鉴定双价抗除草剂基因棉花GGK2分子标记及应用的制作方法

本发明属于转基因植物鉴定领域，具体涉及鉴定双价抗除草剂基因棉花GGK2的分子标记，以及该分子标记的用途。

背景技术：

杂草严重威胁着棉花的产量和品质.一方面它和棉花争夺光、水和养分,另一方面作为农作物病虫害的中问寄主,传播病虫害。我国棉花栽培中人工除草成本为3000元/公顷，通过将抗除草剂基因导入棉花使棉花品种获得抗除草剂性状，再利用除草剂进行除草，不仅每年可使我国棉农减少投入亿元以上，而且对提高棉花产量和品质、降低棉花生产成本、增加棉农收入具有重要意义。

草甘膦(英文名：Glyphosate；化学式：C3H8NO5P；化学名称：N-(膦酸甲基)甘氨酸；商品名：农达(Roundup)镇草宁、草干膦、膦甘酸等)是美国孟山都公司(Monsanto)开发的一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂，其毒性机制主要是竞争性抑制莽草酸途径中的EPSPS合酶，导致莽草酸途径中断，芳香族氨基酸合成受阻，从而扰乱生物体的正常氮代谢，最终导致生物体死亡。草甘膦具有结构简单、生产成本低、除草效果好、低毒无残留等优点，是目前世界上使用面积最广的除草剂品种。但作为一种非选择性除草剂，它对农作物同样具有灭生性作用，这大大限制了草甘膦在农业生产中的应用范围。为在农业生产中使用草甘膦，须培育具有草甘膦抗性或降解性质的农作物。

抗草甘膦基因为天然存在于某些特定物种中的拮抗除草剂草甘膦的基因，该基因编码抗草甘膦酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，从而使草甘膦失去对菌类或植物的毒害作用。利用基因工程等手段，将抗草甘膦的Epsps基因转入植物体内培育抗草甘膦作物，对于作物控制杂草有着非常重要的生产意义。自从1976年美国孟山都公司的草甘膦类除草剂——农达(Roundup)研制成功并得到广泛应用以来，作物抗草甘膦转基因研究成为抗除草剂基因工程研究的热点。目前，我国已有多个抗除草剂转基因棉花品系进入环境释放和生产试验阶段。

对转基因作物的鉴定检测是对转基因作物进行有效监管的基础。对转基因作物成分的检测方法，主要有针对外源目的基因和调控元件检测的基因特异性检测方法，针对遗传转化载体的特征建立的载体特异性检测方法，针对外源DNA插入序列特征建立的转基因作物品系特异性检测方法等三类。其中转基因作物中外源DNA插入片段的侧翼序列是转基因作物最重要的分子标志物(De Buck S等.Plant J.2009；60.Doi：10.1111/j.1365-313X.2009.03942.x)。由于每个转基因作物品系，外源基因在受体基因组中的整合位点具有随机性，即相同的载体多次转化，整合的位置具有高度的特异性和不可重复性，因此，利用外源DNA插入的染色体位点的侧翼序列特异地鉴定转基因品种(品系)是目前鉴定转基因作物最可靠、最特异的检测方法，此方法能准确检测鉴定同一转化体及其衍生品系(Hensel G等.BMC Plant Biology.12(1):1-11.doi:10.1186/1471-2229-12-171)。专利《基于外源基因旁侧序列鉴定转基因水稻吉生粳2号的方法》(申请号为：201510381819.1)公开了利用外源基因旁侧序列鉴定该转基因材料的方法。

目前，在棉花生产中应用的主要是具有单价抗草甘膦基因的转基因棉花，其对草甘膦抗性相对较差，而专利申请《一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用》(申请号为：2014102047036)公开了一种含有GR79和GAT的双价抗草甘膦基因的转基因棉花，获得了更强的草甘膦抗性，具有巨大的应用价值。

技术实现要素：

本发明人利用农杆菌介导法将专利申请《一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用》(申请号为：2014102047036)中所述的双价抗除草剂基因GR79和GAT导入棉花品系R18，从众多双价抗除草剂转基因事件中筛选到一个单插入D10染色体20274741～20274752位点的转基因事件，最终培育获得了抵抗草甘膦除草剂浓度最高可以达到8倍生产应用浓度的品系，其具有重要的应用价值，发明人将该品系命名为GGK2。以GGK2品系中外源插入片段及其侧翼序列为基础设计特异性引物和特异性探针，用于鉴定GGK2品系或其衍生系，从而形成本发明。

本发明目的在于提供鉴定双价抗除草剂基因棉花的分子标记。

本发明另一目的在于提供用于扩增上述分子标记的PCR引物。

本发明第三目的在于提供上述分子标记在鉴定双价抗除草剂基因棉花上的用途。

本发明第四目的在于提供上述引物在鉴定双价抗除草剂基因棉花上的用途。

本发明第五目的在于提供利用上述分子标记鉴定双价抗除草剂基因棉花的方法。

本发明第六目的在于提供利用上述分子标记培育双价抗除草剂基因棉花的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明鉴定双价抗除草剂基因棉花的分子标记，所述的分子标记由分子标记1和分子标记2组成；其中所述的分子标记1由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成；所述的分子标记2由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。

上述分子标记，其中所述的分子标记1大小为955bp。

上述分子标记，其中所述的分子标记2大小为1143bp。

上述分子标记，其中用于扩增分子标记1的PCR引物对由SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列组成；用于扩增分子标记2的PCR引物对由SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的核苷酸序列组成；具体的引物序列如下：

正向引物GR_F:5'CTACATTAAGGGTATATAGAAGTG3'(SEQ ID No:3)，

反向引物NPT_R:5'GTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAG3'(SEQ ID No:4)；

正向引物GAT_F:5'TTCACTCATTAAACACGCCGAAGAGATC3'(SEQ ID No:5)，

反向引物GL_R:5'TTAGAGTCGAATACGGGGTTTTAC 3'(SEQ ID No:6)。

上述分子标记，其中所述的双价抗除草剂基因棉花是指GGK2、或含有相同双价抗除草剂基因的GGK2的衍生材料，或者由它们作为亲本组配的杂交种。

所述的双价抗除草剂基因是指GR79和GAT。

所述的除草剂是指草甘膦。

用于扩增上述分子标记的PCR引物，所述的PCR引物由2个引物对组成；其中1个引物对由SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列组成；另一个引物对由SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的核苷酸序列组成。

上述分子标记在鉴定双价抗除草剂基因棉花上的应用。

上述应用中所述的双价抗除草剂基因棉花是指GGK2、或含有相同双价抗除草剂基因的GGK2的衍生材料，或者由它们作为亲本组配的杂交种。

上述应用中所述的分子标记由分子标记1和分子标记2组成。

上述应用中所述的分子标记，其中用于扩增分子标记的PCR引物由2个引物对组成；其中用于扩增分子标记1的引物对由PCR引物对由SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列组成；用于扩增分子标记2的引物对由PCR引物对由SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的核苷酸序列组成。

上述引物在鉴定双价抗除草剂基因棉花上的应用。

所述的引物由2个引物对组成，其中1个引物对由SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列组成；另一个引物对由PCR引物对由SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的核苷酸序列组成。

上述应用中所述的双价抗除草剂基因棉花是指GGK2、或含有相同双价抗除草剂基因的GGK2的衍生材料，或者由它们作为亲本组配的杂交种。

本发明还提供了利用上述分子标记鉴定双价抗除草剂基因棉花的方法，包括提取待测棉花基因组DNA，然后以待测棉花基因组DNA为模板，分别以SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增；同时以待测棉花基因组DNA为模板，以SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增；电泳，选择具有分子标记1和分子标记2的棉花，即为双价抗除草剂基因棉花。

上述方法中所述的分子标记1由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成，所述的分子标记2由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。

上述方法中所述的PCR的反应条件为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

上述方法中所述的PCR的反应体系为：基因组DNA(模板)1μL(DNA浓度为100ng/μL)，Taq DNA聚合酶1μL，PCR缓冲液2μL，dNTP mix(2.5mM)2μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，利用ddH2O补充总反应体系至20μL。

上述方法中所述的双价抗除草剂基因棉花是指GGK2、或含有相同双价抗除草剂基因的GGK2的衍生材料，或者由它们作为亲本组配的杂交种。

利用上述分子标记培育双价抗除草剂基因棉花的方法，以GGK2或含有相同双价抗除草剂基因的GGK2的衍生材料为亲本之一杂交；种植杂交后代，在苗期提取叶片基因组DNA，然后以叶片基因组DNA为模板，以SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增；同时以叶片基因组DNA为模板，以SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增；电泳，选择具有分子标记1和分子标记2的棉花，进入下一代的选择程序，淘汰不具有分子标记1和分子标记2的棉花；经过4-6代选择，选出新的双价抗除草剂基因的棉花品种。

所述的双价抗除草剂基因棉花是指GGK2、或含有相同双价抗除草剂基因的GGK2的衍生材料，或者由它们作为亲本组配的杂交种。

所述的除草剂是指草甘膦。

所述的双价抗除草剂基因是指GR79和GAT。

本发明双价抗除草剂基因棉花品系GGK2是中国农业科学院生物技术研究所，利用农杆菌介导法将双价抗除草剂基因GR79和GAT导入棉花品系R18(R18是从柯字312(Coker 312)棉花品种选育获得)，从众多双价抗除草剂转基因事件中筛选获得的一个单插入位点的转基因事件，最终培育获得了高抗除草剂棉花新品系，命名为GGK2。其抵抗草甘膦除草剂浓度最高可以达到8倍生产应用浓度，具有重要的应用价值。

GGK2的构建过程按照专利申请《一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用》(申请号为：2014102047036)公布的方法构建。该品系中由GR79和GAT基因表达盒串联组成的T-DNA(见图1)，以单插入位点的形式整合于棉花染色体上。T-DNA插入片段由NPTⅡ标记基因、GR79和GAT抗除草剂基因表达框串联组成，其在GGK2棉花染色体上存在单个插入位点，位点为D10染色体20274741～20274752位置，插入位点侧翼序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。

利用Tail-PCR方法获得的T-DNA 5'端(RB)侧翼序列，通过Blast分析陆地棉基因组数据库，结果发现NPTⅡ、GR79和GAT表达盒串联组成的T-DNA插入陆地棉D10染色体20274741～20274752位置，同时获得了T-DNA 3'端(LB)侧翼参考DNA序列。依据获得的3'端参考序列设计PCR引物，并对GGK2的PCR产物进行克隆测序，最终获得了完整的3'端侧翼序列。本发明依据T-DNA 5'端(RB)端和3'端(LB)端侧翼DNA序列设计特异引物，通过与T-DNA5'端端和3'端NPTⅡ、GAT外源基因的特异引物进行组合，建立了一套用于检测鉴定双价抗除草剂基因棉花新品系GGK2的方法。

本发明依据双价抗除草剂基因棉花GGK2中外源基因NPTⅡ、GR79、GAT串联表达框在陆地棉D10染色体上插入片段及其侧翼序列SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8建立鉴定GGK2棉花品系及其衍生材料和品种的特异性引物和分子标记，以及利用特异性引物进行PCR扩增鉴定方法。

所述的侧翼序列为T-DNA RB端侧翼棉花基因组序列，其序列如SEQ ID NO:7所示。所述的RB端正向特异引物依据侧翼序列SEQ ID NO:7中1-710bp序列设计，引物位于RB端插入位点上游515bp处，正向引物GR_F：5'CTACATTAAGGGTATATAGAAGTG3'(SEQ ID No:3)；所述的RB端反向特异引物依据NPTⅡ基因序列设计，引物位于RB端插入位点下游440bp处，反向引物NPT_R:5'GTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAG3'(SEQ ID No:4)。

所述的侧翼序列为T-DNA LB端侧翼棉花基因组序列，其序列如SEQ ID NO:8所示。所述的LB端正向特异引物依据GAT基因序列设计，引物位于LB端插入位点上游788bp处，正向引物GAT_F:5'TTCACTCATTAAACACGCCGAAGAGATC3'(SEQ ID No:5)，所述的LB端反向特异引物依据SEQ ID NO:8中1-585bp序列设计，引物位于LB端插入位点下游356bp处，反向引物GL_R:5'TTAGAGTCGAATACGGGGTTTTAC 3'(SEQ ID No:6)。

本发明具有的优点和有益效果：本发明为双价抗除草剂基因棉花品系GGK2或含有相同双价抗除草剂基因的GGK2的衍生材料的检测鉴定提供了准确、可靠的分子标记和特异性引物，可用于GGK2或其衍生材料的鉴定，为转基因安全提供了保证。本发明检测方法简单、检测速度快，适宜于在转基因作物遗传育种中对杂交后代中双价抗除草剂基因的纯合/杂合体育种材料进行大规模地进行鉴定和筛选，有助于缩短育种进程，降低育种成本，为培育双价抗除草剂转基因棉花奠定了基础。

附图说明

图1:转化载体pGBIGR79-GAT的T-DNA区域结构示意图。

图2：抗除草剂转基因棉花GGK2品系检测电泳图谱；其中Ⅰ为非转基因受体材料R18RB端引物扩增产物(阴性对照)；Ⅱ为GGK2T-DNA插入位点RB端引物扩增产物；Ⅲ为非转基因受体材料R18LB端引物扩增产物(阴性对照)；Ⅳ为GGK2T-DNA插入位点LB端引物扩增产物；M为Marker。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件，例如Sambrook等《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)中所述条件，或者依据仪器设备和试剂制造商提供的实验方法所建议的条件。实验中所涉及的试剂和耗材均为市售的常规商品。

实施例1含有双价抗除草剂基因棉花GGK2和非转基因的受体材料R18的PCR鉴定对比试验

(一)试验材料

(1)植物材料：双价抗除草剂基因棉花品系GGK2(中国农业科学院生物所培育)，非转基因受体材料R18(由柯字312(Coker 312)选育获得，中国农业科学院生物技术研究所提供)。

(2)引物：引物由上海生物工程技术有限公司合成。

(二)试验方法

(1)、基因组DNA提取：利用CTAB法分别提取GGK2和R18的叶片基因组DNA。

(2)分子标记1的PCR扩增：分别以GGK2或R18基因组DNA为模板，以GR_F和NPT_R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的引物为：

正向引物GR_F:5'ctacattaagggtatatagaagtg3'(SEQ ID No:3)，

反向引物NPT_R:5'gttgtgcccagtcatagccgaatag3'(SEQ ID No:4)；

其中PCR扩增体系(总体系20uL)为：基因组DNA 1μL(浓度为100ng/μL)，Taq DNA聚合酶(北京全式金生物技术有限公司)1μL，PCR缓冲液2μL，dNTP mix(2.5mM)2μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，利用ddH2O补充总反应体系至20μL。PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

(3)分子标记2的PCR扩增：分别以GGK2或R18基因组DNA为模板，以GAT_F和GL_R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的引物为：

正向引物GAT_F:5'ttcactcattaaacacgccgaagagatc 3'(SEQ ID No:5)

反向引物GL_R:5'ttagagtcgaatacggggttttac3'(SEQ ID No:6)。

其中PCR反应体系和反应条件见步骤(2)。

(4)将步骤(2)和(3)所得的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶浓度为1％进行电泳，结果(见图2)GGK2基因组DNA利用两对引物分别扩增分子标记1(955bp)和分子标记2(1143bp)的2个条带，而对照非转基因受体材料R18不能扩增出条带；将GGK2扩增出的2个条带送交北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，结果分子标记1的核苷酸的序列为SEQ ID No:1，分子标记2的核苷酸序列为SEQ ID No:2。

上述结果说明利用本发明分子标记可以特异的检测鉴定含有外源基因NPT Ⅱ、GR79和GAT的双价转抗除草剂基因棉花材料GGK2，也可用于鉴定含有相同双价抗除草剂基因棉花的GGK2的衍生材料。此外，还说明T-DNA插入染色体位点的侧翼序列及其PCR扩增产物的分子标记1和分子标价2，可以作为标识GGK2及其含有相同双价抗除草剂基因的衍生品系的分子标志物。