用于1,4-丁二醇和其前体生物合成的组合物和方法与流程

文档序号:13108597
本申请为分案申请,原申请的申请日是2008年3月14日、申请号是200880008574.6(PCT/US2008/057168)、发明名称为“用于1,4-丁二醇和其前体生物合成的组合物和方法”。

背景技术:
本发明一般涉及有机体的计算机(insilico)设计,更具体而言,涉及具有1,4-丁二醇生物合成能力的有机体。化合物4-羟基丁酸(4-羟基丁酸(4-hydroxybutanoate)、4-羟基丁酸(4-hydroxybutyrate)、4-HB)是4-碳羧酸,其具有作为各种日用品和特种化学品的构造单元的工业潜力。具体而言,4-HB具有充当进入1,4-丁二醇家族化学品的新切入点的潜力,所述1,4-丁二醇家族化学品包括溶剂、树脂、聚合物前体和特种化学品。1,4-丁二醇(BDO)是聚合物中间体和工业溶剂,全球每年销售约30亿磅。BDO目前从石油化学前体、初级乙炔(primarilyacetylene)、马来酸酐和环氧丙烷生产。例如,乙炔与2分子甲醛以Reppe合成反应进行反应(KroschwitzandGrant,EncyclopediaofChem.Tech.,JohnWileyandSons,Inc.,NewYork(1999)),然后通过催化氢化形成1,4-丁二醇。据估计美国生产的90%的乙炔被消耗用于丁二醇生产。可选地,其可以通过源自丁烷的马来酸酐的酯化和催化氢化形成。在下游,丁二醇可以通过例如氧化进一步被转化成γ-丁内酯——其可以进一步转化成吡咯烷酮和N-甲基-吡咯烷酮,或通过例如氢解进一步被转化成四氢呋喃(图1)。这些化合物作为聚合物中间体、溶剂和添加剂具有各种用途以及具有每年约20亿磅的组合销路。期望通过可选的手段开发生产这些化学品的方法,该手段不仅用可再生物代替石油基原料,而且使用较少的能源和资金集约型工艺。能源部已经提议1,4-二酸,以及特别是琥珀酸,作为关键的生物学生产的中间体,用于生产丁二醇家族产物(DOEReport,“TopValue-AddedChemicalsfromBiomass”,2004)。然而,琥珀酸的分离和纯化昂贵并且催化还原成丁二醇要求高温和高压。因此,对有效生产商业数量的1,4-丁二醇和其化学前体的可选方法存在需求。本发明满足了这种需求并且还提供相关的优势。

技术实现要素:
本发明提供非自然存在的微生物生物催化剂,其包括具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的微生物有机体,该途径具有至少一种外源核酸,所述外源核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或α-酮戊二酸脱羧酶,其中所述外源核酸以足以产生单体4-羟基丁酸(4-HB)的量表达。还提供非自然存在的微生物生物催化剂,其包括具有4-羟基丁酸(4-HB)和1,4-丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物有机体,该途径包括至少一种外源核酸,所述核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸:CoA转移酶、4-丁酸激酶、磷酸转丁酰酶、α-酮戊二酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶或醛/醇脱氢酶,其中外源核酸以足以产生1,4-丁二醇(BDO)的量表达。另外提供生产4-HB的方法。该方法包括将具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的-非自然存在的微生物有机体在基本上厌氧的条件下培养足够的一段时间以产生单体4-羟基丁酸(4-HB),该途径包括至少一种外源核酸,其编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或α-酮戊二酸脱羧酶。进一步提供生产BDO的方法。该方法包括将非自然存在的微生物生物催化剂培养足够的一段时间以产生1,4-丁二醇(BDO),所述微生物生物催化剂包含具有4-羟基丁酸(4-HB)和1,4-丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物有机体,所述途径包括至少一种外源核酸,其编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸:CoA转移酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转羟基丁酰酶、α-酮戊二酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶或醛/醇脱氢酶。4-HB和/或BDO产物可以被分泌到培养基中。附图简述图1是显示4-羟基丁酸(4-HB)进入1,4-丁二醇(BDO)家族化学品的产品管线的切入点和与从石油化学原料的化学合成路线比较的示意图。实黑箭头显示化学合成路线;虚蓝箭头显示4-HB的生物合成路线和接着转化成BDO家族化学品的步骤。图2是显示4-羟基丁酸(4-HB)和1,4-丁二醇生产的生物化学途径的示意图。前5个步骤对于大肠杆菌是内源性的,而其余步骤可以异源表达。催化生物合成反应的酶是:(1)琥珀酰-CoA合成酶;(2)CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶;(3)α-酮戊二酸脱氢酶;(4)谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶;(5)谷氨酸脱羧酶;(6)CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶;(7)4-羟基丁酸脱氢酶;(8)α-酮戊二酸脱羧酶;(9)4-羟基丁酰CoA:乙酰-CoA转移酶;(10)丁酸激酶;(11)磷酸转丁酰酶;(12)醛脱氢酶;(13)醇脱氢酶。图3是显示在大肠杆菌(E.coli)中高丝氨酸生物合成的示意图。图4显示了预测的从L-高丝氨酸到4-HB的高丝氨酸生物途径的示意图。步骤1是推测的脱氨酶(EC分类4.3.1),其中估计的ΔrxnG是12kJ/mol。步骤2是推测的氧化还原酶(EC分类1.3.1),其中估计ΔrxnG为-59kJ/mol。图5显示了天冬氨酸经过延胡索酸转化成琥珀酸的内源性大肠杆菌途径的示意图。该途径显示了类似于预测的高丝氨酸生物途径的化学。图6显示了图解(A)高丝氨酸与(B)琥珀酰-CoA生物合成途径之间平行转化为BDO的示意图。图7是显示在大肠杆菌中生物化学途径到乙酰乙酸的示意图。图8是显示从乙酰乙酸经过琥珀酸半醛至BDO的生物化学途径的示意图。图9是显示D-赖氨酸-5,6-氨基变位酶的反应方案的示意图。图10是显示从乙酰-CoA至乙酰乙酸的途径的示意图。酶是:(1)丙酮酸甲酸-裂解酶、(2)丙酮酸脱氢酶、(3)乙酰CoA:乙酰乙酰-CoA转移酶、(4)乙酰-CoAC-乙酰转移酶、(5)磷酸转乙酰酶和(6)乙酸激酶。酶7表示图8中多步骤的乙酰乙酸至BDO的途径。图11显示使用包埋表达4-HB途径基因的各种组合的质粒的大肠杆菌菌株在葡萄糖基本培养基中生产4-HB。(a)在培养液中的4-HB浓度;(b)在培养液中的琥珀酸浓度;(c)在600nm处测量的培养物OD。条形图组表示24小时、48小时和72小时(如果测量)时间点。沿X轴的编码表示使用的菌株/质粒组合。第一个标记指宿主菌株:1,MG1655lacIQ;2,MG1655ΔgabDlacIQ;3,MG1655ΔgabDΔaldAlacIQ。第二个标记指使用的质粒组合:1,pZE13-0004-0035和pZA33-0036;2,pZE13-0004-0035和pZA33-0010n;3,pZE13-0004-0008和pZA33-0036;4,pZE13-0004-0008和pZA33-0010n;5,对照载体pZE13和pZA33。图12显示在表达来自结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的α-酮戊二酸脱羧酶的大肠杆菌菌株中从葡萄糖生产4-HB。菌株1-3包含pZE13-0032和pZA33-0036。菌株4仅表达空载体pZE13和pZA33。宿主菌株如下:1和4,MG1655lacIQ;2,MG1655ΔgabDlacIQ;3,MG1655ΔgabDΔaldAlacIQ。条形图指在24和48小时时的浓度。图13显示在重组大肠杆菌菌株中从10mM4-HB生产BDO。编号的位置与实验对应,其中MG1655lacIQ包含pZA33-0024,表达来自牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的cat2,以及下列基因在pZE13上表达:1,没有(对照);2,0002;3,0003;4,0003n;5,0011;6,0013;7,0023;8,0025;9,0008n;10,0035。基因编号在表6中定义。对于每个位置,条形图分别指需氧条件、微需氧条件和厌氧条件。微需氧条件通过密封培养管但不排空它们来建立。图14显示由MG1655lacIQpZE13-0004-0035-0002pZA33-0034-0036产生的4-HB和BDO的质谱,MG1655lacIQpZE13-0004-0035-0002pZA33-0034-0036生长在补充有4g/L未标记的葡萄糖(a、c、e和g)、均匀标记的13C-葡萄糖(b、d、f和h)的M9基本培养基中。(a)和(b),衍生BDO的质量116特征碎片,包含2个碳原子;(c)和(d),衍生BDO的质量177特征碎片,包含1个碳原子;(e)和(f),衍生4-HB的质量117特征碎片,包含2个碳原子;(g)和(h),衍生4-HB的质量233特征碎片,包含4个碳原子。图15是生产γ-丁内酯的生物过程的示意性工艺流程图。图(a)图解了伴随分批分离的补料分批发酵,图(b)图解了伴随连续分离的补料分批发酵。发明详述本发明涉及设计和生产具有4-羟基丁酸(4-HB)、γ-丁内酯和1,4-丁二醇生物合成生产能力的细胞和有机体。在一个实施方式中,本发明利用大肠杆菌新陈代谢的计算机化学计算模型,该模型鉴定生物合成生产4-羟基丁酸(4-HB)和1,4-丁二醇(BDO)的代谢设计。本文所述的结果表明,在大肠杆菌和其它细胞或有机体中可以设计和重组改造代谢途径,以实现4-HB和下游产物诸如1,4-丁二醇的生物合成。4-HB的生物合成生产,例如,对于计算机设计,可以通过构建具有已设计的代谢基因型的菌株确认。这些代谢改造的细胞或有机体也可以经历适应进化以进一步增加4-HB生物合成,包括在一些条件下接近理论最大生长。在某些实施方式中,设计菌株的4-HB生物合成特征使得它们是遗传稳定的并且在连续的生物过程中特别有用。单独菌株设计策略通过如下鉴定:将不同的非天然的或异源的反应能力掺入大肠杆菌中,以导致从CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶和CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶产生4-HB和1,4-丁二醇的代谢途径。鉴定计算机代谢设计,其在大肠杆菌和酵母利中从这些代谢途径的每一种导致4-HB的生物合成。1,4-丁二醇中间体γ-丁内酯可在pH<7.5的条件下通过自发环化在培养物中产生,特别是在酸性条件下,诸如pH5.5以下,例如,pH<7、pH<6.5、pH<6以及特别是pH<5.5或更低。经由平台的计算组分鉴定的菌株可通过基因改造任意预测的代谢变化而被投入实际生产中,该代谢变化导致4-HB、1,4-丁二醇或其它中间体和/或下游产物的生物合成生产。在另一进一步的实施方式中,显示出这些化合物的生物合成生产的菌株可进一步经受适应进化,以进一步增加产物的生物合成。适应进化后产物生物合成产率的水平也可以通过系统的计算组分预测。在其它具体实施方式中,微生物有机体被构建以表达4-HB生物合成途径,该途径编码从琥珀酸至4-HB以及至4-HB-CoA的酶促步骤。琥珀酸辅酶A转移酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、NAD-依赖性4-羟基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酸辅酶A转移酶在宿主微生物有机体中的共表达,与缺乏4-HB生物合成途径的宿主微生物有机体相比,导致显著的4-HB产生。在进一步的具体实施方式中,产生4-HB的微生物有机体被生产,通过引入编码α-酮戊二酸脱羧酶和NAD-依赖性4-羟基丁酸脱氢酶的核酸,该微生物有机体利用α-酮戊二酸作为底物。在另一具体实施方式中,包含1,4-丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物有机体被构建,当该微生物有机体在4-HB存在的情况下培养时其生物合成BDO。BDO生物合成途径由编码多功能醛/醇脱氢酶的核酸或编码醛脱氢酶(dehydrogenawse)和醇脱氢酶的核酸组成。为了维持在4-HB底物上生长,这些产生BDO的微生物有机体也表达4-羟基丁酸CoA转移酶或4-丁酸激酶以及磷酸转羟基丁酰酶。在另一进一步的具体实施方式中,微生物有机体被生产,其通过编码功能性4-HB生物合成途径和功能性BDO生物合成途径的核酸的外源表达来合成BDO。4-HB生物合成途径由琥珀酸辅酶A转移酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、NAD-依赖性4-羟基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酸辅酶A转移酶组成。BDO途径由多功能的醛/醇脱氢酶组成。如本文所用,术语“非自然存在的”,当用于指本发明的微生物有机体或微生物时,意欲指该微生物有机体具有至少一个在所述物种的自然存在的菌株中通常未发现的遗传变化,包括所述物种的野生型菌株。遗传变化包括,例如,引入编码代谢多肽的可表达核酸的修饰、其它核酸加成、核酸缺失和/或微生物遗传物质的其它功能破坏。这些修饰包括,例如,所述物种的异源多肽、同源多肽或异源和同源多肽的编码区和其功能片段。另外的修饰包括,例如,非编码调控区,其中修饰改变基因或操纵子的表达。示例性的代谢多肽包括在4-HB生物合成途径中的酶和在BDO化合物家族的生物合成途径中的酶。代谢修饰是指从其自然存在的状态被改变的生物化学反应。因此,非自然存在的微生物具有对编码代谢多肽或其功能片段的核酸的遗传修饰。针对大肠杆菌和酵母菌微生物有机体,示例性的代谢修饰将在下面进一步描述。如本文所用,术语“分离的”,当用于指微生物有机体时,意欲指基本上不含至少一种当所述微生物有机体在自然界中发现时的组分的有机体。该术语包括从在其自然环境中被发现时的一些或全部组分中移出的微生物有机体。该术语还包括从微生物有机体在其非自然存在环境中被发现时的一些或全部组分中移出的微生物有机体。因此,分离的微生物有机体部分或完全与其在自然界中发现时或其在非自然存在的环境中生长、保藏、生存时的其它物质分离。分离的微生物有机体的具体实例包括部分纯的微生物、基本上纯的微生物和在非自然存在的培养基中培养的微生物。如本文所用,术语“微生物的(microbial)”、“微生物有机体(microbialorganism)”或“微生物(microorganism)”意欲指是作为微观细胞存在的任意生物,其包括在古细菌、细菌或真核生物的范围内。因此,该术语意欲包括原核或真核细胞或具有微观大小的生物以及包括所有物种的细菌、古细菌和真细菌以及真核微生物诸如酵母和真菌。该术语还包括任意物种的细胞培养物,所述物种可培养用于生产生物化学物质。如本文所用,术语“4-羟基丁酸”意欲指是丁酸的4-羟基衍生物,其具有化学式C4H8O3和104.11g/mol(其钠盐为126.09g/mol)的分子量。化合物4-羟基丁酸(4-hydroxybutanoicacid)在本领域中也被称为4-HB、4-羟基丁酸(4-hydroxybutyrate)、γ-羟基丁酸或GHB。本文使用的术语拟包括该化合物的各种盐形式的任一个并且包括,例如,4-羟基丁酸盐(4-hydroxybutanoate)和4-羟基丁酸酯(4-hydroxybutyrate)。4-HB盐形式的具体实例包括4-HB钠和4-HB钾。因此,术语4-羟基丁酸、4-HB、4-羟基丁酸盐、4-羟基丁酸酯、γ-羟基丁酸和GHB以及其它的本领域公认的名称在本文中同义使用。如本文所用,术语“单体的”,当用于指4-HB时,意欲指是非聚合或非衍生形式的4-HB。聚合4-HB的具体实例包括聚-4-羟基丁酸和例如4-HB和3-HB的共聚物。4-HB的衍生形式的具体实例是4-HB-CoA。其它聚合4-HB形式和其它4-HB衍生形式在本领域也是已知的。如本文所用,术语“γ-丁内酯”意欲指是具有化学式C4H6O2和分子量为86.089g/mol的内酯。化合物γ-丁内酯在本领域也被称为GBL、丁内酯、1,4-内酯、4-丁内酯、4-羟基丁酸内酯和γ-羟基丁酸内酯。本文使用的术语拟包括该化合物的各种盐形式的任一种。如本文所用,术语“1,4-丁二醇”意欲指是链烷丁烷的醇衍生物,其带有两个羟基,具有化学式C4H10O2和90.12g/mol的分子量。化合物1,4-丁二醇在本领域也称为BDO并且是本文中被称为BDO化合物家族的化合物家族的化学中间体或前体,它们中的一些在图1中示例。如本文所用,术语“四氢呋喃”意欲指与芳香化合物呋喃的完全氢化类似物对应的杂环有机化合物,其具有化学式C4H8O和72.11g/mol的分子量。化合物四氢呋喃在本领域也被称为THF、四氢呋喃、1,4-环氧丁烷、环氧丁烷、环四氢呋喃(cyclotetramethyleneoxide)、环戊烷、二亚乙基氧、四氢呋喃(oxolane)、呋喃烷、氢化呋喃、四亚甲基氧(tetramethyleneoxide)。本文使用的术语拟包括该化合物的各种盐形式的任一种。如本文所用,术语“CoA”或“辅酶A”意欲指有机辅助因子或辅基(酶的非蛋白质部分),其存在是许多酶(脱辅基酶蛋白)的活性所必需的,以形成活性酶系统。辅酶A在某些缩合酶中起作用,在乙酰基或其它酰基转移以及在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化以及在其它乙酰化中产生影响。如本文所用,术语“基本上厌氧的”,当用于指培养物或生长条件时,意欲指对于在液体培养基中的溶解氧而言氧的量小于饱和状态的约10%。该术语还拟包括液体或固体培养基的密封室被保持在小于约1%氧的气氛下。本发明的非自然存在的微生物可包含稳定的遗传变化,其指可被培养成五代以上而不失去所述变化的微生物。一般而言,稳定的遗传变化包括持续10代以上的修饰,特别稳定的修饰将持续约25代以上,以及更特别稳定的遗传修饰将是50代以上,包括无限地。本领域的技术人员应当理解,包括本文示例的代谢修饰在内的遗传变化是参考大肠杆菌和酵母基因以及它们相应的代谢反应进行描述的。然而,假定许多生物的基因组测序完整以及基因组学领域的技能水平高,本领域的技术人员可容易地将本文提供的教导和指导应用于基本上所有的其它生物。例如,本文示例的大肠杆菌代谢变化可通过掺入来自除所述物种之外的物种的相同或相似的编码核酸而容易地应用于其它物种。这些遗传变化一般而言包括例如物种同源物的遗传变化,以及具体而言,直向同源物、种内同源物或非直向同源基因置换。直向同源物通过垂直传递(verticaldescent)相关并且在不同生物中负责基本上相同或同一功能的一个基因或多个基因。例如,小鼠环氧化物水解酶和人环氧化物水解酶对于环氧化物的水解生物学功能而言可被认为是直向同源物。例如,当基因共享数量足以表明它们是同源的序列相似性时,所述基因通过垂直传递相关,或基因通过从共同的祖先进化而相关。如果基因共享三维结构,但不一定共享足以表明它们从共同的祖先进化而来的量——其程度为一级序列相似性不可鉴定——的序列相似性,则所述基因也可以被认为直向同源物。为直向同源的基因可以编码具有约25%序列相似性至100%氨基酸序列同源性的蛋白质。编码共享小于25%的氨基酸相似性的蛋白质的基因,如果它们的三维结构也显示相似性,也可以被认为通过垂直传递产生。酶的丝氨酸蛋白酶家族成员——包括组织纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶,被认为从共同的祖先通过垂直传递产生。直向同源物包括基因或它们编码的基因产物,其通过例如进化在结构或总体活性方面已经偏离。例如,在一种物种编码显示两种功能的基因产物并且这些功能在第二种物种中已经被分成不同的基因的情况下,三个基因和它们的相应的产物被认为是直向同源物。对于生物化学产物的生长相关的生产(growth-coupledproduction),本领域的技术人员应当理解,包埋待被破坏的代谢活性的直向同源基因要进行选择用以构建非自然存在的微生物。显示可分离活性的直向同源物的实例是其中不同的活性已经在两种或更多种物种之间或在单一物种内被分成不同的基因产物的情况。具体实例是将弹性蛋白酶蛋白酶解和纤维蛋白溶酶原蛋白酶解——两种类型的丝氨酸蛋白酶活性——作为纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶分成不同的分子。第二个实例是支原体5′-3′外切核酸酶和果蝇DNA聚合酶III活性的分离。来自第一物种的DNA聚合酶可以被认为是来自第二物种的外切核酸酶或聚合酶中任一种或两者的直向同源物,反之亦然。相反,种内同源基因是通过例如进化趋异所伴随的复制相关的同源物,并且其具有类似或共同的但不是同样的功能。种内同源基因可以起源或源自例如相同的物种或不同的物种。例如,微粒体环氧化物水解酶(环氧化物水解酶I)和可溶性环氧化物水解酶(环氧化物水解酶II)可以被认为是种内同源基因,这是因为它们代表两种不同的酶——其从共同的祖先共同进化而来,所述酶催化不同的反应并且在相同的物种中具有不同的功能。种内同源基因是来自相同物种的、彼此具有明显的序列相似性的蛋白质,这表明它们是同源的或通过从共同的祖先共同进化而相关。种内同源蛋白质家族群包括HipA同源物、荧光素酶基因、肽酶以及其它。非直向同源基因置换是来自一种物种的非直向同源基因,其可以取代不同物种中的相关基因功能。取代包括,例如,与不同物种的相关功能相比,能够在起源的物种中完成基本上相同或类似的功能。尽管一般而言,非直向同源基因置换可以鉴定为结构上与编码相关功能的已知基因有关,但是结构上较不相关但功能上类似的基因和它们相应的基因产物,仍将落入本文所使用的术语的含义中。功能相似性要求,例如,与编码要求取代的功能的基因相比,在非直向同源基因的活性部位或结合区域上至少有一些结构相似性。因此,非直向同源基因包括例如种内同源基因(paralog)或不相关的基因。因此,在鉴定和构建具有4-HB、GBL和/或BDO生物合成能力的本发明的非自然存在的微生物有机体中,本领域技术人员应当理解,通过将本文提供的教导和指导应用到具体的物种,代谢修饰的鉴定可以包括直向同源物的鉴定以及引入或失活。就种内同源基因和/或非直向同源基因置换存在于编码催化相似或基本上相似的代谢反应的酶的相关微生物中的程度,本领域的技术人员还可以利用这些进化相关的基因。直向同源物、种内同源基因和非直向同源基因置换可以通过本领域的技术人员熟知的方法确定。例如,检查两种多肽的核酸或氨基酸序列将揭示在所比较的序列之间的序列同源性和相似性。基于这些相似性,本领域技术人员可以确定相似性是否足够高,以表明蛋白质通过从共同的祖先进化而相关。本领域的技术人员熟知的算法,诸如Align、BLAST、ClustalW以及其它算法,比较和测定未处理的序列相似性或同源性,并且还测定序列中空位(gap)的存在和显著性,所述空位可以被标记重量或分数。这些算法在本领域也是已知的并且可类似地应用于确定核苷酸序列相似性或同源性。确定相关性的足够相似性的参数基于熟知的方法计算,所述方法用于计算统计学的相似性或在随机多肽中发现相似匹配的机会和所确定的匹配的显著性。如果期望,两个或更多个序列的计算机比较也可以由本领域技术人员进行视觉优化。相关的基因产物或蛋白质可以期望具有高度相似性,例如,25%至100%序列同源性。如果细察足够大小的数据库(约5%),不相关的蛋白质可以具有一定同源性,所述同源性与期望偶然出现的基本相同。在5%和24%之间的序列可以或不可以代表足够的同源性,以推断所比较的序列是相关的。根据数据集的大小,可以实施确定这些匹配的显著性的另外的统计学分析,以确定这些序列的相关性。使用BLAST算法确定两个或更多个序列的相关性的示例性参数例如可以是如下所示。简言之,氨基酸序列比对可以使用BLASTP2.0.8版(1999年1月5日)和如下参数完成:Matrix:0BLOSUM62;gapopen:11;gapextension:1;x_dropoff:50;expect:10.0;wordsize:3;filter:on。核酸序列比对可以使用BLASTN2.0.6版(1998年9月16日)和如下参数完成:Match:1;mismatch:-2;gapopen:5;gapextension:2;x_dropoff:50;expect:10.0;wordsize:11;filter:off。本领域的技术人员了解对上述参数可以进行何种修改以增加或减少例如比较的严格性和测定两个或更多个序列的相关性。本发明提供非自然存在的微生物生物催化剂,其包括具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的微生物有机体,所述生物合成途径包含至少一种外源核酸,该外源核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶、α-酮戊二酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶,其中外源核酸以足够产生单体4-羟基丁酸(4-HB)的量表达。4-羟基丁酸脱氢酶也称为4-羟基丁酸脱氢酶或4-HB脱氢酶。琥珀酰-CoA合成酶也称为琥珀酰-CoA合成酶或琥珀酰-CoA连接酶。也提供非自然存在的微生物生物催化剂,其包括具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的微生物有机体,所述途径具有至少一种外源核酸,该外源核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或α-酮戊二酸脱羧酶,其中外源核酸以足够产生单体4-羟基丁酸(4-HB)的量表达。本发明的非自然存在的微生物生物催化剂包括微生物有机体,其采用代谢反应的组合以生物合成生产本发明化合物。生物合成的化合物可以胞内产生和/或分泌到培养基中。由非自然存在的微生物产生的示例性化合物包括,例如,4-羟基丁酸、1,4-丁二醇和γ-丁内酯。这些示例性化合物与化学合成或生物合成的关系在图1中示例。在一个实施方式中,非自然存在的微生物有机体被基因工程以产生4-HB。该化合物是一个进入1,4-丁二醇化合物家族的有用切入点。从琥珀酸、通过琥珀酰-CoA从琥珀酸或从α-酮戊二酸形成4-HB的生物化学反应在图2的步骤1-8中示出。本文一般参考代谢反应、反应物或其产物,或具体参考一个或更多个核酸或基因对本发明进行描述,所述核酸或基因编码与所述代谢反应、反应物或产物相关或催化所述代谢反应、反应物或产物的酶。除非本文另外明确说明,本领域的技术人员应当理解,描述反应也等同于描述反应物和反应产物。类似地,除非本文另外明确说明,描述反应物或产物也涉及反应,以及描述任意的这些代谢成分也涉及编码催化所指代的反应、反应物或产物的酶的一个基因或多个基因。同样地,假定熟知的代谢生物化学、酶学和基因组学领域,本文对基因或编码核酸的讨论也等同于对对应的编码酶和其催化的反应以及该反应的反应物和产物的讨论。使用本发明的微生物有机体通过生物合成方式生产4-HB是特别有用的,这是因为它能生产单体4-HB。本发明的非自然存在的微生物有机体和它们的4-HB和BDO家族化合物的生物合成也是特别有用的,这是因为4-HB产物:(1)被分泌;(2)可以没有任何衍生化诸如辅酶A;(3)避免生物合成期间的热力学改变;(4)允许直接生物合成BDO,以及(5)在酸性pH培养基中允许自发地将4-HB化学转化为γ-丁内酯(GBL)。后面的特性例如对于有效地化学合成或生物合成BDO家族化合物诸如1,4-丁二醇和/或四氢呋喃(THF)也是特别有用的。微生物有机体一般缺乏合成4-HB的能力,因此,图1中显示的任意化合物已知在1,4-丁二醇家族化合物内,或本领域技术人员已知是在1,4-丁二醇家族化合物内。此外,已知具有所有必要的代谢酶能力的生物不从所述的酶和本文所示例的生物化学途径产生4-HB。更确切地,可能不包括下面进一步描述的少数厌氧微生物,具有酶能力的微生物使用4-HB作为底物以生产例如琥珀酸。相反,本发明的非自然存在的微生物有机体产生4-HB作为产物。如上所述,以其单体形式生物合成4-HB不仅在化学合成BDO家族化合物中特别有用,而且它还允许进一步生物合成BDO家族化合物并且完全避免化学合成步骤。本发明的可以生产4-HB的非自然存在的微生物有机体通过确保宿主微生物有机体包括完全地生物化学合成至少一种本发明的4-HB生物合成途径的功能能力而产生。确保至少一种必要的4-HB生物合成途径将4-HB生物合成能力赋予宿主微生物有机体。为了图2的说明,五种必要的4-HB生物合成途径在本文中被示例和显示。一种必要的4-HB生物合成途径包括从琥珀酸生物合成4-HB(琥珀酸途径)。参与该4-HB途径的酶包括CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和4-羟基丁酸脱氢酶。在该途径中,CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶催化与图2显示的箭头相反的反应。另一必要的4-HB生物合成途径包括通过琥珀酰-CoA从琥珀酸进行生物合成(琥珀酰-CoA途径)。参与该4-HB途径的酶包括琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和4-羟基丁酸脱氢酶。三种其它必要的4-HB生物合成途径包括从α-酮戊二酸生物合成4-HB(α-酮戊二酸途径)。因此,第三种必要的4-HB生物合成途径是通过谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶、谷氨酸脱羧酶和4-羟基丁酸脱氢酶生物合成琥珀酸半醛。第四种必要的4-HB生物合成途径还包括从α-酮戊二酸生物合成4-HB,但利用α-酮戊二酸脱羧酶催化琥珀酸半醛合成。4-羟基丁酸脱氢酶催化琥珀酸半醛向4-HB的转化。第五种必要的4-HB生物合成途径包括通过琥珀酰-CoA从α-酮戊二酸进行的生物合成并且利用α-酮戊二酸脱氢酶产生琥珀酰-CoA,其进入上述的琥珀酰-CoA途径。这些4-HB生物合成途径的每一种、它们的底物、反应物和产物在下面的实施例中进一步描述。本发明的非自然存在的微生物有机体可以通过引入可表达的核酸产生,该核酸编码一种或更多种参与一种或多种4-HB生物合成途径的酶。根据选择用于生物合成的宿主微生物有机体,可以表达用于一些或所有的特定的4-HB生物合成途径的核酸。例如,如果选择的宿主缺乏琥珀酸至4-HB途径中的两种酶并且该途径被选择用于4-HB生物合成,则将CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和4-羟基丁酸脱氢酶的可表达核酸引入宿主中,用于随后的外源性表达。可选地,如果选择的宿主展示内源CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶,但是缺乏4-羟基丁酸脱氢酶,则需要该酶的编码核酸以实现4-HB生物合成。以同样的方式,在4-HB生物合成被选择通过琥珀酸至琥珀酰-CoA途径(琥珀酰-CoA途径)发生的情况中,对于缺乏下述酶的宿主:琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和/或4-羟基丁酸脱氢酶,编码核酸将在受体宿主中外源表达。选择通过α-酮戊二酸至琥珀酸半醛途径(α-酮戊二酸途径)的4-HB生物合成,对于缺乏一种或更多种下述酶的宿主而言可以利用外源表达:谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶、谷氨酸脱羧酶和/或4-羟基丁酸脱氢酶或α-酮戊二酸脱羧酶和4-羟基丁酸脱氢酶。根据已选择的宿主微生物有机体的4-HB生物合成途径的组成,本发明的非自然存在的微生物4-HB生物催化剂包括至少一种外源表达的4-HB途径的编码核酸和针对一个或更多个4-HB生物合成途径的多达所有的编码核酸。例如,通过4-羟基丁酸脱氢酶编码核酸的外源表达,在缺乏4-羟基丁酸脱氢酶的宿主中,可以从所有五个途径建立4-HB生物合成。相反,通过所有八种下述酶的外源表达,在缺乏所有八种酶的宿主中,可以从所有五个途径建立4-HB生物合成:CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶、谷氨酸脱羧酶、α-酮戊二酸脱羧酶、α-酮戊二酸脱氢酶和4-羟基丁酸脱氢酶。在本文提供的教导和指导下,本领域的技术人员将理解,以可表达方式引入的编码核酸的数量至少与已选择的宿主微生物有机体的4-HB途径缺乏相对应。因此,本发明的非自然存在的微生物有机体可以具有一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个或八个核酸,其编码组成一个或多个4-HB生物合成途径的上述酶。在一些实施方式中,非自然存在的微生物有机体还可以包括其它遗传修饰,其促进或优化4-HB生物合成或对宿主微生物有机体赋予其它有用的功能。一种这样的其它功能可以包括,例如,增加一个或多个4-HB途径前体的合成,诸如琥珀酸、琥珀酰-CoA和/或α-酮戊二酸。在某些实施方式中,本发明的非自然存在的微生物有机体从包含合成4-HB的酶能力的宿主产生。在该具体的实施方式中,增加4-HB途径产物的合成或累积可以是有用的,以便例如向着4-HB生产方向推动4-HB途径反应。增加的合成或累积可通过例如编码一种或更多种上述4-HB途径酶的核酸的过量表达完成。4-HB途径一种酶或多种酶的过量表达可以通过例如一个或多个内源基因的外源表达发生,或通过一个或多个异源基因的外源表达发生。因此,自然存在的生物通过一个、二个、三个、四个、五个或所有六个编码4-HB生物合成途径酶的核酸的过量表达可以容易地产生而成为本发明的非自然的产生4-HB的微生物有机体。另外,非自然存在的生物可以通过内源基因的突变产生,所述突变引起4-HB生物合成途径中的酶活性增加。在特别有用的实施方式中,采用编码核酸的外源表达。外源表达赋予宿主定制表达和/或调控元件的能力和实现由使用者控制的期望的表达水平的应用。然而,在其它实施方式中,也可以利用内源表达,诸如当连接到诱导型启动子或其它调控元件时,通过除去负调控效应物或诱导基因的启动子。因此,具有自然存在的诱导型启动子的内源基因通过提供适当的诱导剂可以增量调节,或内源基因的调控区可以进行基因工程以掺入诱导型调控元件,从而允许在期望的时间调控内源基因的增加的表达。类似地,对于引入非自然存在的微生物有机体中的外源基因,诱导型启动子可以作为调控元件被包括(例如,参见实施例II和IV)。本文所使用的“外源的”意欲指是相关分子或相关活性被引入宿主微生物有机体中,包括例如通过诸如整合进入宿主染色体中将编码核酸引入宿主遗传物质中。因此,当用于指编码核酸的表达时,该术语指将编码核酸以可表达的形式引入微生物有机体中。当用于指生物合成活性时,该术语指被引入至宿主相关生物中的活性。来源可以是例如同源的或异源的编码核酸,其引入至宿主微生物有机体后表达相关的活性。因此,术语“内源的”指在宿主中存在的相关分子或活性。类似地,当用于指编码核酸的表达时,该术语指在微生物有机体中含有的编码核酸的表达。术语“异源的”指源自相关物种之外的来源的分子或活性,而“同源的”指源自宿主微生物有机体的分子或活性。因此,本发明编码核酸的外源表达可以利用异源的或同源的编码核酸中的任一种或两者。4-HB途径酶的编码核酸的来源可以包括,例如,其中编码的基因产物能够催化相关反应的任意物种。这些物种包括原核和真核生物,包括但不限于,细菌——包括古细菌和真细菌,以及真核细胞——包括酵母、植物、昆虫、动物和包括人在内的哺乳动物。这些来源的示例性物种包括,例如,大肠杆菌、酿酒酵母菌、克氏梭状芽胞杆菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum、产气荚膜梭菌、艰难梭菌、富养罗尔斯通氏菌、牛分枝杆菌、结核分支杆菌和牙龈卟啉单胞菌。例如,具有4-HB生物合成产生的微生物有机体在本文参考大肠杆菌和酵母宿主进行示例。然而,由于目前可获得550个物种以上的全基因组序列(这些中一半以上可在公共数据库上获得,诸如NCBI),包括395种微生物基因组以及多种酵母、真菌、植物和哺乳动物基因组,对于在相关或远缘物种中一个或更多个基因,包括例如已知基因的同源染色体、直向同源物、种内同源基因和非直向同源基因置换,以及生物间遗传变化的互换,对编码必要的4-HB生物合成活性的基因的鉴定,在本领域中是常规的和熟知的。因此,本文参考具体生物诸如大肠杆菌或酵母描述的能够生物合成本发明的4-HB和其它化合物的代谢变化可以容易地应用于其它微生物,包括原核和真核生物等。在本文提供的教导和指导下,本领域技术人员知道在一种生物中示例的代谢变化可以同样应用于其它生物。在某些情况中,诸如当可选的4-HB生物合成途径存在于不相关的物种中时,4-HB生物合成可以通过例如外源表达来自不相关物种的一个或多个种内同源基因而被赋予给宿主物种,所述外源表达催化类似的但不相同的代谢反应,以替换相关的反应。因为不同的生物间存在某些代谢网络之间的差异,所以本领域技术人员应当理解,在不同的生物之间实际的基因应用可以不同。然而,在本文提供的教导和指导下,本领域的技术人员也应当理解,本发明的教导和方法可以使用与本文示例的那些的关联代谢变化而被应用于所有微生物有机体,以在感兴趣物种中构建合成单体4-HB的微生物有机体。宿主微生物有机体可以选自例如细菌、酵母、真菌或可用于发酵过程的多种其它微生物的任一种,并且非自然存在的微生物有机体在它们中产生。示例性细菌包括选自以下的物种:大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌、产琥珀酸厌氧螺菌、琥珀酸放线杆菌、Mannheimiasucciniciproducens、豆根瘤菌、枯草杆菌、谷氨酸棒杆菌、结核分支杆菌、运动发酵单胞菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、天蓝色链霉菌、丙酮丁醇梭菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌。示例性酵母或真菌包括选自以下的物种:酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维斯酵母、马克斯克鲁维酵母、土曲霉、黑曲霉和毕赤酵母。构建和检测非自然存在的产生4-HB的宿主的表达水平的方法可以通过例如本领域中熟知的重组和检测方法完成。可以发现这些方法描述在例如Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ThirdEd.,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork(2001);Ausubel等,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Baltimore,MD(1999)中。4-HB和GBL可以通过例如使用Spherisorb5ODS1柱以及70%10mM磷酸盐缓冲液(pH=7)和30%甲醇的流动相的HPLC分离,并使用UV检测器在215nm处检测(Hennessy等2004,J.ForensicSci.46(6):1-9)。通过气相色谱或通过HPLC和折光率检测器检测BDO,其使用AminexHPX-87H柱和0.5mM硫酸的流动相(Gonzalez-Pajuelo等,Met.Eng.7:329-336(2005))。例如,可以构建一个或多个表达载体,以包埋本文所示例的一个或更多个4-HB生物合成途径和/或一个或更多个BDO生物合成编码核酸,其被可操作地连接到在宿主生物中起作用的表达控制序列。适用于本发明的宿主微生物有机体的表达载体包括例如质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人造染色体,包括可操作稳定整合进入宿主染色体中的载体和选择序列或标记。可选择的标记基因也可以被包括,其例如提供抗生素或毒素抗性,补充营养缺陷型缺乏,或供给培养基中没有的关键营养物。表达控制序列可以包括本领域熟知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当两种或更多种外源编码核酸共同表达时,可以将两种核酸插入到例如单一表达载体中或分离的表达载体中。对于单一载体表达,编码核酸可以可操作地连接到一个共同的表达控制序列或连接到不同的表达控制序列,诸如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。参与代谢或合成途径的外源核酸序列的转化可以使用本领域中熟知的方法证实。使用上述示例的本领域中熟知的方法构建本发明的非自然存在的微生物有机体,以足以产生单体4-HB的量外源表达至少一种编码4-HB途径酶的核酸。每个途径中4-HB酶的示例性表达水平在下面的实施例中将进一步描述。按照本文提供的教导和指导,本发明的非自然存在的微生物有机体可以实现单体4-HB的生物合成,其产生的胞内浓度在大约0.1至25mM之间或以上。一般而言,单体4-HB的胞内浓度是在大约3至20mM之间,特别在大约5至15mM之间,以及更特别在大约8至12mM之间,包括大约10mM或以上。在这些示例性范围的每一个之间和之上的胞内浓度也可由从本发明的非自然存在的微生物有机体实现。如下面进一步描述,用于实现4-HB生物合成的一个示例性的生长条件包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施方式中,本发明的非自然存在的微生物有机体可以在厌氧或基本上厌氧的条件下被维持、培养或发酵。简言之,厌氧的条件指没有氧的环境。基本上厌氧的条件包括例如培养、分批发酵或连续发酵,以便培养基中的溶解氧浓度保持在饱和状态的0和10%之间。基本上厌氧的条件还包括在液体培养基中或在固体琼脂上生长或静止细胞,所述液体培养基或固体琼脂处于维持在小于1%氧的气氛下的密封室中。氧的百分比可以通过例如用N2/CO2混合物或其它适合的一种或多种非氧气体喷射培养物来维持。本发明还提供非自然存在的微生物生物催化剂,其包括具有4-羟基丁酸(4-HB)和1,4-丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物有机体,所述途径包括至少一种外源核酸,该核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸:CoA转移酶、谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶、谷氨酸脱羧酶、CoA-非依赖性醛脱氢酶、CoA-依赖性醛脱氢酶或醇脱氢酶,其中外源核酸以足以产生1,4-丁二醇(BDO)的量表达。4-羟基丁酸:CoA转移酶也被称为4-羟基丁酰CoA:乙酰-CoA转移酶。本发明进一步提供非自然存在的微生物生物催化剂,其包括具有4-羟基丁酸(4-HB)和1,4-丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物有机体,所述途径包括至少一种外源核酸,所述核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸:CoA转移酶、4-丁酸激酶、磷酸转丁酰酶、α-酮戊二酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶或醛/醇脱氢酶,其中外源核酸以足以产生1,4-丁二醇(BDO)的量表达。也可以产生生物合成BDO的非自然存在的微生物有机体。如同本发明的产生4-HB的微生物有机体,产生BDO的微生物有机体也可在胞内产生BDO或分泌BDO到培养基中。按照先前提供的用于构建合成4-HB的微生物有机体的教导和指导,可以将另外的BDO途径掺入产生4-HB的微生物有机体中,以产生也合成BDO和其它BDO家族化合物的生物。BDO和其下游产物的化学合成在图1中说明。能够进行BDO生物合成的本发明的非自然存在的微生物有机体避免了使用4-HB作为切入点的这些化学合成,如图2中所示。如下面进一步所描述,4-HB生产者例如也可以被用于将4-HB化学转化为GBL以及然后转化为BDO或THF。可选地,4-HB生产者可以被进一步修饰,以包含将4-HB和/或GBL转化为BDO的生物合成能力。另外的引入4-HB生产者中的BDO途径包括,例如,在宿主缺乏的背景下外源表达或过量表达一种或更多种在图2中步骤9-13示例的酶。一种这种途径包括,例如,实施如图2中步骤9、12和13显示的反应所必需的酶活性,其中醛和醇脱氢酶可以是具有醛和醇脱氢酶活性的分离酶或多功能酶。另一个这样的途径包括,例如,实施如图2中步骤10、11、12和13中显示的反应所必需的酶活性,同样,其中醛和醇脱氢酶可以是具有醛和醇脱氢酶活性的分离酶或多功能酶。因此,引入至4-HB生产者的另外的BDO途径包括,例如,在宿主缺乏的背景下外源表达或过量表达4-羟基丁酸:CoA转移酶、丁酸激酶、磷酸转丁酰酶、CoA-非依赖性醛脱氢酶、CoA-依赖性醛脱氢酶或醇脱氢酶中的一种或更多种。在不存在能够修饰4-HB的内源酰基-CoA合成酶的情况下,非自然存在的产生BDO的微生物有机体可进一步包括选择用于4-HB的外源酰基-CoA合成酶,或多种酶的组合,所述多种酶具有将4-HB转化成4-HB-CoA净反应。如下面在实施例中进一步所示例,丁酸激酶和磷酸转丁酰酶展示出BDO途径活性并且用4-HB底物催化图2中示例的转化。因此,这些酶在本文中也可以分别称为4-羟基丁酸激酶和磷酸转羟基丁酰酶。可以用于这些4-HB向BDO的体内转化的示例性醇和醛脱氢酶在下面的表1中列出。表1.用于将4-HB转化为BDO的醇和醛脱氢酶除上述示例的那些途径之外的途径也可以使用,以在非自然存在的微生物有机体中产生BDO的生物合成。在一个实施方式中,生物合成可以使用L-高丝氨酸至BDO的途径实现。该途径具有0.90mol/mol葡萄糖的摩尔产量,其看来受还原当量有效性的限制。第二途径从乙酰乙酸合成BDO并且能够获得1.091mol/mol葡萄糖的最大理论产量。任一种途径的实施可以通过引入两种外源酶来实现以及两种途径都可以通过琥珀酰-CoA另外补充BDO产生。途径酶、热力学、理论产量和总体可行性在下面将进一步描述。高丝氨酸途径也可以被改造,以产生产BDO的微生物有机体。高丝氨酸是苏氨酸和甲硫氨酸代谢中的中间体,其经天冬氨酸由草酰乙酸形成。草酰乙酸向高丝氨酸的转化需要一个NADH、两个NADPH和一个ATP(图3)。一旦形成,高丝氨酸就进入苏氨酸和甲硫氨酸的生物合成途径。在大部分生物中,高水平的苏氨酸或甲硫氨酸反馈抑制高丝氨酸生物合成途径(Caspi等,NucleicAcidsRes.34:D511-D516(1990))。高丝氨酸向4-羟基丁酸(4-HB)的转化可以在图4中所示的两个酶步骤中完成。该途径的第一个步骤是通过推定脱氨酶使高丝氨酸脱氨基。该反应的估计热力学屏障是12kJ/mol,但有可能可以由浓度梯度向正方向推动。在步骤2中,产物烯烃——4-羟基丁-2-烯酸通过推定还原酶消耗一个NADH被还原为4-HB。该反应步骤在热力学上非常有利于4-HB合成的方向,其中估计的ΔrxnG为-59kJ/mol。4-HB然后可以转化成BDO,如上面图2中。可用于催化上述转化的酶于图5中示出。例如,在途径的步骤1中的脱氨酶非常类似于天冬氨酸脱氨酶(天冬氨酸酶)的化学性质。天冬氨酸酶是微生物中分布广泛的酶,并且已经被充分表征(Viola,R.E.,Mol.Biol.74:295-341(2008))。大肠杆菌天冬氨酸酶的晶体结构已被解析(Shietal.,Biochemistry36:9136-9144(1997)),因此,有可能直接改造酶活性部位中的突变,这使其底物特异性改变,以包含高丝氨酸。步骤2中的氧化还原酶具有类似于几种充分表征酶的化学性质,所述充分表征酶包括大肠杆菌TCA循环中的延胡索酸还原酶。因为该反应的热力学非常有利,所以具有广泛底物特异性的内源还原酶有可能能够还原4-羟基丁-2-烯酸。尽管当与图2中的途径(1.09mol/mol葡萄糖)比较时,两种途径从代谢前体草酰乙酸显示具有相似的能量和还原要求(图6),但是在厌氧条件下该途径的产量是0.9molBDO/mol葡萄糖。琥珀酰-CoA途径被发现具有更高的产量,这是由于其在能量上更加有效的事实。一个草酰乙酸分子经过高丝氨酸途径转化成BDO将需要消耗2个ATP当量。因为假定PEP羧激酶是可逆的,葡萄糖转化成两个草酰乙酸分子可以产生最多3个ATP分子,因此葡萄糖经过高丝氨酸全部转化成BDO具有负的能量产量。如所期望,如果我们假定能量可以通过呼吸作用产生,则高丝氨酸途径的最大产量增加至1.05mol/mol葡萄糖,其是琥珀酰-CoA途径产量的96%。琥珀酰-CoA途径可以引导一些碳通量(carbonflux)通过丙酮酸脱氢酶和TCA循环的氧化枝路,产生还原当量和琥珀酰-CoA,而没有能量消耗。因而,它不会遭遇与高丝氨酸途径相同的能量问题,因为并不是所有的通量都通过草酰乙酸至琥珀酰-CoA引导至BDO。总之,高丝氨酸途径证实是得到BDO的适当高产量的路线。一个特别有用的特征在于其涉及最小化的基因工程,仅有两个非天然的步骤。该途径可能在BDO合成方向上是热力学有利的。乙酰乙酸途径也可以被改造成以产生产BDO的微生物有机体。在大肠杆菌中,乙酰乙酸由丙酮和亮氨酸降解产生。乙酰乙酸也可以通过参与脂肪酸代谢的酶从乙酰-CoA形成,所述酶包括乙酰-CoA乙酰转移酶和乙酰乙酰-CoA转移酶(图7)。通过乙酰乙酸的生物合成路线在可以代谢单碳化合物以形成乙酰-CoA的微生物有机体中也特别有用。从乙酰乙酸到琥珀酸半醛的三个步骤的路线(图8)可以用于通过乙酰乙酸合成BDO。琥珀酸半醛是一个从琥珀酰-CoA去除的还原步骤或是一个从α-酮戊二酸去除的脱羧步骤,其经过三个还原步骤后(图2)可以转化成BDO。简言之,乙酰乙酸生物途径的步骤1必须使乙酰乙酸通过ω-转氨酶转化成3-氨基丁酸。来自反硝化产碱菌(Alcaligensdenitrificans)的ω-氨基酸:丙酮酸转氨酶(ω-APT)在大肠杆菌中过量表达并且显示具有高的针对3-氨基丁酸的体外活性(Yun等,Appl.Environ.Microbiol.70:2529-2534(2004))。在该研究中没有测量本文需要方向的ω-APT的活性,这是由于在反应混合物中乙酰乙酸自发分解成丙酮。然而,热力学表明其是可行的。在步骤2中,推定氨基变位酶将胺基团从碳骨架的3-位转移至4-位。在3-氨基丁酸上执行该功能的氨基变位酶没有被表征,但来自斯蒂克兰德氏梭菌(Clostridiumsticklandii)的酶具有非常相似的机理(图9)。酶——D-赖氨酸-5,6-氨基变位酶——参与赖氨酸生物合成。自乙酰乙酸到BDO的合成路线经过4-氨基丁酸,其是大肠杆菌中的代谢物,通常由谷氨酸脱羧形成。一旦形成,4-氨基丁酸可以通过4-氨基丁酸转氨酶(2.6.1.19)转化成琥珀酸半醛,4-氨基丁酸转氨酶是已经被生物化学表征的酶。该酶的热力学和该途径的其它步骤接近平衡状态,因此在感兴趣的方向操作酶有可能通过底物和产物浓度来推动。在该途径中选择候选酶的一种考虑是参与前两个步骤的酶的立体选择性。反硝化产碱菌的ω-ABT对3-氨基丁酸的L-立体异构体是特异的,而D-赖氨酸-5,6-氨基变位酶有可能需要D-立体异构体。如果不能找到或改造具有互补立体选择性的酶,则必需加入第三个酶至该途径,所述酶具有消旋酶活性,可以将L-3-氨基丁酸转化成D-3-氨基丁酸。尽管氨基酸消旋酶分布广泛,但这些酶是否可以对ω-氨基酸起作用并不知道。在厌氧条件下该途径的最大理论摩尔产量是1.091mol/mol葡萄糖。为了产生从乙酰乙酸至BDO的通量,必需假定乙酰-CoA:乙酰乙酰-CoA转移酶(图10中酶3)是可逆的。该酶在大肠杆菌中的功能是通过首先将短链脂肪酸转化为硫酯而使其代谢。虽然在消耗乙酸的方向上进行乙酰-CoA:乙酰乙酰-CoA转移酶操作在大肠杆菌中还没有实验证实,但对其它生物中相似的酶的研究支持该反应是可逆的这种假设。消化道微生物罗尔斯通氏菌属某种(Roseburiasp.)和F.prasnitzii中的酶——丁酰-CoA:乙酸:CoA转移酶,在利用乙酸的方向上操作,以产生丁酸(Duncan等,Appl.Environ.Microbiol68:5186-5190(2002))。布氏锥虫(Trypanosomabrucei)中的另一非常相似的酶——乙酰:琥珀酸CoA-转移酶,也在利用乙酸的方向上操作。该反应具有接近于平衡状态的ΔrxnG,因此高浓度的乙酸有可能能够将反应在感兴趣的方向推动。在1.09mol/mol葡萄糖的最大理论BDO生产速率下,模拟预测大肠杆菌可以产生1.098molATP/mol葡萄糖,而没有发酵副产物。该ATP产量对于细胞生长、维持和生产应当是足够的。乙酰乙酸生物途径是一种从乙酰-CoA到BDO的高产量路线。像高丝氨酸途径一样,该途径要求最小化的菌株工程,除BDO途径之外仅有两个非天然步骤。因此,除了先前示例的用于在选择宿主中建立4-HB生物合成的各种修饰的任一个之外,产生BDO的微生物有机体可以包括4-HB途径代谢修饰的任意先前组合和变换以及CoA-非依赖性醛脱氢酶、CoA-依赖性醛脱氢酶或醇脱氢酶的任意表达组合,以产生GBL和/或BDO的生物合成途径。因此,本发明的BDO生产者可以具有例如1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或所有10种酶的外源表达,所述酶对应于六种4-HB途径酶的任一种和/或4种BDO途径酶的任一种。设计和构建遗传修饰微生物有机体使用本领域中熟知的方法进行,以达到足以产生BDO的表达量。具体而言,本发明的非自然存在的微生物有机体可以实现BDO的生物合成,其产生在大约0.1至25mM之间或更多的胞内浓度。一般而言,BDO胞内浓度在大约3-20mM之间,特别地在大约5-15mM之间以及更特别地在大约8-12mM之间,包括大约10mM或更多。在这些示例性范围中的每一个之间和以上的胞内浓度也可从本发明的非自然存在的微生物有机体实现。与4-HB生产者一样,BDO生产者也可以在厌氧条件下被维持、培养或发酵。本发明进一步提供生产4-HB的方法。该方法包括在基本上厌氧的条件下将具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的、非自然存在的微生物有机体培养足够的时间期间以产生单体4-羟基丁酸(4-HB),所述途径包含至少一种外源核酸,所述核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶、α-酮戊二酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。该方法另外可以包括例如将4-HB化学转化成GBL以及转化成BDO或THF。另外提供生产4-HB的方法。该方法包括在基本上厌氧的条件下将具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的、非自然存在的微生物有机体培养足够的时间期间以产生单体4-羟基丁酸(4-HB),所述途径包括至少一种外源核酸,该核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或α-酮戊二酸脱羧酶。4-HB产物可以分泌进入培养基中。进一步提供生产BDO的方法。该方法包括将非自然存在的微生物生物催化剂培养足够的时间期间以产生1,4-丁二醇(BDO),该生物催化剂包含具有4-羟基丁酸(4-HB)和1,4-丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物有机体,该途径包含至少一种外源核酸,其编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸:CoA转移酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转羟基丁酰酶、α-酮戊二酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶或醛/醇脱氢酶。BDO产物可以分泌进入培养基中。应当理解,在本发明的方法中,任意一种或更多种外源核酸可以被引入微生物有机体,以产生本发明的非自然存在的微生物有机体。核酸可以被引入,以便对微生物有机体赋予例如4-HB、BDO、THF或GBL生物合成途径。可选地,编码核酸可以被引入,以产生具有生物合成能力的中间微生物有机体,从而催化一些所需的反应,以赋予4-HB、BDO、THF或GBL生物合成能力。例如,具有4-HB生物合成途径的非自然存在的微生物有机体可以包含至少两种外源核酸,所述外源核酸编码期望的酶,诸如4-羟基丁酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱羧酶的组合;4-羟基丁酸脱氢酶和CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶的组合;4羟基丁酸脱氢酶和CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶的组合;CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和琥珀酰-CoA合成酶的组合;琥珀酰-CoA合成酶和谷氨酸脱羧酶的组合等。因此,应当理解,生物合成途径的两种或更多种酶的任意组合可以包括在本发明的非自然存在的微生物有机体中。类似地,应当理解,如所期望,生物合成途径的三种或更多种酶的任意组合可以包括在本发明的非自然存在的微生物有机体中,例如,4-羟基丁酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱羧酶和CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶;CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和琥珀酰-CoA合成酶;4-羟基丁酸脱氢酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶,等,只要期望的生物合成途径的酶的组合导致相应的期望产物产生。类似地,例如,就任意一种或更多种被引入以赋予BDO生产的外源核酸而言,具有BDO生物合成途径的非自然存在的微生物有机体可以包含至少两种编码期望酶的外源核酸,所述酶诸如4-羟基丁酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱羧酶的组合;4-羟基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酰CoA:乙酰-CoA转移酶的组合;4-羟基丁酸脱氢酶和丁酸激酶的组合;4-羟基丁酸脱氢酶和磷酸转丁酰酶的组合;4-羟基丁酰CoA:乙酰-CoA转移酶和醛脱氢酶的组合;4-羟基丁酰CoA:乙酰-CoA转移酶和醇脱氢酶的组合;4-羟基丁酰CoA:乙酰-CoA转移酶和醛/醇脱氢酶的组合,等。因此,应当理解,生物合成途径的两种或更多种酶的任意组合可以包含在本发明的非自然存在的微生物有机体中。类似地,应当理解,生物合成途径的三种或更多种酶的任意组合可以包含在本发明的非自然存在的微生物有机体中,例如,4-羟基丁酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱羧酶和4-羟基丁酰CoA:乙酰-CoA转移酶;4-羟基丁酸脱氢酶、丁酸激酶和磷酸转丁酰酶;4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰CoA:乙酰-CoA转移酶和醛脱氢酶;4-羟基丁酰CoA:乙酰-CoA转移酶、醛脱氢酶和醇脱氢酶;丁酸激酶、磷酸转丁酰酶和醛/醇脱氢酶,等。类似地,如所期望的,本文公开的生物合成途径的四种、五种或更多种酶的任意组合可以包含在本发明的非自然存在的微生物有机体中,只要期望的生物合成途径酶的组合引起相应的期望产物产生。先前描述的非自然存在的微生物有机体的任一种可以被培养以产生和/或分泌本发明的生物合成产物。例如,4-HB生产者可以被培养用以生物合成产生4-HB。4-HB可以如下所述被分离或处理,以产生GBL、THF和/或BDO。类似地,BDO生产者可以被培养用以生物合成产生BDO。BDO可以被分离或经进一步处理,用于化学合成BDO家族化合物,诸如图1示例的那些下游化合物。生长培养基例如可以是能够向非自然存在的微生物提供碳源的任意碳水化合物来源。这类来源包括例如糖,诸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。其它碳水化合物来源包括,例如,可再生的原料和生物质。在本发明的方法中可以用作原料的生物质的示例性种类包括纤维素生物质、半纤维素生物质和木质素原料或部分原料。这些生物质原料包含,例如,用作碳源的碳水化合物底物,诸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。在本文提供的教导和指导下,本领域技术人员将理解,除上述示例的那些之外的可再生原料和生物质也可以用于培养本发明的微生物有机体,以产生本发明的4-HB和其它化合物。因此,在本文提供的教导和指导下,本领域技术人员将理解,当在诸如碳水化合物的碳源上生长时,非自然存在的微生物有机体可以被产生,其分泌本发明的生物合成的化合物。这些化合物包括,例如,4-HB、BDO和在4-HB途径、BDO途径和/或组合的4-HB和BDO途径中的任意中间代谢物。所需要的全部即是改造一种或更多种图2中显示的酶活性,以实现期望化合物或中间体的生物合成,这包括例如引入4-HB和/或BDO生物合成途径的一些或全部。因此,本发明提供非自然存在的微生物有机体,其当在碳水化合物上生长时分泌4-HB,当在碳水化合物上生长时分泌BDO,和/或当在碳水化合物上生长时分泌图2中显示的任意中间代谢物。本发明的产生BDO的微生物有机体可以从例如琥珀酸、琥珀酰-CoA、α-酮戊二酸、琥珀酸半醛、4-HB、4-羟基丁酰磷酸、4-羟基丁酰-CoA(4-HB-CoA)和/或4-羟基丁醛开始合成。在一些实施方式中,培养条件包括厌氧或基本上厌氧的生长或维持条件。示例性的厌氧条件先前已经进行了描述并且其在本领域是熟知的。用于发酵过程的示例性厌氧条件在下面的实施例中进行描述。所有这些条件以及本领域熟知的其它厌氧条件都可以用于非自然存在的微生物有机体。在这些厌氧的条件下,4-HB和BDO生产者可以分别合成单体4-HB和BDO,其胞内浓度为5-10mM或更高以及先前示例的所有其它浓度。对于本发明的产生4-HB和BDO的非自然存在的微生物有机体而言,也可以产生许多下游化合物。对于本发明的产生4-HB的微生物有机体,单体4-HB和GBL以平衡状态存在于培养基中。4-HB向GBL的转化可以通过例如将微生物有机体在酸性pH培养基中培养而有效地完成。小于或等于7.5的pH,特别是处于或低于5.5的pH,自发地将4-HB转化成GBL,如图1中所显示。使用本领域中熟知的各种方法,可以将所产生的GBL与4-HB和培养物中的其它组分分离。这些分离方法包括例如在实施例中示例的萃取方法以及包括连续液-液萃取、全蒸发、膜式过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取过滤、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、吸附色谱和超滤的方法。所有上述方法在本领域中都是熟知的。分离的GBL可以通过例如蒸馏进行进一步纯化。可以由本发明的产生4-HB的非自然存在的微生物有机体产生的另一个下游化合物包括例如BDO。该化合物可以通过例如GBL的化学氢化来合成。化学氢化反应在本领域是熟知的。一个示例性的方法包括将4-HB和/或GBL或源自培养物的这两种组分的混合物化学还原以产生1,4-丁二醇,其使用多相或均相氢化催化剂和氢,或化学计量或催化使用的氢化物基还原剂进行。在本领域熟知的其它方法可同样应用于上述化学反应,并且其包括例如WO第82/03854号(Bradley等),其描述了在氧化铜和氧化锌催化剂上在蒸汽相中的γ-丁内酯的氢解。英国专利第1,230,276号描述了使用氧化铜-氧化铬催化剂使γ-丁内酯氢化。氢化在液相中进行。也示例了具有高的总反应器压力的间歇式反应。反应器中反应物和产物分压完全在各自的露点以上。英国专利第1,314,126号描述了在镍-钴-钍氧化物催化剂上在液相中的γ-丁内酯的氢化。间歇式反应被示例,其具有高的总压力并且组分分压完全在各组分的露点以上。英国专利第1,344,557号描述了在氧化铜-氧化铬催化剂上在液相中的γ-丁内酯的氢化。汽相或含有蒸汽的混合相显示在一些情况中适用。示例了使用高的总反应器压力的连续流动管状反应器。英国专利第1,512,751号描述了在氧化铜-氧化铬催化剂上在液相中γ-丁内酯氢化为1,4-丁二醇。具有高的总反应器压力的间歇式反应被示例,并且在可测定的情况下,反应物和产物分压完全在各自的露点以上。美国专利第4,301,077号描述了在Ru-Ni-Co-Zn催化剂上γ-丁内酯氢化成1,4-丁二醇。该反应可以在液相或气相中或在混合的液-气相中进行。示例了在高的总反应器压力和相对低的反应器产率下的连续流动的液相反应。美国专利第4,048,196号描述了通过在氧化铜-氧化锌催化剂上液相氢化γ-丁内酯而产生1,4-丁二醇。进一步示例了在高的总反应器压力和高的反应物和产物分压下操作的连续流动管状反应器。以及美国专利第4,652,685号描述了内酯氢化成乙二醇。可以由本发明的产4-HB微生物有机体产生的另外的下游化合物包括例如THF。该化合物可以通过例如GBL的化学氢化来合成。适于将GBL转化成THF的本领域熟知的一个示例性的方法包括,例如,将4-HB和/或GBL或源自培养物的这两个组分的混合物化学还原以产生四氢呋喃,其使用多相或均相氢化催化剂和氢,或化学计量或催化使用的氢化物基还原剂进行。在本领路熟知的其它方法同样适用于上述化学反应并且包括例如美国专利第6,686,310号,其描述了高表面积溶胶-凝胶路线制备的氢化催化剂。也描述了将马来酸还原成四氢呋喃(THF)和1,4-丁二醇(BDO)以及将γ-丁内酯还原成四氢呋喃和1,4-丁二醇的方法。培养条件可以包括例如液体培养方法以及发酵和其它大规模培养方法。如下面的实施例中进一步所述,具体地,本发明的生物合成产物的特别有用的收率可以在厌氧或基本上厌氧的培养条件下获得。本发明进一步提供生产4-HB的方法。该方法包括使具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的、非自然存在的微生物有机体在基本上厌氧的条件下发酵足够的时间以产生单体4-羟基丁酸(4-HB),该途径包含至少一种外源核酸,其编码4-羟基丁酸脱氢酶、CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶、α-酮戊二酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶,该方法包括补料分批发酵和分批分离;补料分批发酵和连续分离,或连续发酵和连续分离。上述培养和化学氢化也可以扩大规模并连续生长以生产4-HB、GBL、BDO和/或THF。示例性的生长方法包括,例如,补料分批发酵和分批分离;补料分批发酵和连续分离;或连续发酵和连续分离。所有这些方法在本领域都是熟知的。使用4-HB生产者允许同时进行4-HB生物合成和化学转化成GBL、BDO和/或THF,采用上述氢化方法同时使用连续培养方法诸如发酵进行。其它氢化方法在本领域也是熟知的并且可以同样用于本发明的方法。具体而言,发酵方法对于生物合成生产商业数量的4-HB和/或BDO特别有用。一般而言,如同非连续培养方法,连续和/或接近连续生产4-HB或BDO包括将本发明的非自然存在的产生4-HB或BDO的生物在充足的养分和培养基中培养,以维持和/或接近维持指数期的生长。在这些条件下的连续培养可以包括例如1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多。另外,连续培养可以包括1周、2周、3周、4周或5周或更多周以及直至数月。可选地,如果适合具体应用,本发明的生物可以培养数小时。应当理解,连续的和/或接近连续的培养条件还可以包括在这些示例性时期之间的所有时间间隔。发酵方法在本领域中是熟知的。简言之,用于生物合成产生本发明的4-HB、BDO或其它4-HB衍生产物的发酵可以用于例如补料分批发酵和分批分离;补料分批发酵和连续分离,或连续发酵和连续分离。本领域中熟知的分批和连续发酵方法的实例在下面的实施例中进一步示例。除了使用本发明的4-HB或BDO生产者用以分别连续生产大量的单体4-HB和BDO的上述发酵方法之外,4-HB生产者例如也可以同时经历如先前所述将单体4-HB化学转化成例如GBL、BDO和/或THF的化学合成方法。BDO生产者例如类似地也可以同时经历如先前所述将BDO化学转化成例如THF、GBL、吡咯烷酮和/或其它BDO家族化合物的化学合成方法。另外,4-HB和BDO生产者的产物可以从发酵培养物中分离并且继续进行化学转化,如本文所公开。简言之,在发酵培养液中可以如Frost等,BiotechnologyProgress18:201-211(2002)所述完成GBL的氢化。在发酵期间氢化的另一个方法包括例如在例如美国专利第5,478,952号中描述的方法。该方法在下面的实施例中进一步示例。因此,本发明另外提供生产γ-丁内酯(GBL)、四氢呋喃(THF)或1,4-丁二醇(BDO)的方法。所述方法包括在基本上厌氧的条件下将非自然存在的微生物有机体发酵足够的时间以产生1,4-丁二醇(BDO)、GBL或THF,所述有机体具有4-羟基丁酸(4-HB)和/或1,4-丁二醇(BDO)生物合成途径,该途径包含至少一种外源核酸,其编码4-羟基丁酸脱氢酶、CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸:CoA转移酶、谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶、α-酮戊二酸脱羧酶、谷氨酸脱羧酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转丁酰酶、CoA-非依赖性1,4-丁二醇半醛脱氢酶、CoA-依赖性1,4-丁二醇半醛脱氢酶、CoA-非依赖性1,4-丁二醇醇脱氢酶或CoA-依赖性1,4-丁二醇醇脱氢酶,所述发酵包括补料分批发酵和分批分离;补料分批发酵和连续分离,或连续发酵和连续分离。除本文所述的本发明的4-HB、BDO和其它产物的生物合成之外,本发明的非自然存在的微生物有机体和方法也可以彼此以各种组合来使用以及与本领域熟知的其它微生物有机体和方法的各种组合来使用,以通过其它路线实现产物生物合成。例如,除使用4-HB生产者和化学步骤之外或除直接使用BDO生产者之外,一种产生BDO的可选方法是添加另一种微生物有机体,其能够将本文示例的4-HB或4-HB产物转化成BDO。一种这样的方法包括例如将本发明的产生4-HB的微生物有机体发酵以产生4-HB,如上面和下面所述。4-HB然后可以用作第二微生物有机体的底物,该第二个微生物有机体将4-HB转化成例如BDO、GBL和/或THF。4-HB可以被直接加入至第二有机体的另一培养物,或4-HB生产者的原始培养物可以通过例如细胞分离而除去这些微生物有机体,然后将第二有机体接着添加至发酵培养液可以用于产生终产物,无需中间纯化步骤。一种能够利用4-HB作为底物生物化学转化成BDO的示例性第二有机体例如是丙酮丁醇梭菌(参见例如,Jewell等,CurrentMicrobiology,13:215-19(1986))。在其它实施方式中,本发明的非自然存在的微生物有机体和方法可以以许多种亚途径(subpathway)组合,以实现例如所述的4-HB和/或BDO的生物合成。在这些实施方式中,本发明的期望产物的生物合成途径可以分离到不同的微生物有机体中,并且不同的微生物有机体可以共同培养以产生终产物。在这种生物合成方案中,一种微生物有机体的产物是第二微生物有机体的底物,直至合成终产物。例如,BDO的生物合成可以如先前所述通过构建微生物有机体完成,该微生物有机体包含将底物诸如内源性琥珀酸通过4-HB转化成终产物BDO的生物合成途径。可选地,BDO也可以在同一容器中使用两种生物通过共同培养或共同发酵由微生物有机体生物合成产生。第一微生物有机体是4-HB生产者,其具有从琥珀酸产生4-HB的基因,以及第二微生物有机体是BDO生产者,其具有将4-HB转化成BDO的基因。在本文提供的教导和指导下,本领域的技术人员应当理解,对于本发明的非自然存在的微生物有机体和方法以及其它微生物有机体、其它具有亚途径的非自然存在的微生物有机体的共同培养物以及本领域中熟知的其它化学和/或生物化学方法的组合,存在许多种组合和变换,以产生本发明的4-HB、BDO、GBL和THF产物。一种用于鉴定和设计有助于产物生物合成的代谢变化的计算方法是OptKnock计算框架,Burgard等,BiotechnolBioeng,84:647-57(2003)。OptKnock是一种提出基因缺失策略的代谢模型化和模拟程序,该基因缺失策略产生遗传稳定的微生物,所述微生物大量产生目标产物。具体而言,该框架检查微生物的完整代谢和/或生物化学网络,以提出迫使期望的生物化学变成细胞生长的专性副产物的基因操作。通过将生物化学生产与细胞生长经由策略性设置的基因缺失或其它功能性基因破坏偶联,在生物反应器中经历长时间之后,施加给改造菌株的生长选择压力,作为强迫性生长相关的生物化学生产的结果,引起性能的改进。最后,当构建基因缺失时,设计的菌株恢复到它们的野生型状态的可能性很微小,这是因为通过OptKnock选择的基因被完全从基因组除去。因此,该计算方法可以用于鉴定引起4-HB和/或BDO生物合成的可选途径,或与非自然存在的微生物有机体结合使用,用以进一步优化4-HB和/或BDO生物合成。简言之,OptKnock是在本文用于指模拟细胞代谢的计算方法和系统的术语。OptKnock程序涉及模型框架和方法,所述方法将具体的约束引入通量平衡分析(FBA)模型中。这些约束包括,例如,定性动力学信息、定性调控信息和/或DNA微阵列实验数据。OptKnock也计算各种代谢问题的解,其通过例如紧缩(tightening)由通量平衡模型产生的通量边界(fluxboundary)以及随后在存在基因加成或缺失的情况下探究代谢网络的性能极限实施。OptKnock计算框架允许构建模型公式,该公式能够有效查询代谢网络的性能极限并且提供解决所产生的混合整数线性规划问题的方法。本文称为OptKnock的代谢模型化和模拟方法描述在例如2002年1月10日提交的美国专利申请序列号10/043,440和2002年1月10日提交的国际专利第PCT/US02/00660号中。鉴定和设计促成产物的生物合成产生的代谢变化的另一计算方法是称为的代谢模型化和模拟系统。该计算方法和系统描述在例如2002年6月14日提交的美国专利申请序列号10/173,547和2003年6月13日提交的国际专利申请第PCT/US03/18838号中。是一种计算系统,其可以用于产生在计算机芯片上的网络模型和模拟经过生物系统的化学反应的质量、能量或电荷通量,以限定包含该系统中化学反应的任意和全部可能功能性的解空间,从而确定该生物系统的允许活性范围。该方法被称为基于约束的模拟,这是因为解空间由约束限定,所述约束诸如所包含反应的已知化学计量学以及与通过反应的最大通量相关的反应热力学和容量约束。由这些约束限定的空间可以被询问以确定生物系统或其生物化学组分的表型性能和行为。分析方法诸如凸分析、线性规划和极端途径的计算,如在例如Schilling等,J.Theor.Biol.203:229-248(2000);Schilling等,Biotech.Bioeng.71:286-306(2000)和Schilling等,Biotech.Prog.15:288-295(1999)中所述,可以用于确定这类表型性能。如下面的实施例中所述,该计算方法学用于在不产生4-HB的微生物有机体中鉴定和分析可行的以及最佳的4-HB生物合成途径。如上所述,一种用于本发明适用的计算程序的基于约束的方法是通量平衡分析。通量平衡分析基于在稳态条件下平衡的通量并且可以如在例如VarmaandPalsson,Biotech.Bioeng.12:994-998(1994)中所述进行。通量平衡方法已经应用于反应网络,以模拟或预测例如下述的系统性能:脂肪细胞代谢,如在FellandSmall,J.Biochem.138:781-786(1986)中所述;在ATP最大化条件下来自大肠杆菌的乙酸分泌,如在MajewskiandDomach,Biotech.Bioeng.35:732-738(1990)中所述;或酵母的乙醇分泌,如在Vanrolleghem等,Biotech.Prog.12:434-448(1996)中所述。另外,该方法可以用于预测或模拟大肠杆菌在各种单碳源上的生长以及流感嗜血杆菌(H.influenzae)的代谢,如在EdwardsandPalsson,Proc.Natl.Acad.Sci.97:5528-5533(2000)、EdwardsandPalsson,J.Bio.Chem.274:17410-17416(1999)和Edwards等,NatureBiotech.19:125-130(2001)中所述。一旦解空间被限定,就可以进行分析以确定在各种条件下可能的方案。该计算方法与生物事实一致,这是因为生物系统是灵活的并且可以以许多不同的方式达到相同的结果。通过进化机理设计生物系统,该进化机理受所有生命系统必须面对的基础约束制约。因此,基于约束的模拟策略包含这些一般事实。进一步,通过紧缩约束对网络模型连续施加更多限制的能力引起解空间大小减小,从而提高用于预测生理学性能或表型的精确性。在本文提供的教导和指导下,本领域技术人员能够在除大肠杆菌和酵母之外的宿主微生物有机体中应用代谢模型化和模拟的各种计算框架,以设计和实施4-HB、BDO、GBL、THF和其它BDO家族化合物的生物合成。这些代谢模型化和模拟方法包括例如上述示例的和OptKnock计算系统。为了说明本发明,本文参考OptKnock模型化和模拟计算框架描述了一些方法。本领域技术人员知道如何使用OptKnock将代谢变化的鉴定、设计和实施应用于本领域中熟知的任何此类其它的代谢模型化和模拟计算框架和方法。细胞或生物生物合成产生生物化学产物的能力可以在使用计算机模型计算的典型代谢网络的生物化学生产极限的背景下进行说明。这些极限通过将限制底物(一种或多种)的摄入率(一个或多个)调整为它们的实验测量值(一个或多个)并且在每个可达到的生长水平计算生物化学生产的最大和最小比率而获得。期望的生物化学生产通常直接与生物质形成竞争细胞内资源。在这些情况下,提高的生物化学生产率将必然导致低于最大生长率。通过上述代谢模型化和模拟程序诸如OptKnock提出的敲除被设计成限制迫使代谢行为从野生型菌株发生改变的可允许解边界。尽管给定菌株的实际解边界随着底物摄入率(一个或多个)增加或降低将扩大或缩小,但是每个实验点将在其计算的解边界内。诸如这些的图表使得能够精确预测设计菌株与它们的性能极限的接近程度,这也表示可获得多大的改善空间。本文示例了OptKnock数学框架,用于准确找到引起产物生物合成以及特别是生长相关的产物生物合成的基因缺失。该方法依赖于基于约束的代谢模拟而建立,该模拟缩小了可能的表型范围,通过连续强加调整物理化学约束,细胞系统可以展示该表型,Price等,NatRevMicrobiol,2:886-97(2004)。如上所述,基于约束的模型和模拟在本领域是熟知的并且通常引起特定细胞目标的优化,经过网络化学计算,以提出可能的通量分布。简单地说,定量为包括代谢物集合(组)N={1,...,N
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