-CH3.92(t，1H)CH(Ph)23.63(s，3H)COOCH32.57(m，2H)OC(CH3)2CH2N2.40-2.23(m，2H)N(CH3)CH2CH22.33-2.27(2s，6H)吡啶，2-CH3及6-CH32.19-2.09(m，2H)N(CH3)CH2CH22.17(s，3H)NCH31.35-1.31(2s，6H)OC(CH3)2CH2N实施例2(R)-(-)-甲基1，1，N-三甲基-N-(3，3-二苯丙基)-2-氨基乙基1，4-二氢-2，6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-吡啶-3，5-二羧酸酯[(L)-德卡利平]盐酸盐半水合物。按实施例1所述的方法但使用1，4-二氢-2，6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-5-甲氧羰基吡啶-3-羧酸的(S)对映异构体替代(R)对映异构体获得(S)对映异构体的方法获得标题化合物。M.p.115-120℃；[α]D25＝-70.88°(MeOH；c＝0.975)。元素分析(％)C36H41N3O6.Hcl.0.5H2O实测值C，64.93；H，6.62；N，6.24；Cl，5.41；H2O，2.50计算值C，64.90；H，6.60；N，6.31；Cl，5.32；H2O，2.70碱在CDCl3的1H-NMR光谱恰如实施例1对(S)对映异构体的报告。实施例3甲基1，1，N-三甲基-N-(3，3-二苯丙基)-2-氨基乙基1，4-二氢-2，6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-吡啶-3，5-二羧酸酯[德卡利平]盐酸盐。45.8g(0.385mol)亚磺酰氯以15分钟时间逐滴加入维持于氮气下于-4℃至+1℃间、包含116.2g(0.35mol)2，6-二甲基-5-甲氧羰基-4-(3-硝基苯基)-1，4-二氢吡啶-3-羧酸(3)(如DE2847237所述制备)、645ml无水二氯甲烷及160ml无水二甲基甲酰胺的搅拌好的混合物内。混合物于同温、搅拌下维持1小时，然后于-10℃至0℃以15分钟时间逐滴加入104.1g(0.35mol)2，N-二甲基-N-(3，3-二苯丙基)-1-氨基丙醇(4)(如US4705797制备)，溶解于105ml无水二氯甲烷。于0℃搅拌3小时，并在室温下放置过夜后，真空蒸发去除溶剂及残余物溶解于3500ml乙酸乙酯。有机相依序以盐水(700ml)、10％碳酸钠水溶液(5×700ml)、盐水(700ml)，1N盐酸(5×700ml)及最终以盐水(700ml)洗涤。有机相以无水硫酸钠干燥30分钟，然后过滤，与23g木炭共同振摇及再度过滤。溶液体积藉真空蒸发缩小至约1升，然后于0℃至5℃放置24小时后，藉抽取过滤收集结晶及由99％乙醇再结晶获得179.5g(78％)标题化合物。m.p.186-188℃。药理数据附图中图1为表示德卡利平及其对映异构体对于[3H]胸腺核苷合并入大鼠平滑肌细胞的肌细胞的影响的图；图2为表示德卡利平及其对映异构体干扰动脉肌细胞迁移能力的图；图3为表示德卡利平及其对映异构体于小鼠腹膜巨噬细胞抑制酶ACAT及AcLDL诱发胆固醇酯化作用的能力的图；图4表示德卡利平及其对映异构体对载有胆固醇酯的巨噬细胞内胆固醇酯化作用的浓度相关性影响的图；图5及6表示德卡利平及其对映异构体对于细胞媒藉LDL氧化作用的影响的图；及图7为培育后细胞介导的氧化作用以及德卡利平的影响的时程图。对动脉细胞迁移与增生的影响。血管受伤动物模式显示中层肌细胞增生后发生动脉病变，许多肌细胞迁移入血管内膜且进一步增生而形成血管内膜新生病变。此种病情的起因尚未完全了解。近来发现年轻成人中肌细胞占动脉粥样硬化病变的细胞族群约90-95％且占恶化动脉粥样硬化斑平均50％。此外，血管肌细胞通过合成细胞外基质而促成病变，基质可堆积脂质变成泡沫状细胞。如此，了解影响此等现象的因素可对选择性干扰与抑制粥样瘤生成过程有新的切入点。本发明使用大鼠主动脉平肌细胞于纤维蛋白原作为趋化因子存在下研究肌细胞的迁移，增生研究使用大鼠及人类细胞。细胞数目及[3H]胸腺核苷的合并量被用来评估肌细胞生长。方法如下由雄性Sprague-Dawley大鼠(200-250g)的主动脉的血管内膜中层培养肌细胞。细胞于37℃在5％CO2的潮湿气氛下于Eagle最低必需培养基内生长成单层，培养基补充10％(v/v)胎牛血清，100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，20mM麦黄酮缓冲液及1％(v/v)非必需氨基酸溶液。每第三日更换培养基。使用第4及第10继代培养的细胞。藉tripan蓝排除方法定时评估细胞的存活能力。鉴定肌细胞的生长表现，形态以及使用a-肌动蛋白的特异性单克隆抗体(肌细胞典型的肌动蛋白异构型)。人类血管肌细胞(得自人类股动脉的A617)于相同培养条件下生长。以各种密度给大鼠(2×105)及人体(5×104)接种肌细胞/培养皿(35mm)，用补充10％牛血清的Eagle最低必需培养基培养。24小时后，培养基换成含0.4％胎牛血清的培养基而终止细胞生长，培养物继续培育72小时。此时(时间0)培养基以含10％胎牛血清有或无已知浓度试验化合物存在下的培养基替代，且又于37℃再培育72小时。于时间0，恰在添加试验物质之前，计算各培养皿样品中的细胞数目。细胞增生是在细胞单层藉胰蛋白酶分解后使用Coutter计数器(型号ZM)计算细胞数目来评估。细胞存活能力系通过tripan蓝排除方法评估，据发现所用药物浓度高于95％。结果如表1所示。表1通过细胞计数测得肌细胞生长抑制作用</tables>LE＝德卡利平SD＝SpragueDautey*NI＝(尼卡利平)SHR＝自发高血压LA＝(达西利平)WK＝WistarKyoto*IC50＝抑制细胞生长达50％所需浓度n.t.＝未试验*＝得自意大利的Charles-River德卡利平及其对映异构体以浓度依赖性方式降低大鼠及人类的肌细胞增生作用如表1所示，实际上与试验的参照物1，4-二氢吡啶显示出相同的强度。必须强调德卡利平(及其对映异构体)证实对全部研究种属，特别人类的细胞皆具有活性。另一组实验中，肌细胞同步生长至细胞周期的G0/G1中间期的方式是将指数生长期的培养细胞(＝3×105细胞/平板)于含0.45胎牛血清之培养基内培养96-120小时达成。静止细胞于含10％胎牛血清自新鲜培养基内于试验药物存在下培育20小时。然后通过细胞核合并[3H]胸腺核苷数量评估细胞增生作用，细胞(1μCi/ml培养基)培养时间为2小时。用Filter计数闪烁混合液测量放射性。结果表示如图1所示，证实德卡利平及其对映异构体在抑制细胞生长中的强度很高。大鼠肌细胞迁移作用系使用48孔微趋化隔间(Neuro-Probd，USA)检查。新制使用胰蛋白酶分解在肌细胞悬浮于补充5％胎牛血清的培养基(检定培养基)。较低的孔含27μl检定培养基，其中包含纤维蛋白原(600μg/ml)作为趋化剂，孔上覆盖不含聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯滤膜(8μM孔隙大小)。50μl细胞悬浮液(1×106细胞/ml)被放置于含试验化合物的上方隔间。于37℃于95％空气及5％CO2的气氛下培育5小时。培育后，滤膜由隔间移开，未迁移细胞由上表面刮下，滤膜用磷酸盐缓冲盐水洗三次。滤膜使用Diff-quik(Merz-dade，AG，瑞士)染色。每100倍高倍放大试验迁移至滤膜下表面的肌细胞数目以显微镜检测。6倍高倍放大每个样品进行计算，结果示平均。结果如图2所示，验证德卡利平及其对映异构体可干扰动脉肌细胞的迁移。全部试验化合物皆可以计量依赖方式抑制肌细胞迁移而(R)对映异构体显示最明显效果。用于小鼠腹膜巨噬细胞对胆固醇代谢作用的影响粥样瘤含有二种主要细胞类型巨噬细胞系衍生自循环单细胞且为病变的主要含脂质细胞。其堆质脂蛋白胆固醇并形成泡沫状细胞的机理主要与受体介导过程有关，牵涉到所谓的“清除者受体”，该受体可辨认以化学和生物改性的LDL，例如乙酰基LDL(AcLDL)及氧化LDL。清除者受体不象LDL受体，前者不会受到反馈调节，结果胆固醇大量堆积于细胞。胆固醇经由一种过程以脂化形式堆积于巨噬细胞，该过程包括酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶(ACAT)，该酶于胞质内催化胆固醇的酯化作用。仅有自由胆固醇才可由巨噬细胞去除。于小鼠腹膜巨噬细胞经由AcLDL诱生的胆固醇酯化作用的研究方式如下腹膜注射硫甘醇酸酯后三日藉腹膜灌洗由小鼠(Balb/c意大利CharlesRiver)获得小鼠腹膜巨噬细胞，细胞(2-3×106)接种于具有含10％胎牛血清的Pulbecco最低必需培养基的35mm孔内。3小时后，洗涤皿而去除未搭接的细胞并于使用前保持于添加10％胎牛血清的Pulbecco最低必需培养基内24小时。接种细胞后，于0.2％胎牛血清白蛋白(不含脂肪酸)加其它指示添加物至不含血清Dulbecoo最低必需培养基内于37℃进行实验。通过连续的超高速离心(BeckmanL5-50，美国加州)由健康自愿者血浆分离人类LDL(d＝1.019-1.063g/ml)。对于乙酰化反应，LDL对0.15MNaCl，pH7.4渗析，NaCl以等体积饱和乙酸钠稀释并用乙酸酐处理。至于[125I]AcLDL，脂蛋白通过SephadexG25凝胶过滤，用磷酸盐缓冲盐水洗脱去盐，且以[125I]碘化钠加标记。比活性为100-200cpm/ng蛋白质。三氯乙酸非可沉淀放射活性量低于总量的2％。全部脂蛋白皆经过无菌过滤。细胞与试验化合物共同培育24小时。培养基以相同培养基取代后，又继续培养24小时。第二次培养期间加入[125I]AcLDL(50μg/ml)。培育后1或2小时加入与胎牛血清复合[1-14C]油酸(0.68mCi样品)后测量胆固醇脂化作用，并随一测定与细胞胆固醇酯相关的放射活性。在加入药物和实验测定前，细胞通过与50μg/mlAcLDL共同培育24小时而富含胆固醇。德卡利平及其对映异构体被证实能以浓度依赖的方式抑制小鼠腹膜巨噬细胞经由AcLDL诱生的酯化胆固醇的生成(换言之，ACAT酶的酯化作用)达90％。德卡利平及对映异构体的IC50值如图3所示，为8至15μm范围，(R)-对映异构体是最具活性的化合物。进行另一组实验来评估添加化合物前载有胆固醇的巨噬细胞内，德卡利平对胆固醇酯化作用的影响，条件是在相同的泡沫状细胞内。细胞通过暴露于含50μg乙酰基的培养基达24小时而载有胆固醇。结果如图4显示，德卡利平可以浓度依赖方式抑制胆固醇酯化作用达70％，IC50值约7μM。证实德卡利平的(R)对映异构体比外消化合物更具活性，而(S)德卡利平为试验化合物中活性最低者。最后，据证实德卡利平及其对映异构体于5μM不会有害于巨噬细胞水解储存于胞质内的酯化胆固醇的能力。实验系通过将预先载有[3H]胆固醇的细胞于特异性ACAT抑制剂5058035存在下培育进行。阻断胆固醇的胞内再度酯化可评估细胞水解堆积的胆固醇酯的能力。加入德卡利平及其对映异构体如酯化胆固醇部分的放射性值记载不会影响细胞水解活性。胆固醇在全部负载培养基中的浓度为0.5μCi/ml。经24小时负载后(在此期间加放射性标记的胆固醇经合并及酯化)，洗涤细胞单层，在含0.1％胎牛血清的培养基内再培育24小时而使标记胆固醇的胞内池平衡至相同特异性活性。欲定量胆固醇酯水解作用，负载细胞于Dubbecco最低必需培养基内培育24小时，培养基含有药物、0.1％胎牛血清及化合物S-58035(一种酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶的抑制剂)。抑制酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶可防止胆固醇酯水解产生的任何游离胆固醇进行再度酯化，因此可评估水解酶活性。胆固醇酯的水解系通过测量放射性标记胆固醇酯的减低而定量[E.H.Hattison等，脂质研究杂志(J.Lipid.res.)31，2187(1990)]。培育后，细胞以磷酸盐缓冲盐水洗涤并以己烷∶异丙醇(3∶2v/v)萃取。培养基以氯仿∶甲醇(2∶1v/v)再度萃取。去除溶剂后，游离胆固醇及酯化胆固醇通过TLC分离(异辛烷∶乙醚∶乙酸75∶25∶2体积比)。各点之胆固醇重量或放射性藉酶方法测定(BoehringerMannheim，德国)[F.Bernini等，Atherosclerosis104，19(1993)]或通过液体闪烁计数法测定(Lipolumalumac，Landgraf，荷兰)。结果示于表2。表2德卡利平及其对映异构体对巨噬细胞内胆硬酯酰酯水解的影响％胆固醇酯AcLDL50μg/ml31±0.8AcLDL50μg/ml+S-580351μg/ml15±0.5AcLDL50μg/ml+S-580351μg/ml+5×10-6MLE12±1.2AcLDL50μg/ml+S-580351μg/ml+5×10-6M(S)-LE14±0.4AcLDL50μg/ml+S-580351μg/ml+5×10-6M(R)-LE16±2.1对LDL氧化作用的影响实验报告提示LDL的氧化改性作用在人体动脉粥样瘤硬化早期起着关键的作用。可得资料提示LDL于活体试验进行氧化改性，氧化改性的LDL(Ox-LDL)可藉多种机制诱生粥样瘤生成，包括促进组织巨噬细胞(经由清除者受体路径)摄取，结果导致脂质堆积，对单核细胞的趋化性及对动脉壁内皮细胞的细胞毒性。德卡利平抗氧化剂能力系经由LDL与20μMCu++于有或无不等浓度试验化合物(0.01μM-50μM)存在下培育评估。实验条件下，LDL(d＝1.019-1.063)。通过使用L5-50超高速离心机(Bckman，美国加州)于4℃及40,000于50Ti转子通过连续离心由人体汇集血浆中分离。然后LDL对含0.01％亚乙基二胺四乙酸pH7.4的0.15MNaCl渗析，通过0.2μM微孔膜过滤灭菌并于氮下于暗处维持4℃直到使用前为止(长达3周)。使用前LDL于SelhadexG-25柱(PD-10，Pharmacia精细化学品公司，瑞典乌沙拉)上对不含亚乙基二胺四乙酸之磷酸盐缓冲盐水渗析，然后LDL通过无菌0.22μM滤膜过滤。在磷酸盐缓冲盐水中的LDL(50μg脂蛋白/ml)在25W下与20μM硫酸铜共同培育3小时氧化。德卡利平溶液被制成在甲醇中的10-2备用溶液，在加入铜之前制备成呈乙醇溶液的形式(最大浓度1％v/v)，德卡利平对LDL氧化作用的影响通过紫外光光谱仪(BeckmanDU640)具有自动6晶胞变化器的连续读值，通过3小时时间以5分钟间隔记录234nm吸光率的增加，且对磷酸盐缓冲盐水空白组比较来连续监测共轭二烯生成来测定。氧化起点的迟滞时间系由蔓延期的最大斜率线至基线交点求出，此处吸光率为时间0之吸光率。结果如表3所示。表3徳卡利平对LDL氧化作用迟滞时间的影响德卡利平μM迟滞时间046.5±4.60.545.1±3.71.049.8±4.72.553.6±3.3*5.073.2±4.8↓10.0112.7±5.2↓*P＜0.05；↓P＜0.01如表3所示，10μM德卡利平外消旋化合物可使LDL氧化的迟滞期翻倍化合物的作用与浓度相关。对映异构体活性可与外消旋化合物活性类比。德卡利平及其对映异构体的抗氧化活性也基于细胞介导的氧化作用研究。通过将不含伸乙基二胺四乙酸的LDL在无菌条件下与5μMCu++(100μgApoB/ml)于J774细胞存在下或另外与EAhy-926细胞共同培育评估。培育22小时后，通过加入丁基化羟甲苯至培养基(最终浓度40μM)溶解于乙醇而终止氧化。脂质过氧化程度系通过使用硫巴比妥酸检定分析测定醛分解产物的抑制百分率而测量[A.N.Hanna等.，Biochem.Pharmacol.45，753(1993)]。简言之，于0.250ml培育样品内添加0.750ml三氯乙酸(0.20％w/v)接着添加0.750ml硫巴比妥酸(0.67％w/v)。样品于100℃加热20分钟，接着冷却及离心。使用1，1，3，3-四甲氧丙烷作为标准品求出丙二醛当量。使用ATCCTIB67J774A.1细胞所得图5结果显示，德卡利平及其对映异构体可有效减少LDL的氧化。使用Eahy926细胞(有多种与内皮细胞相同性质)所得图5的结果显示德卡利平可降低10至100μM范围的LDL氧化作用。前述细胞介导的氧化实验中，德卡利平作用在培育22小时后研究。欲研究此等条件下德卡利平显示强度较低的原因，于不同时间通过取出培育培养基样品并如前述测量氧化化合物而检测在30μM德卡利平存在下，脂质过氧化程度。结果示于图7，明白可知经10小时培育后30μM德卡利平具有极高脂质氧化抑制作用。此种结果证实德卡利平于适当时间对细胞媒介LDL氧化作用的强度如同对Cu++介导氧化作用的强度。德卡利平证实为目前于此等检定分析试验中，最强的是1，4-二氢吡啶，其强度比达西利平高一级幅度，达西利平为过去已知1，4-二氢吡啶化合物中于此种实验设计最强效力的化合物。在高血压犬中对血压的影响口服德卡利平及其对映异构体的抗高血压效果在肾性高血压犬中进行试验。使用重12-13kg，年龄1-3岁(NossanAllevamenti，意大利)雄性小猎犬。通过两侧肾动脉缩窄诱生慢性持续性高血压，所用方法系根据Goldblatt方法“双肾，双夹高血压”。在二次手术中用巴比妥酸盐麻醉(35mg/lgi.v.)下(二次间隔一个月)两侧肾动脉皆以原始肾脏银夹夹住且缩窄达约60-70％。末次手术二个月后，对出现实验肾性高血压动物植入一根导管。在戊基巴比妥钠麻醉(35mg/kgi.v)下，于无菌条件下，细胞藉插入留滞性套管(PE200ClayAdams)通过右边共通颈动脉，插入上升主动脉。导管于颈背后由皮肤穿出，填充入含肝素的盐水并每日灌洗以防凝血。从手术中恢复一周后，动物被连接到HP1290A压力转换器上，该转换器与HP7700多频多功能绘图仪的HP8805B载波放大器连接，这样来监测动脉血压。由血压轨迹人工算出心率。全部动物另外使用安慰剂，德卡利平及其(R)及(S)-对映异构体处理。药物以笔直圆形无菌梢端导管(Pores-Serlat-法国)经口服给药。药物悬浮于水性的0.5％MethocelA4C抗发泡剂M10(10％)中。给药体积为1ml/kg。悬浮药物用作安慰剂。实验过程中，于给药30分钟(基线值)及给药后达8小时连续记录动脉血压。德卡利平及(S)-德卡利平动脉血压诱生剂量相关的降低。DE25值(于尖峰作用于DBP诱生25％降低之剂量)经线性回归分析评估且综述于表4。表4化合物ED25(mg/kg)95％C.L.德卡利平0.9(0.5÷1.6)(S)-德卡利平0.4(0.3÷0.7)(R)-德卡利平＞＞30C.L.＝可靠限度(S)-德卡利平具有最强力抗血压作用，证实比外消旋化合物的效力高两倍，而(R)-对映异构体在高达30mg/kg时也不影响血压(DBP的降低少于10％)。权利要求1.一种通式I化合物或此种化合物的盐、对映异构体、水合物或溶剂合物其中Ph表示苯基Ar表示2-硝基苯基，3-硝基苯基，2，3-二氯苯基或苯并呋咱-4-基，A表示含有3至6个碳原子的支链亚烷基，R表示含1至6个碳原子的直链或支链烷基，任意地被含1至6个碳原子的烷氧基单取代，R1表示氢原子，羟基或含1至4个碳原子的烷基，及R2表示氢原子或甲基，用于制备预防、停止或逆转病人动脉血管壁的动脉粥样硬化恶化的药物中的用途。2.一种德卡利平、(S)-德卡利平或(R)-德卡利平或它们的盐、水合物或溶剂合物用于制备预防、中止或逆转病人动脉壁动脉粥样瘤硬化恶化的药物中的用途。3.如权利要求1或2所述的用途，其用于制备含药学上可接受的载体的药物。4.如权利要求1、2或3所述的用途，其用于制备适合口服给药形式的药物。5.如权利要求4所述的用途，其用于制备含5％至70％化合物的药物。6.如权利要求4或5所述的用途，其用于制备含有0.1mg至400mg化合物、呈单一剂型的药物。7.如权利要求4或5所述的用途，其用于制备含有1mg至200mg化合物、呈单一剂型的药物。8.如权利要求1、2或3所述的用途，其用于制备适合非胃肠给药剂型的药物。9.如权利要求8所述的用途，其用于制备含有0.5％至30％化合物的药物。10.如权利要求8或9所述的用途，其用于制备含有0.5mg至100mg化合物、呈单一剂型的药物。全文摘要已发现1,4－二氢吡啶可对抗在动脉粥样硬化血管病变发展中起作用的数个过程,例如肌细胞增生与迁移,巨噬细胞的胆固醇代谢,及低密度脂蛋白的氧化改性。因此可用于制造供预防、停止与逆转人类动脉壁的动脉粥样硬化的药物。用于此种目的的较佳1,4－二氢吡啶为德卡利平(lercanidipine),(S)－德卡利平及(R)－德卡利平。文档编号C07D211/90GK1190345SQ96195439公开日1998年8月12日申请日期1996年6月28日优先权日1995年7月14日发明者A·莎塔尼,A·雷纳迪,R·泰思塔申请人:瑞蔻达蒂化学制药公司