本发明涉及具有ω-3去饱和酶活性的新型多肽及编码该多肽的基因、以及它们用于生成二十碳五烯酸的应用。
背景技术：
：：高度不饱和脂肪酸是具有2个以上不饱和键的脂肪酸，可列举ω-6不饱和脂肪酸的亚油酸(la，18:2n-6)、γ-亚麻酸(gla，18:3n-6)、花生四烯酸(ara，20:4n-6)，ω-3不饱和脂肪酸的α-亚麻酸(ala，18:3n-3)、二十碳四烯酸(eta，20:4n-3)、二十碳五烯酸(epa，20:5n-3)、二十二碳六烯酸(dha，22:6n-3)等。高度不饱和脂肪酸除了作为生物体膜的主要构成成分参与膜的流动性调节之外，作为生物体功能性成分的前体也很重要。ara或epa在高等动物体内是前列腺素、血栓素、白三烯等的前体，dha是脑内存在最多的高度不饱和脂肪酸。epa具有血小板聚集抑制作用、血中中性脂肪减少作用、抗动脉硬化作用、血液粘度降低作用、降血压作用、抗炎作用、抗肿瘤作用等生理作用，被用于药品、食品、化妆品、饲料等各种领域。此外，近年来，从预防生活习惯病的观点来看，推荐积极摄取ω-3不饱和脂肪酸，是需求增加显著的脂质分子种类。生物体的dha或epa除了从食物摄取以外，在一部分生物中由ala进行生物合成。另一方面，由于人无法生物合成ala，因此dha或epa对于人来说在营养学上是必需脂肪酸。epa主要大量包含于鳕鱼、鲱鱼、青花鱼、鲑鱼、沙丁鱼、磷虾等的鱼油，利文斯顿岛希瓦氏菌(shewanellalivingstonensis)等海洋性低温细菌，网粘菌纲(labyrinthulomycetes)等的藻类等中。已知从这些生物资源中提取或纯化epa的方法。最常进行的是从鱼油中纯化epa。然而，鱼油中的epa含量低，而且来源于鱼油的epa根据提取或纯化的方法还存在着残留鱼腥味、或被视为心脏病原因的芥酸的含量增加的问题。近年来，关系到能量问题等，在细胞内蓄积脂质的产脂质微生物受到瞩目，开发了以微生物学方式生产各种脂质的方法。例如，利用作为丝状菌的1种的属于被孢霉属(mortierella)的微生物的高度不饱和脂肪酸的生产方法的研究正在进行。已知被孢霉属微生物具有ω-3或ω-6高度不饱和脂肪酸代谢途径，并生产epa(非专利文献1)。在专利文献1中揭示了培养产生epa的被孢霉属微生物而获得epa的方法。在专利文献2中揭示了使用对高山被孢霉(mortierellaalpina)施行突变处理而得的突变株来生产ara或epa的方法。在专利文献3中揭示了使用将由高山被孢霉分离的ω-3去饱和多肽的基因导入酵母中而得的转化株来生产epa等高度不饱和脂肪酸的方法。但是，被孢霉属微生物的ω-3去饱和酶的最适温度低，在菌容易增殖的常温条件(20℃左右)下无法充分地发挥作用。因此，即使以通常的培养温度培养被孢霉属微生物，也无法高效地生产epa。另外，被孢霉属微生物的ω-3去饱和酶优先与碳链长为18的脂肪酸作用，因此利用上述被孢霉属微生物的以往的方法难以高效地生产碳链长为20的epa。因此，需要可以由碳链长为20的脂肪酸(例如ara)高效地合成epa的ω-3去饱和酶。专利文献4中记载了由异丝水霉(saprolegniadiclina)分离的ω-3去饱和酶，专利文献5中记载了由栎树猝死病菌(phytophthoraramorum)分离的δ17去饱和酶，专利文献6中记载了由瓜果腐霉(pythiumaphanidermatum)分离的δ17去饱和酶。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开昭63-14697号公报专利文献2:日本特开平11-243981号公报专利文献3:日本特开2006-055104号公报专利文献4:日本特表2005-515776号公报专利文献5:日本特表2009-534032号公报专利文献6:日本特表2010-508019号公报非专利文献非专利文献1:appl.microbiol.biotecnol.,1989,32:1-4。技术实现要素：发明所要解决的技术问题本发明涉及提供即使在20℃以上的常温下也具有高的酶活性的ω-3去饱和酶、及具有该ω-3去饱和酶且可高效地生产以高浓度含有epa等ω-3不饱和脂肪酸的油脂的产脂质细胞。另外，本发明还涉及提供利用了该产脂质细胞的含有大量epa的油脂的工业生产手段。解决技术问题用的手段发明人经过各种研究，结果发现了，即使在常温下也对碳数20的脂肪酸具有高ω-3去饱和活性的新型ω-3去饱和酶及编码该酶的基因。本发明人还发现在导入有编码上述ω-3去饱和酶的基因的转化细胞中，在常温下epa等c20的ω-3不饱和脂肪酸的生产效率提高。即，本发明提供一种多肽，所述多肽由与seqidno:2所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成，并且具有对于碳数20的脂肪酸的ω-3去饱和活性；此外，本发明还提供编码上述多肽的多核苷酸；此外，本发明还提供含有上述多核苷酸的载体；此外，本发明还提供导入有上述多核苷酸的转化细胞；进而，本发明提供含二十碳五烯酸的脂质的生产方法，该方法包括：培养表达上述多肽的细胞；进而，本发明提供二十碳五烯酸的生产方法，该方法包括：纯化通过上述方法生产的含二十碳五烯酸的脂质。发明的效果本发明的ω-3去饱和酶在细胞容易增殖的20℃以上的常温条件下对于碳数20的脂肪酸具有高ω-3去饱和活性，可在epa等c20的ω-3不饱和脂肪酸的生物合成中发挥作用。因此，如果培养表达本发明的ω-3去饱和酶的细胞，则该细胞内可高效地生产epa等c20的ω-3不饱和脂肪酸。epa是在药品、食品、化妆品、饲料等各种领域中被使用的重要的高度不饱和脂肪酸，所以可适用于epa的工业规模的生产的本发明在该领域非常有用。附图说明图1是高山被孢霉(mortierellaalpina)1s-4中的脂肪酸生物合成途径；图2是高山被孢霉用转化二元载体的例子；图3是实施例3和5中所制作的ω-3去饱和酶基因导入高山被孢霉株的脂肪酸生产量。a:1ml培养液中的各脂肪酸的生产量(mg)，b:1mg干燥菌体中的各脂肪酸的生产量(mg)，c:相对于总脂肪酸量的各脂肪酸的组成(%)。宿主株:对照，g#18和g#22:实施例3中制作的株，c#14和c#16:实施例5中制作的株。具体实施方式本说明书中，只要没有另行定义，关于氨基酸序列或核苷酸序列中的氨基酸或核苷酸的缺失、取代、添加或插入所使用的“一个或多个”可以是例如1～20个，较好是1～10个，更好是1～5个，进一步更好是1～4个，又更好是1～3个，又进一步更好是1～2个。此外，本说明书中，氨基酸或核苷酸的“添加”包括在序列的一个末端或两个末端添加一个或多个氨基酸或核苷酸。本说明书中，氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可使用karlin和altschul的算法blast(pro.natl.acad.sci.usa,1993,90:5873-5877)或者fasta(methodsenzymol.,1990,183:63-98)来决定。基于该算法blast，开发了被称为blastn或blastx的程序(j.mol.biol.,1990,215:403-410)。基于blast，通过blastn来分析核苷酸序列的情况下，参数设为例如score=100，wordlength=12。此外，基于blast，通过blastx来分析氨基酸序列的情况下，参数设为例如score=50，wordlength=3。使用blast和gappedblast程序的情况下，使用各程序的缺省参数(defaultparameter)。这些分析方法的具体手法是公知的(参照www.ncbi.nlm.nih.gov)。本说明书中，“严格条件”是指同源性高的核苷酸序列彼此之间，例如具有90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的同源性的核苷酸序列彼此之间杂交、而同源性较其低的核苷酸序列彼此之间不杂交的条件。更具体来说，本说明书中的“严格条件”是指可根据所要求的同源性的高低而改变合适的条件。越是更高严格条件，那么仅同源性更高的序列杂交。作为低严格条件的例子，可列举5×ssc、5×邓哈特溶液(denhardt'ssolution)、0.5%sds、50%甲酰胺、32～50℃左右的洗涤条件。作为高严格条件的例子，可列举6×ssc、0.01medta、1×邓哈特溶液、0.5%sds、55～68℃左右，或者5×ssc、5×邓哈特溶液、0.5%sds、50%甲酰胺、55～68℃左右的洗涤条件。作为其他影响杂交的要素，还可考虑探针的浓度或长度、反应时间等多种要素。如果是本领域技术人员，则可参照例如sambrook等,《分子克隆实验指南》第三版，冷泉港实验室出版社(molecularcloning,alaboratorymanual,3rded,coldspringharborlaboratory)(2001)，对上述的条件或要素进行适当选择而决定适当的严格度。本说明书中，目标氨基酸序列或核苷酸序列上的、与特定的氨基酸序列或核苷酸序列上的特定的位置或区域相对的“对应位置”或“对应区域”可通过将目标氨基酸序列或核苷酸序列与作为基准的特定序列(参照序列)对齐(序列比对,alignment)以使对各氨基酸序列或核苷酸序列中存在的保守氨基酸残基或核苷酸赋予最大同源性来决定。序列比对可使用公知的算法来实施，其顺序是本领域技术人员公知的。例如，序列比对可基于上述的立普曼-帕森(lipman-pearson)法等通过人工操作进行，也可通过以缺省设定使用clustalw多序列比对程序(thompson,j.d.等,1994,nucleicacidsres.,22:4673-4680)来进行。或者，还可使用作为clustalw的修订版的clustalw2或clustalomega。clustalw、clustalw2和clustalomega可在例如欧洲生物信息研究所(europeanbioinformaticsinstitute:ebi[www.ebi.ac.uk/index.html])或国立遗传学研究所运营的日本dna数据库(ddbj[www.ddbj.nig.ac.jp/welcome-j.html])的网站上利用。本说明书中，“ω-6高度不饱和脂肪酸代谢途径”是指由亚油酸(la，18:2n-6)生产γ-亚麻酸(gla，18:3n-6)、双高-γ-亚麻酸(dgla，20:3n-6)、花生四烯酸(ara，20:4n-6)等ω-6高度不饱和脂肪酸的代谢途径，“ω-3高度不饱和脂肪酸代谢途径”是指由α-亚麻酸(ala，18:3n-3)生产十八碳四烯酸(sda，18:4n-3)、二十碳四烯酸(eta，20:4n-3)、二十碳五烯酸(epa，20:5n-3)等ω-3高度不饱和脂肪酸的代谢途径(参照图1)。此外，本说明书中，“高度不饱和脂肪酸”是指碳链长为18以上且不饱和键数为2以上的长链脂肪酸。另外，本说明书中，“c20的ω-3不饱和脂肪酸”是指碳数20的ω-3高度不饱和脂肪酸，作为其例子，可列举epa、eta。本说明书中，“去饱和活性”是指向脂肪酸链中引入碳-碳双键的活性，“去饱和酶”是指具有该去饱和活性的蛋白质或多肽。去饱和活性和去饱和酶根据通过该活性而引入了碳-碳双键的脂肪酸上的位置进一步被分类。例如，“ω-3去饱和活性”是指向自脂肪酸的ω末端起第3位与第4位碳之间引入双键的活性，“ω-3去饱和酶”是指具有该活性且产生ω-3不饱和脂肪酸的酶。例如，ω-3去饱和酶可包括：由la(18:2n-6)向ala(18:3n-3)转变的转换酶、由gla(18:3n-6)向sda(18:4n-3)转变的转换酶、由dgla(20:3n-6)向eta(20:4n-3)转变的转换酶、以及由ara(20:4n-6)向epa(20:5n-3)转变的转换酶。本说明书中，“δ17去饱和活性”是指向自脂肪酸的羧基末端起第17位与第18位碳之间引入双键的活性，“δ17去饱和酶”是指具有该活性且产生δ17不饱和脂肪酸的酶。例如，δ17去饱和酶可包括：由dgla(20:3n-6)向eta(20:4n-3)转变的转换酶、以及由ara(20:4n-6)向epa(20:5n-3)转变的转换酶。“ω-3去饱和酶”和“δ17去饱和酶”对于碳数20的脂肪酸向同样的位置(自ω末端起第3位与第4位碳之间=自羧基末端起第17位与第18位碳之间)引入不饱和键。因此，本说明书中，“对于碳数20的脂肪酸的ω-3去饱和活性”可换言之为“δ17去饱和活性”。本说明书中，“在常温下具有酶活性”是指酶活性的最适温度为20℃以上、较好是20～40℃，或者20℃时具有最适温度下的活性的70%以上、较好是80%以上的活性。例如，本说明书中，酶“在常温下具有对于碳数20的脂肪酸的ω-3去饱和活性”是指该酶对于碳数20的脂肪酸的ω-3去饱和活性的最适温度为20～40℃，或者20℃时的该酶对于碳数20的脂肪酸的ω-3去饱和活性相对于该酶在最适温度下对于碳数20的脂肪酸的ω-3去饱和活性为70%以上，较好是80%以上。本说明书中，对于微生物的功能或特性、性状(trait,形質)使用的术语“本来”是用来表示该功能或特性、性状存在于该微生物的野生型中。对照性地，术语“外源”用于表示不是一开始就存在于该微生物中、而是从外部引入的功能或特性、性状。例如，从外部引入某种微生物的基因为外源基因。外源基因可以是来源于与引入有该基因的微生物同种的微生物的基因，也可以是来源于不同种生物的基因。通过本发明提供的ω-3去饱和酶是由与seqidno:2所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成，且在常温下具有对于碳数20的脂肪酸的ω-3去饱和活性的多肽。作为该多肽的例子，可列举由以下的氨基酸序列构成，且在常温下具有对于碳数20的脂肪酸的ω-3去饱和活性的多肽。(a)seqidno:2所示的氨基酸序列；(b)与seqidno:2所示的氨基酸序列具有90%以上、较好是95%以上、更好是98%以上、进一步更好是99%以上的同源性的氨基酸序列；(c)seqidno:2所示的氨基酸序列中，有一个或多个氨基酸被施行了选自缺失、取代、插入和添加的突变而获得的氨基酸序列；(d)seqidno:4所示的氨基酸序列；(e)与seqidno:4所示的氨基酸序列具有90%以上、较好是95%以上、更好是98%以上、进一步更好是99%以上的同源性的氨基酸序列；(f)seqidno:4所示的氨基酸序列中，有一个或多个氨基酸被施行了选自缺失、取代、插入和添加的突变而获得的氨基酸序列。对于上述氨基酸序列中的氨基酸的缺失、取代、插入和添加的位置无特别限定，只要在突变后的多肽中保持常温下的对于碳数20的脂肪酸的ω-3去饱和活性即可。另外，作为本发明的ω-3去饱和酶，可列举在上述的(a)～(f)所示的氨基酸序列中各氨基酸可被属于性质类似的氨基酸组的氨基酸取代的蛋白。被类似的氨基酸取代的位置和数目没有特别限定，只要取代后的多肽中保持常温下的对于碳数20的脂肪酸的ω-3去饱和活性即可。作为性质类似的氨基酸，可列举例如甘氨酸和丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸和异亮氨酸、丝氨酸和苏氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺、赖氨酸和精氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等。较好是本发明的ω-3去饱和酶为在常温下、较好是20℃～40℃的温度下对碳数20的脂肪酸特异性作用的ω-3去饱和酶。seqidno:2和seqidno:4所示的ω-3去饱和酶均为来源于作为鞭毛菌的1种的plectospiramyriandra的酶。blast分析的结果表明，seqidno:2和seqidno:4所示的ω-3去饱和酶相互具有约98.9%的高氨基酸序列同源性；另一方面，是具有与公知的蛋白质极不相同的氨基酸序列的新的多肽。seqidno:2和seqidno:4所示的ω-3去饱和酶的氨基酸序列与来源于水霉(saprolegnia)等的公知的ω-3去饱和酶(例如专利文献4～6所揭示的ω-3去饱和酶)的氨基酸序列的序列同源性最高为70%。本发明人以plectospiramyriandra的基因组为基础构建了由编码ω-3去饱和酶的假定orf构成的多核苷酸。该多核苷酸是由seqidno:1所示的核苷酸序列构成的、编码seqidno:2所示的本发明的ω-3去饱和酶的多核苷酸。此外，本发明人通过以plectospiramyriandra的mrna为靶的逆转录反应，获得了由seqidno:3所示的核苷酸序列构成的cdna。这是编码seqidno:4所示的本发明的ω-3去饱和酶的多核苷酸。因此，由seqidno:1或seqidno:3所示的核苷酸序列构成的多核苷酸均为不包含内含子序列的多核苷酸，是与plectospiramyriandra细胞内存在的基因组dna不同的多核苷酸。因此，本发明还提供编码本发明的ω-3去饱和酶的多核苷酸(以下也称为本发明的ω-3去饱和酶基因)。作为本发明的ω-3去饱和酶基因的例子，可列举由以下所示的核苷酸序列构成的、编码在常温下具有对于碳数20的脂肪酸的ω-3去饱和活性的多肽的多核苷酸或其互补链。(a)seqidno:1所示的核苷酸序列；(b)与seqidno:1所示的核苷酸序列具有90%以上、较好是95%以上、更好是98%以上、进一步更好是99%以上的同源性的核苷酸序列；(c)seqidno:1所示的核苷酸序列中，有一个或多个核苷酸被施行了选自缺失、取代、插入和添加的突变而获得的核苷酸序列；(d)在严格条件下与seqidno:1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；(e)seqidno:3所示的核苷酸序列；(f)与seqidno:3所示的核苷酸序列具有90%以上、较好是95%以上、更好是98%以上、进一步更好是99%以上的同源性的核苷酸序列；(g)seqidno:3所示的核苷酸序列中，有一个或多个核苷酸被施行了选自缺失、取代、插入和添加的突变而获得的核苷酸序列；或者(h)在严格条件下与seqidno:3所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。对于上述核苷酸序列中的核苷酸的缺失、取代、插入和添加的位置无特别限定，只要突变后的多核苷酸所编码的多肽保持常温下对于碳数20的脂肪酸的ω-3去饱和活性即可。本发明的ω-3去饱和酶可按照公知的方法、较好是化学合成法或生物学合成法制造。作为化学合成法的例子，可列举通过常规方法对侧链官能团进行了保护的各氨基酸依次结合而伸长肽链的方法。作为生物学合成法的例子，可列举由本发明的ω-3去饱和酶基因表达本发明的ω-3去饱和酶后，分离所生成的酶，根据需要进一步纯化的方法。以下，对本发明的ω-3去饱和酶基因的生物学合成法进行更详细的说明。首先，制备本发明的ω-3去饱和酶基因。该基因可基于本发明的ω-3去饱和酶的氨基酸序列、或plectospiramyriandra等微生物的基因组dna的序列信息，按照公知的方法通过化学合成法制造，或者可从上述的plectospiramyriandra等微生物分离。从微生物分离本发明的ω-3去饱和酶基因的情况下，例如可由该微生物的总rna制作cdna文库，通过从该cdna文库的筛选来分离作为目标的本发明的基因的cdna。筛选时，基于本发明的基因的核苷酸序列设计探针或引物，选择与该探针或引物在严格条件下杂交的cdna即可。或者，可以通过序列特异性逆转录反应，由该微生物的总rna选择性地合成目标cdna。所选择的cdna可通过pcr等公知的方法进行扩增。或者，本发明的ω-3去饱和酶基因可以通过利用紫外线照射或位点特异性突变引入之类的公知的突变引入法向按照上述顺序分离或合成的基因中引入突变来制作。例如，对于seqidno:1或seqidno:3所示的多核苷酸用公知的方法引入突变，获得突变多核苷酸。通过考察由该突变多核苷酸表达的多肽的ω-3去饱和活性而选择编码具有所期望的活性的多肽的多核苷酸，可获得本发明的ω-3去饱和酶基因。另外，按上述顺序制备的本发明的ω-3去饱和酶基因，较好是结合引入该基因并使之表达的细胞中的密码子使用频率，将密码子最优化。各种生物使用的密码子的信息可从codonusagedatabase(www.kazusa.or.jp/codon)获得。例如，结合高山被孢霉(mortierellaalpina)的密码子使用频率(www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgispecies=64518)将seqidno:1和seqidno:3所示的ω-3去饱和酶基因进行密码子最优化的情况下，分别成为seqidno:5和seqidno:6所示的多核苷酸。因此，作为本发明的ω-3去饱和酶基因，可列举以由上述(a)～(h)所示的核苷酸序列构成的多核苷酸为基础，结合各种生物的密码子使用频率将密码子最优化而得的多核苷酸。接着，由所制备的本发明的ω-3去饱和酶基因表达本发明的ω-3去饱和酶。该酶可通过无细胞系统来表达，也可将本发明的ω-3去饱和酶基因导入宿主细胞中获得转化细胞，使本发明的ω-3去饱和酶在该转化细胞中表达。作为导入本发明的ω-3去饱和酶基因的宿主细胞，较好是细菌、真菌、藻类等微生物的细胞，但无特别限定。向宿主细胞中导入基因时，可使用包含本发明的ω-3去饱和酶基因的载体。用于导入的载体的种类可根据宿主细胞的种类、或克隆的方法、基因表达的方法等适当选择。例如，由存在于细胞的基因组外的载体上的基因直接表达本发明的ω-3去饱和酶的情况下，较好是使用表达载体。将本发明的ω-3去饱和酶基因整合至适当的载体中，将所得的包含本发明的ω-3去饱和酶基因的载体导入宿主细胞中。向细胞中导入载体时，可使用电穿孔法、粒子枪(基因枪)法、感受态细胞法、原生质体法、磷酸钙共沉淀法、根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)介导的转化(atmt)法及其改变法(appl.environ.microbiol.,2009,75:5529-5535)等公知的方法。这时，如果事先向载体中整合适当的标志基因(markergene)，则能够以标志(marker)的表达为指标，选出导入了包含本发明的基因的载体的转化细胞。通过上述转化细胞，表达本发明的ω-3去饱和酶。所表达的本发明的ω-3去饱和酶可通过公知的蛋白质的分离或纯化法进行分离、以及根据需要进行纯化。本发明的ω-3去饱和酶在细胞容易增殖的常温、例如20℃以上的温度条件下具有高的ω-3去饱和活性，可在epa等c20的ω-3不饱和脂肪酸的生物合成中发挥作用。因此，如果在常温下培养表达本发明的ω-3去饱和酶的细胞，则该细胞容易增殖，且利用在该增殖了的细胞内表达的本发明的ω-3去饱和酶进行c20的ω-3不饱和脂肪酸的生物合成，因此可高效地生产epa等c20的ω-3不饱和脂肪酸。因此，本发明提供c20的ω-3不饱和脂肪酸的生产方法，该方法包括：培养表达本发明的ω-3去饱和酶的细胞。作为c20的ω-3不饱和脂肪酸，可列举eta和epa，较好是epa。此外，本发明还提供含epa的脂质的生产方法，该方法包括：培养表达本发明的ω-3去饱和酶的细胞。进而本发明提供epa的生产方法，该方法包括：纯化通过上述本发明的含epa的脂质的生产方法生产的含epa的脂质。作为上述表达本发明的ω-3去饱和酶的细胞，可以是本来就表达该酶的细胞，或者也可以是经过改变而表达该酶的细胞。作为本来就表达本发明的ω-3去饱和酶的细胞，可列举plectospiramyriandra。作为经过改变而表达本发明的ω-3去饱和酶的细胞，可列举如上述的通过本发明的ω-3去饱和酶基因的导入而获得了本发明的ω-3去饱和酶的表达能力的转化细胞。该转化细胞可以是来源于植物、细菌、真菌、藻类等的任意的细胞，较好是细菌、真菌、藻类等微生物的细胞。或者，可对上述plectospiramyriandra进行改变而使本发明的ω-3去饱和酶的表达提高，并用于本发明的含epa的脂质的生产方法。本发明的含epa的脂质的生产方法中，上述表达本发明的ω-3去饱和酶的细胞通过本发明的ω-3去饱和酶的作用来生产epa。因此，该细胞不仅具有本发明的ω-3去饱和酶的表达能力，而且本来还具有生产作为该酶的底物的花生四烯酸(ara)的能力，或者经过改变而可生产ara。较好是该细胞本来就具有ω-6高度不饱和脂肪酸代谢途径，或者经过改变而具有该途径。更好是该细胞本来就具有ω-6高度不饱和脂肪酸代谢途径和ω-3高度不饱和脂肪酸代谢途径，或者经过改变而具有该两个途径。如图1所示，通过ω-6高度不饱和脂肪酸代谢途径生成的ara通过ω-3去饱和酶的作用而转换成epa。或者，dgla等碳数20的ω-6高度不饱和脂肪酸通过ω-3去饱和酶的作用而转换成eta等碳数20的ω-3高度不饱和脂肪酸，然后由这些ω-3高度不饱和脂肪酸通过ω-3高度不饱和脂肪酸代谢途径生成epa。因此，作为本发明的含epa的脂质的生产方法中使用的细胞的优选例子，可列举具有表达本发明的ω-3去饱和酶的能力，且具有ω-6高度不饱和脂肪酸代谢途径而可产生花生四烯酸的产脂质微生物(oleaginousmicroorganisms)。更好是该产脂质微生物还具有ω-3高度不饱和脂肪酸代谢途径。作为这样的产脂质微生物的例子，可列举上述的plectospiramyriandra，以及具有通过ω-6高度不饱和脂肪酸代谢途径而产生花生四烯酸的能力的产脂质微生物，较好是还具有ω-3高度不饱和脂肪酸代谢途径，且经过改变而表达本发明的ω-3去饱和酶的产脂质微生物。上述经过改变而表达本发明的ω-3去饱和酶的产脂质微生物可通过向具有ω-6高度不饱和脂肪酸代谢途径并具有产生花生四烯酸的能力，较好是还具有ω-3高度不饱和脂肪酸代谢途径的产脂质微生物中导入本发明的ω-3去饱和酶基因而获得。向该产脂质微生物中导入本发明的ω-3去饱和酶基因可按照关于向宿主细胞中导入基因而在上文中记载的顺序来进行，以下说明更具体的顺序。作为适合导入本发明的ω-3去饱和酶基因的产脂质微生物的例子，可列举plectospira属菌、酵母菌、和被孢霉(mortierella)属、毛霉(mucor)属、伞状霉(umbelopsis)属等的丝状菌等，但并不限于这些例子。作为酵母菌，可列举子囊菌酵母(ascomycetousyeast)、担子菌酵母(basidiomycetousyeast)、裂殖酵母(fissionyeast)、芽殖酵母(buddingyeast)等。作为上述中优选的例子，可列举高山被孢霉(mortierellaalpina，以下的本说明书中有时称为m.alpina)、mortierellachlamydospora、长枝被孢霉(mortierellaelongata)、微小被孢霉(mortierellaexigua)、喜湿被孢霉(mortierellahygrophila)、mortierellaepigama、mortierellaacrotona、小被孢霉(mortierellaminutissima)、木栖柱被孢霉(mortierellalignicola)、mortierellaclonocystis、矮被孢霉(mortierellanana)、土生被孢霉(mortierellahumicola)、贝勒被孢霉(mortierellabainieri)、透明被孢霉(mortierellahyaline)、mortierellaglobalpina、矮小伞霉(umbelopsisnana)、深黄伞形霉(umbelopsisisabellina)等被孢霉属微生物，更优选列举高山被孢霉(m.alpina)、mortierellaclonocystis、矮被孢霉(mortierellanana)、土生被孢霉(mortierellahumicola)、贝勒被孢霉(mortierellabainieri)、透明被孢霉(mortierellahyaline)、mortierellaglobalpina等。另外，上述适合导入本发明的基因的产脂质微生物只要具有ω-6高度不饱和脂肪酸代谢途径并具有产生花生四烯酸的能力，还可以是上述的plectospira属、酵母和被孢霉(mortierella)属、毛霉(mucor)属、伞状霉(umbelopsis)属等的微生物的突变株。该突变株不需要表达本发明的ω-3去饱和酶以外的ω-3去饱和酶，所以可以是缺少该微生物本来具有的ω-3去饱和酶的缺损株。作为这样的突变株或缺损株的例子，可列举m.alpina1s-4(agric.biol.chem.,1987,51(3):785-790)、m.alpinast1358(biosci.biotechnol.biochem.,2010,74:908-917)等。上述产脂质微生物的突变株或缺损株可通过常规方法，例如采用甲磺酸乙酯(ems)、甲磺酸甲酯(mms)、n-甲基-n-硝基-n-亚硝基胍(j.gen.microbiol.,1992,138:997-1002)、5-溴脱氧尿苷(brdu)、顺铂、丝裂霉素c等诱变剂进行的处理、或采用放射线照射、紫外线照射、高热处理等的突变诱发、或者采用rnai的基因表达抑制等来获得。本发明的ω-3去饱和酶基因可被导入上述微生物的基因组内，或者也可在整合于表达载体的状态下导入基因组外。不论哪种情况下，都较好是本发明的ω-3去饱和酶基因与包含该基因的载体一起导入。用于基因导入的载体可由本领域的技术人员根据导入基因的微生物的种类、或克隆的方法、基因表达的方法等适当选择。例如，作为针对被孢霉(mortierella)属微生物向基因组外导入基因所使用的载体，可列举pd4载体(appl.environ.microbiol.,2000,66(11):4655-4661)、pdzeo载体(j.biosci.bioeng.,2005,100(6):617-622)、pdura5载体(appl.microbiol.biotechnol.,2004,65(4):419-425)、pdx载体(curr.genet.,2009,55(3):349-356)、pbig3ura5(appl.environ.microbiol.,2009,75:5529-5535)等。另外，较好是上述载体中包含用于使所整合的本发明的基因表达的启动子序列或转录终止信号序列，或者用于选择导入有目标基因的转化体的选择标志基因。作为启动子，较好是高表达启动子。例如，作为被孢霉属微生物用的优选高表达启动子，可列举来源于m.alpina的pp3启动子和ssa2启动子、以及对这些启动子的序列进行取代、缺失、添加等而改变了的启动子，但只要可使导入的基因高表达，并不限于这些例子。作为选择标志基因，例如可列举卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、萎锈灵(carboxin)抗性基因、博来霉素(zeocin)抗性基因、潮霉素抗性基因等耐药性基因；与亮氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、色氨酸、赖氨酸等氨基酸营养缺陷型突变(auxotrophicmutation)互补的基因，与尿嘧啶、腺嘌呤等核酸碱基营养缺陷型突变互补的基因等。作为优选的选择标志基因的例子，可列举与尿嘧啶营养缺陷型突变互补的基因。例如，开发有m.alpina的尿嘧啶营养缺陷型突变株(biosci.biotechnol.biochem.,2004,68:277-285)。对于这样的尿嘧啶营养缺陷株，作为选择标志基因可以使用乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因(ura3基因)、或者乳清核苷酸焦磷酸化酶基因(ura5基因)。对于用于构建载体的顺序或所使用的试剂种类、例如限制酶或连接酶等的种类，无特别限定。本领域的技术人员可按照通常的知识，或者适当使用市售品来构建载体。可用于向m.alpina中导入本发明的ω-3去饱和酶基因的转化二元载体的例子示于图2。该载体中，在作为恒定的高表达启动子的ssa2启动子的下游连接有编码本发明的ω-3去饱和酶的多核苷酸(pmd17xxmod)，还整合有作为终止子的sdhb终止子、作为转化体的选择标志的ura5基因。作为将本发明的ω-3去饱和酶基因直接导入微生物的基因组内的方法，可列举同源重组法。准备同时包含本发明的基因和作为导入目的地的基因组的互补序列的载体，若将该载体导入到微生物中，则通过同源重组将本发明的ω-3去饱和酶基因整合至该微生物的基因组上的靶位置。可根据需要向该载体中同时整合上述的启动子序列、转录终止信号序列或者选择标志基因。关于向微生物中导入载体的手段，本领域的技术人员可根据微生物或载体的种类适当选择。例如，向被孢霉属微生物等真菌类中导入载体的情况下，可列举电穿孔法、粒子枪(基因枪)法、atmt法及其改变法(appl.environ.microbiol.,2009,75:5529-5535)等，较好是atmt法及其改变法，但只要可获得稳定保持目标性状的转化体，基因导入法并不限于这些方法。另外，本发明的含epa的脂质的生产方法中所使用的、表达本发明的ω-3去饱和酶的细胞，可施行激活其ω-6高度不饱和脂肪酸代谢途径这样的改变。例如，通过向该细胞中导入编码δ12去饱和酶的基因而使该酶高表达，可促进该细胞内的由油酸向亚油酸的转变，可激活ω-6高度不饱和脂肪酸代谢途径。该途径的激活会使作为本发明的酶底物的ω-6高度不饱和脂肪酸量增加，故其结果是epa的产生得到促进。或者，通过向表达本发明的ω-3去饱和酶的细胞中导入编码δ15去饱和酶的基因而使该酶高表达，可促进由la向ala、或由gla向sda的转变，可激活ω-3高度不饱和脂肪酸代谢途径。另外，还可向表达本发明的ω-3去饱和酶的细胞中导入编码δ12去饱和酶的基因和编码δ15去饱和酶的基因这两者。本发明的含epa的脂质的生产方法中，通过以上顺序得到的表达本发明的ω-3去饱和酶的细胞被接种于液体培养基或固体培养基中进行培养。关于培养的条件，可由本领域的技术人员根据细胞的种类进行最优化。例如，该细胞为真菌的情况下，可将菌株的孢子、菌丝、或者预先培养而得的预培养液接种于上述培养基中进行培养。作为培养基的碳源，可列举葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、甘油、甘露醇、脂质、烷烃、烯烃等，但并不限于这些例子。作为氮源，可列举蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、肉提取物(肉膏)、酪蛋白氨基酸、玉米浆、大豆蛋白、脱脂大豆、棉籽粕、麦麸等天然氮源，除此之外，还可列举尿素等有机氮源、以及硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵等无机氮源，但并不限于这些例子。另外，还可添加大豆油、椰油、玉米油等脂质。添加的脂质较好是大豆油、玉米油等含大量亚油酸的油脂，更好是大豆油。此外，作为微量营养源，还可适当添加磷酸盐、硫酸镁、硫酸铁、硫酸铜等无机盐、或者维生素等。这些培养基成分只要是不妨碍所培养的微生物生长的浓度即可，无特别限定。例如，在培养基中碳源可为0.1～40质量%、较好是1～25质量%，氮源可为0.01～10质量%、较好是0.1～10质量%的浓度。在培养m.alpina或其突变株的情况下，可优选使用后述的czapek培养基、czapek-dox培养基、葡萄糖/酵母提取物(以下也称为“gy”)培养基、sc培养基等。或者，对于被孢霉属微生物用的培养基，还可参考公知的文献(例如国际公开第98/29558号)。培养基的ph值可为4～10，较好是6～9。培养可以是通气搅拌培养、振荡培养或静置培养。为了促进上述细胞的增殖以增加epa的产量，较好是该细胞的培养在最适生长温度下进行。例如，该细胞可在约5～60℃、较好是约10～50℃、更好是约10～40℃、进一步更好是约20～40℃、又更好是约20～30℃下进行培养。例如，细胞为m.alpina或其突变株的情况下，优选在约10～40℃、较好是约20～40℃、更好是约20～30℃下进行培养。该细胞的培养期间可以是例如2～20天，较好是2～14天。需要说明的是，对于被孢霉属微生物的培养方法，还可参考公知的文献(例如日本特开平6-153970号公报)。通过按照上述顺序培养表达本发明的ω-3去饱和酶的细胞，从而在该细胞内生产出含有大量epa的脂质。培养结束后，对培养液实施离心分离、过滤等常用的手段来分离细胞。例如，将培养液离心分离或过滤而除去液体部分，对所分离的细胞进行清洗后，通过冷冻干燥、风干等进行干燥，获得干燥细胞。可通过有机溶剂提取等公知的方法，由该细胞提取作为目标的脂质。作为有机溶剂，可列举己烷、醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、环己烷、苯、甲苯、二甲苯等高度不饱和脂肪酸的溶解性高且可与水分离的溶剂。或者，也可以将这些有机溶剂组合使用。通过减压等从提取物中蒸馏除去有机溶剂，可提取目标脂质。或者，也可不干燥细胞而由湿细胞进行脂质的提取。所得的脂质可适当使用脱胶、脱酸、脱臭、脱色、柱处理、蒸馏等普通方法进一步纯化。上述提取的脂质中，除了作为本发明的方法的目标物的epa以外，还包含成为夹杂物的各种脂肪酸。因此，可进一步纯化上述脂质而获得纯度更高的epa。还可从脂质直接分离epa，但较好是暂且将脂质中的脂肪酸转变成其与低级醇的酯衍生物后，分离作为目标的epa的酯衍生物。酯衍生物可根据碳数、双键的数量、位置的不同等，通过使用各种分离纯化操作来进行分离，因此可容易地获得目标脂肪酸的酯衍生物。然而，与epa碳数相同且双键数量差一个的花生四烯酸难以与epa分离，因此较好是在含有epa的脂质中花生四烯酸少。酯衍生物较好是乙酯衍生物。酯化可使用含有盐酸、硫酸、bf3等酸催化剂、或者甲醇钠、氢氧化钾等碱催化剂的低级醇。可以将银配合物法(例如日本专利第2786748号、日本专利第2895258号、日本专利第2935555号、日本专利第3001954号)、柱层析法、低温结晶法、尿素添加分离法等单独或组合使用，由所得的酯衍生物分离作为目标的epa的酯衍生物。将分离的epa的酯衍生物用碱水解后，用醚、乙酸乙酯等有机溶剂提取，从而可纯化epa。epa可以以盐的形式进行纯化。在以工业规模进行基于本发明的含有大量epa的脂质的生产的情况下，例如可在罐中等大规模培养表达本发明的ω-3去饱和酶的产脂质微生物，用压滤机等过滤，回收细胞，干燥后，用球磨机等将细胞粉碎，用有机溶剂提取脂质。此外，还已知多种以工业规模提取微生物中的成分加以利用的方法、由脂质纯化epa的方法，也可将这些方法适当改变而用于本发明的方法。为了使用本发明的ω-3去饱和酶生产eta，较好是在上述表达本发明的ω-3去饱和酶的细胞中降低δ5去饱和酶的活性。由此，该细胞主要生产eta代替epa。细胞的δ5去饱和酶活性的降低例如可通过在δ5去饱和酶缺损株中表达本发明的酶、或者用rnai抑制细胞中的δ5去饱和酶的表达来实现。细胞的培养、由细胞提取含eta的脂质、eta的纯化的顺序与上述的epa的情形同样。通过本发明得到的epa、eta或它们的盐可用于人或非人动物用的药品、化妆品、食品、饲料等的制造。作为该药品的剂型，可列举例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂、干糖浆剂、溶液剂、悬浮剂等口服制剂，灌肠剂、栓剂等经肠制剂，点滴剂，注射剂，外用剂，经皮、经粘膜、经鼻剂，吸入剂，贴剂等。此外，作为该化妆品的形态，可列举霜、乳液、洗剂、悬浮液、凝胶、粉末、面膜、薄片、贴布、棒、饼等化妆品通常可采用的任意形态。较好的是，上述药品或化妆品可以是用于血小板聚集抑制、血中中性脂肪减少、抗动脉硬化、血液粘度降低、降血压、抗炎、抗肿瘤的药品或者化妆品。上述药品或化妆品含有epa、eta或它们的盐作为有效成分。上述药品或化妆品还可含有作为药物可接受的载体或作为化妆品可接受的载体，例如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、ph调节剂、分散剂、乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、醇、水、水溶性高分子、香料、甜味剂、矫味剂、酸味剂等，还可根据需要含有其他有效成分，例如药效成分、化妆成分等。上述药品或化妆品可通过根据剂型向epa、eta或它们的盐中配合上述载体或其他有效成分，按照常规方法进行调制而制造。上述药物或化妆品中的epa或eta的含量根据其剂型而不同，通常为0.1～99质量%、较好是1～80质量%的范围。上述饮食品或饲料含有epa、eta或它们的盐作为有效成分。这些饮食品或饲料可以是以血小板聚集抑制作用、血中中性脂肪减少作用、抗动脉硬化作用、血液粘度降低作用、降血压作用、抗炎作用、抗肿瘤作用等效果为目的，并标识了该内容的健康食品、功能性饮食品、特定保健用饮食品、患者用饮食品，用于家畜、赛马、观赏动物等的饲料，宠物食品等。上述饮食品或饲料的形态无特别限定，包括可配合epa、eta或它们的盐的所有形态。例如，作为该饮食品的形态，可以是固态、半固态或液态，或者可列举片剂、咀嚼片、粉剂、胶囊、颗粒、饮料、凝胶、糖浆、经管经肠营养用流食等各种形态。作为具体的饮食品的形态的例子，可列举绿茶、乌龙茶或红茶等茶饮料，咖啡饮料、清凉饮料、果冻饮料、运动饮料、乳饮料、碳酸饮料、果汁饮料、乳酸菌饮料、发酵乳饮料、粉末饮料、可可饮料、酒精饮料、纯净水等饮料，黄油、果酱、人造奶油等涂抹食品类、撒在饭上的粉状食品(ふりかけ)、蛋黄酱、起酥油、卡仕达酱、调味品类、面包类、米饭类、面类、意大利面、味噌汤、豆腐、牛乳、酸奶、汤或沙司类、点心(例如饼干或曲奇类、巧克力、糖果、蛋糕、冰淇淋、口香糖、片剂(tablet))等。上述饲料能够以与饮食品几乎相同的组成或形态使用，所以本说明书中关于饮食品的记载对于饲料也同样可以适用。上述饮食品或饲料可通过配合epa、eta或它们的盐、以及饮食品或饲料的制造中所用的其他饮食品原材料、各种营养素、各种维生素、矿物质、氨基酸、各种油脂、各种添加剂(例如呈味成分、甜味剂、有机酸等酸味剂、表面活性剂、ph调节剂、稳定剂、抗氧化剂、色素、香料)等，按照常规方法进行调制而制造。或者，可以通过向通常所食用的饮食品或饲料中配合epa、eta或它们的盐来制造本发明所述的饮食品或饲料。上述饮食品或饲料中的epa或eta的含量根据食品的形态而不同，通常为0.01～80质量%、较好是0.1～50质量%、更好是1～30质量%的范围。实施例以下，使用实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明的技术范围并不限定于以下的实施例。(培养基)gy培养基：2%(w/v)葡萄糖、1%酵母提取物；czapek-dox琼脂培养基：3%蔗糖、0.2%nano3、0.1%kh2po4、0.05%kcl、0.05%mgso4･7h2o、0.001%feso4･7h2o、2%琼脂，ph6.0；ypd培养基：将多聚蛋白胨(polypeptone)20g、酵母提取物10g、腺嘌呤0.4g、琼脂20g和葡萄糖20g在1000ml水中稀释；lb-mg琼脂培养基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、85mmnacl、0.5mmmgso4･7h2o、0.5mmnaoh、1.5%琼脂，ph7.0；基本培养基(mm)：10mmk2hpo4、10mmkh2po4、2.5mmnacl、2mmmgso4･7h2o、0.7mmcacl2、9μmfeso4･7h2o、4mm(nh4)2so4、10mm葡萄糖，ph7.0；诱导培养基(im)：向mm中加入0.5%(w/v)甘油、200μm乙酰丁香酮、40mm2-(n-吗啉基)乙磺酸(mes)，调至ph5.3；sc培养基：5.0g不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮源(yeastnitrogenbasew/oaminoacidsandammoniumsulfate)(difco)、1.7g(nh4)2so4、20g葡萄糖、20g琼脂、20mg腺嘌呤、30mg酪氨酸、1.0mg甲硫氨酸、2.0mg精氨酸、2.0mg组氨酸、4.0mg赖氨酸、4.0mg色氨酸、5.0mg苏氨酸、6.0mg异亮氨酸、6.0mg亮氨酸、6.0mgl-苯丙氨酸。实施例1ω-3去饱和酶的鉴定将plectospiramyriandra在gy培养基10ml中在28℃下振荡培养5天，回收菌体。将收集的菌体放入2ml管中，使用珠粒振荡器(yasuikikai)以1700rpm、10秒×2次的条件将其破碎。用isogen(bio-rad)按照产品指南由破碎的菌体提取mrna。将所提取的mrna用primescripttmiihighfidelityrt-pcrkit(takara)和引物[5'-gaaatggccgacgtgaacacctcctcgc-3'(seqidno:7)和5'-ctatgcgcgcttggtgagcacctcgc-3'(seqidno:8)]进行逆转录，制备seqidno:3所示的cdna。该cdna编码seqidno:4所示的氨基酸序列的多肽。接着，由seqidno:3的序列，进行plectospiramyriandra的基因组dna搜索，鉴定对应的基因组dna序列。进而，从该基因组dna序列除去内含子设计多核苷酸，以它为基础化学合成dna。设计的多核苷酸由seqidno:1的核苷酸序列构成，编码seqidno:2所示的氨基酸序列的多肽。seqidno:2与seqidno:4在全氨基酸序列355个残基中有4个氨基酸不同(氨基酸序列同源性约98.9%)。将上述中制备的cdna(seqidno:3)整合至酵母表达用载体pye22m(biosci.biotech.biochem.,1995,59:1221-1228)中，通过电穿孔法将该载体导入酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)invsc1株(色氨酸营养缺陷型的产油酵母)中，进行了转化。对于上述中制备的合成dna(seqidno:1)也同样地构建载体，制作转化株。将各转化株在ypd培养基中在28℃下培养1天，由整合的cdna表达多肽。需要说明的是，在该培养条件下，该产油酵母本来的ω-3去饱和酶并未表达。接着，向培养基中添加各种ω-6不饱和脂肪酸：亚油酸(la，18:2n-6)、γ-亚麻酸(gla，18:3n-6)、双高-γ-亚麻酸(dgla，20:3n-6)或者花生四烯酸(ara，20:4n-6)并在28℃下培养2天，然后通过气液色谱法(glc)测定通过ω-3去饱和而生成的对应的ω-3不饱和脂肪酸：α-亚麻酸(ala，18:3n-3)、十八碳四烯酸(sda，18:4n-3)、二十碳四烯酸(eta，20:4n-3)或者二十碳五烯酸(epa，20:5n-3)的量。其结果是，碳数20的dgla和ara均转换成了对应的ω-3不饱和脂肪酸，但碳数18的la和gla未转换成对应的ω-3不饱和脂肪酸。由此确认，上述合成dna(seqidno:1)所编码的多肽(seqidno:2)和上述cdna(seqidno:3)所编码的多肽(seqidno:4)均为在常温下对碳数20的脂肪酸具有底物特异性作用的ω-3去饱和酶(即δ17去饱和酶)(表1)。[表1]*1:转换率(%)=[生成物的量/(反应后的底物的量+生成物的量)]×100。实施例2ω-3去饱和酶基因导入用载体的制作结合m.alpina将seqidno:1的核苷酸序列进行密码子最优化，获得seqidno:5所示的多核苷酸。在该seqidno:5所示的多核苷酸的cds的上游和下游构建spei和bamhi位点，克隆至spma-rq(ampr)质粒中。将制备的质粒用spei和bamhi限制酶进行处理，将所得的基因的片段与包含作为恒定高表达启动子的ssa2启动子的质粒pbig35(由京都府立大学提供的pbig2rhph2改变而成，记载于appl.environ.microbiol.,2009,75:5529-5535)连接，构建表达盒。再使该表达盒与尿嘧啶营养缺陷型型标志基因(ura5)串联连接，构建转化用二元载体、pbigssa2ppmd17genome-intronmod(图2)。实施例3ω-3去饱和酶基因导入株的制作将m.alpina(尿嘧啶营养缺陷型株)在含0.05mg/ml尿嘧啶的czapek-dox琼脂培养基中进行培养，收集培养物，然后用miracloth(calbiochem)进行过滤，从而制作m.alpina的孢子悬浮液。通过以下说明的atmt法(appl.environ.microbiol.,2009,75:5529-5535)，向该m.alpina(尿嘧啶营养缺陷型株)中导入实施例2中构建的pbigssa2ppmd17genome-intronmod载体，制作ω-3去饱和酶导入株。通过电穿孔法向根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciensc58c1，由京都府立大学提供)中导入上述二元载体pbigssa2ppmd17genome-intronmod，在lb-mg琼脂培养基中，在28℃下培养48小时。通过pcr法选出包含该载体的根癌农杆菌。将具有该载体的根癌农杆菌用基本培养基(mm)培养2天，以5800×g进行离心分离，加入新鲜的诱导培养基(im)，制作悬浮液。用旋转振荡器在28℃下诱导培养该悬浮液8～12小时，直至od660由0.4变成3.7。将培养后的菌悬浮液100μl与等量的上述m.alpina悬浮液(108ml-1)混合，涂布于承载有硝基纤维素膜(直径70mm，硬化低灰级50，whatman)的共培养培养基(与im同样的组成，但含有5mm葡萄糖和1.5%琼脂来代替10mm葡萄糖)，在23℃下培养2～5天。共培养后，将该膜移至不含尿嘧啶、而含有50g/ml头孢噻肟和50g/ml壮观霉素、0.03%尼罗蓝a(sigma)的sc培养基中，在28℃下培养5天。将来自可视的真菌集落的菌丝移至新鲜的不含尿嘧啶的sc培养基中。将可在不含尿嘧啶的sc培养基中增殖，但在包含5-氟乳清酸(5-foa)的gy培养基中无法增殖的菌体判断为稳定保持性状的ω-3去饱和酶基因导入株。为了选择稳定保持性状的转化体，进行该操作3次。实施例4ω-3去饱和酶基因导入用载体的制作结合m.alpina将seqidno:3的核苷酸序列进行密码子最优化，获得seqidno:6所示的多核苷酸。除了使用该seqidno:6所示的多核苷酸以外，与实施例2同样地进行操作，构建转化用二元载体pbigssa2ppmd17cdnamod(图2)。实施例5ω-3去饱和酶基因导入株的制作除了使用pbigssa2ppmd17cdnamod作为基因导入用载体以外，通过与实施例3同样的顺序制作ω-3去饱和酶导入株。实施例6由ω-3去饱和酶基因导入株生产ω-3不饱和脂肪酸将实施例3和5中得到的ω-3去饱和酶基因导入m.alpina株分别在4ml的gy培养基中在28℃下以120rpm需氧培养3、7和10天。作为对照，将未导入该ω-3去饱和酶基因的m.alpina株同样地进行培养。通过抽滤从各培养液中回收菌体，在120℃下干燥3小时。向干燥菌体中加入含0.5mg/ml的内标(m.alpina无法进行生物合成的碳数23的饱和脂肪酸)的二氯甲烷溶液1ml和盐酸甲醇2ml，通过55℃、2小时的温浴将脂肪酸甲酯化。向反应液中加入蒸馏水1ml和己烷4ml，提取己烷层，进行减压离心，回收脂肪酸甲酯。将所回收的样品溶解于氯仿，通过气液色谱法(glc)测定样品中的脂肪酸组成。glc使用岛津公司制gc-2010、使用glsciences公司制毛细管柱tc70(0.25mm×60m)，以柱温180℃、气化室温度250℃、检测器温度250℃、载气he、补充气体(make-upgas)n2、h2流量40ml/min、空气流量400ml/min、分流比50、分析时间30min的条件进行。对于所提取的各脂肪酸的量，根据glc图的峰面积值以内标的脂肪酸量作为基准进行定量，算出每1ml培养液和每1mg干燥菌体的各脂肪酸的量。进而，求出各脂肪酸相对于总脂肪酸量的比例。其结果是，实施例3和实施例5的ω-3去饱和酶基因导入株中，分别可见最多40.8%和39.6%的epa的蓄积(图3)。另一方面，对照株中未产生epa(无法测定蓄积)。实施例7ω-3去饱和酶活性的比较在保有本发明的ω-3去饱和酶的plectospiramyriandra与被报道保有δ17去饱和酶的异丝水霉(saprolegniadiclina)(例如专利文献4)之间，比较对于碳数20的脂肪酸的ω-3去饱和活性。另外，对于其他8种异丝水霉相似菌(類縁菌)也考察了ω-3去饱和活性。将表2中记载的plectospiramyriandra(nbrcno.32548)、异丝水霉(nbrcno.32710)及其他8种菌株分别在5ml的gy培养基中在28℃下培养7天，通过气液色谱法(glc)测定培养后的培养基中作为ω-3去饱和酶的产物的epa(20:5n-3)和作为其底物的ara(20:4n-6)的量。其结果是，如表2所示，对于plectospiramyriandra而言，与异丝水霉及其相似菌相比，epa相对于ara的含有比率高。由这些结果提示，plectospiramyriandra的ω-3去饱和酶是由ara向epa的转换效率高，可高效地产生epa的酶。[表2]。当前第1页12当前第1页12