从脐带组织中高效获取间充质干细胞的方法与流程

本发明涉及一种脐带间充质干细胞获取方法，特别是涉及一种从脐带组织中高效获取间充质干细胞的方法。

背景技术：

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是干细胞中的一类，来源于发育早期中胚层，具有较高的分化潜能，广泛存在于人体的骨髓、脂肪、脐血等结缔组织和器官间质中，具有自我更新，高度增殖及多向分化潜能，在体内外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、心肌、内皮等多种组织细胞，连续培养和冻存后仍有分化潜能，逐渐成为组织工程和基因治疗领域中极具实用价值的细胞来源，为临床治疗越来越受到人们的重视。

目前对成体干细胞的研究多集中于骨髓来源的MSCs，但由于获取大量骨髓细胞十分困难，且由于骨髓源性的MSCs免疫原性较强，随着年龄增长其细胞数量和分化能力出现明显下降趋势。故寻找一种替代骨髓来源的间充质干细胞迫在眉睫。

脐带(umbilical cord)是哺乳类的连接胎儿和胎盘的管状结构，由两条动脉和一条静脉构成。外包被羊膜，内含华通氏胶(Whartons jelly)，是一种黏液性的结缔组织，对脐血管起支撑和保护的作用，富含透明质酸，由特异的成纤维样细胞和细胞外基质组成。脐带组织中的MSCs主要分布在华通氏胶和脐带血管周围。从脐带组织中分离出的MSCs，其在形态学和免疫表型上均类似于骨髓来源的MSCs。此外，脐带来源的MSCs具有取材方便、对捐献者无损害、细胞增殖力强、免疫原性低、不涉及法律伦理等优势。

目前分离MSCs的方法主要是组织块贴壁法和酶消化法。组织块贴壁法主要是利用MSCs的黏附贴壁能力，在贴壁培养的过程中对MSCs细胞分离和纯化，但组织块贴壁法需要剪碎脐带组织，机械外力对组织细胞有所损伤；脐带是富含胶原和葡萄糖胺的组织，故多用胶原酶等消化脐带组织以获得MSCs，酶消化法能够获得更完整的细胞结构和更多的MSCs，但大多数的酶消化法耗费时间较多，酶的浓度和消化时间对MSCs的分离和培养十分重要。因此，如何稳定、高效地从脐带中获得MSCs是其能否成为理想MSCs来源的关键。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种从脐带组织中高效获取间充质干细胞的方法。为实现上述目的，本发明从脐带组织中高效获取间充质干细胞的方法步骤包括：

(1)脐带MSCs细胞的分离：向洗净剪碎预处理后的脐带组织块内加入胰蛋白酶，在37℃水浴摇床上预消化后弃去消化液，用DPBS反复冲洗后，加入胶原酶I消化液置于37℃水浴摇床上消化，用细胞筛网过滤后收集到的滤液加入数倍体积的完全培养基终止消化，经离心分离得到一次沉淀物原代MSCs细胞；上述用细胞筛网过滤后收集到的剩余组织块重复上述消化至离心分离的步骤得到二次沉淀物原代MSCs细胞；

(2)原代培养：将上述两次沉淀物合并后重悬于完全培养液中，接种至细胞培养瓶内，置于37℃，5％CO₂的培养箱内静置培养；细胞接种24小时后更换新鲜的完全培养液，以后每隔数日更换一次培养液，观察细胞的生长状态；

(3)脐带MSCs细胞的扩增培养：待上述原代培养的细胞达到80％以上汇合时，吸弃细胞培养液，加入DPBS浸洗贴壁细胞多次，吸弃洗涤液，加入胰蛋白酶消化液，静置消化至贴壁细胞脱落，加入数倍体积的完全培养液终止消化，经离心分离所得的细胞沉淀加入aMEM培养液重悬并清洗细胞，重悬清洗多次所得细胞沉淀重悬于无血清培养液，并以数倍比例进行分瓶传代扩增培养得到脐带MSCs细胞。扩增过程所涉及到的培养液均为无血清培养液。此方法不仅能高效获取，而且获得的干细胞具有较高的细胞活性及分化潜能。

作为优化，洗净剪碎预处理后的脐带组织块是健康足月的新生儿脐带，取其靠近婴儿端置于含双抗的生理盐水保存液中，置于冰盒内尽快运输；在生物安全柜内取出脐带，置于培养皿中，将其剪成长的小段，用含双抗的DPBS反复冲洗，直至无明显血块；将脐带纵向剖开，剔除血管；用含双抗的DPBS将组织块漂洗干净，并用眼科剪剪成碎块。

作为优化，靠近婴儿端是靠近婴儿端约20cm左右，培养皿是10cm培养皿，长的小段是2-3cm长的小段，碎块是1-2mm3碎块，。

作为优化，含双抗的生理盐水是含1％双抗的生理盐水，冰盒是4℃冰盒，含双抗的DPBS是含1％双抗的DPBS。

作为优化，含1％双抗的DPBS是含100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素。

作为优化，脐带MSCs细胞的分离步骤中：向洗净剪碎预处理后的脐带组织块内加入胰蛋白酶是将剪碎的组织块收集至六孔板内，加入0.25％胰蛋白酶；反复冲洗是反复冲洗三次，并移至六孔板另外一孔内；置于37℃水浴摇床上消化是置于37℃水浴摇床上消化1小时，摇床转速是100转/分钟，以保证组织块与消化液充分接触；离心分离1000转/分钟，离心5分钟，吸弃上清液，收集得到细胞沉淀。

作为优化，脐带MSCs细胞的分离步骤中：预消化时间是10分钟，胶原酶I消化液是0.1％胶原酶I消化液，细胞筛网是70um细胞筛网，数倍体积的完全培养基3倍滤液体积的完全培养基。

作为优化，每隔数日更换一次培养液是每3天更换一次培养液；置于37℃水浴摇床上消化是置于37℃水浴摇床上消化1小时，其中摇床转速是100转/分钟。

作为优化，脐带MSCs细胞的扩增培养步骤中：加入DPBS浸洗贴壁细胞多次是加入DPBS浸洗贴壁细胞两到三次，静置消化时间是2-3分钟，离心分离是1000转/分钟，离心5分钟；重悬清洗次数是两次。

作为优化，脐带MSCs细胞的扩增培养步骤中：胰蛋白酶消化液是0.25％胰蛋白酶消化液3ml，数倍体积的完全培养液是3倍消化液体积的完全培养液；aMEM培养液是8-10ml的aMEM培养液，以数倍比例进行分瓶培养是以1∶3-1∶5的比例进行分瓶培养。此比例是细胞数量扩增比例。

具体步骤有：

(1)脐带组织的预处理：健康足月的新生儿脐带，取其靠近婴儿端约20cm左右，置于含1％双抗的生理盐水保存液中，于4℃冰盒内尽快运输。在生物安全柜内取出脐带，置于10cm培养皿中，将其剪成2-3cm长的小段，用含1％双抗的DPBS反复冲洗，直至无明显血块。将脐带纵向剖开，剔除血管。用含1％双抗的DPBS将组织块漂洗干净，并用眼科剪将组织块剪碎至1-2mm³。

(2)脐带MSCs细胞的分离：将剪碎的组织块收集至六孔板内，加入0.25％胰蛋白酶，37℃水浴摇床上消化预消化10分钟。弃去消化液，用DPBS将组织块反复冲洗三次，并移至另外一孔内，加0.1％胶原酶I消化液，置于37℃水浴摇床上消化1小时，其中摇床转速是100转/分钟，以保证组织块与消化液充分接触。将消化液用70um细胞筛网过滤，收集滤液，加入3倍滤液体积的完全培养基终止消化，1000转/分钟，离心5分钟，吸弃上清液，得到的沉淀物即为原代MSCs细胞。将剩余组织块重复上述操作，加0.1％胶原酶I消化液，继续消化1小时，收集得到的细胞沉淀。

(3)脐带来源MSCs细胞的原代培养：将两次消化所得的细胞沉淀重悬于完全培养液中，接种至细胞培养瓶内，于37℃，5％CO₂的培养箱内静置培养。细胞接种24小时后更换新鲜的完全培养液，以后每3天更换一次培养液，观察细胞的生长状态。

(4)脐带来源MSCs细胞的扩增培养：待原代培养的细胞达到80％以上汇合时，吸弃细胞培养液。加入DPBS浸洗贴壁细胞两到三次，吸弃洗涤液。加入0.25％胰蛋白酶消化液3ml，静置消化2-3分钟至贴壁细胞脱落。加入3倍消化液体积的完全培养液终止消化，1000转/分钟，离心5分钟。将所得细胞沉淀加入8-10ml的aMEM培养液，重悬并清洗细胞。重复两次后，将所得细胞沉淀重悬于无血清培养液，并以1∶3-1∶5的比例进行分瓶培养。此后的细胞培养及扩增过程所涉及到的培养液，均为无血清培养液。

其中：所述双抗(PS)购自Gibco公司。所用完全培养液为aMEM、胎牛血清(FBS)、双抗(PS)的混合液，其中aMEM∶FBS∶PS的体积比为89∶10∶1。所用无血清培养液来自Gibco公司。

采用上述技术方案后，本发明从脐带组织中高效获取间充质干细胞的方法具有极大程度缩短了原代细胞的获取时间，更加方便快捷；很大程度上避免了动物源成分对人体造成的不良反应，更安全可靠；通过对脐带MSCs生物学特性如生长状态、表面标志物、多向分化潜能等方面的系统研究，证实了经体外多次扩增培养以后，细胞仍具有较强的干细胞特性，可满足临床和实验研究的需要。其不但能快速高效获取，而且获得的干细胞具有较高的细胞活性及分化潜能。

附图说明

图1-2是现有组织块贴壁培养方法获取的细胞传代培养三天后40倍和100倍的间充质干细胞形态学照片；

图3-4是本发明从脐带组织中高效获取间充质干细胞的方法获取的细胞传代培养三天后40倍和100倍的间充质干细胞形态学照片；

图5-8是本发明从脐带组织中高效获取间充质干细胞的方法获取的间充质干细胞采用流式细胞术检测细胞表面阳性标志物表达的峰形图；

图9是本发明从脐带组织中高效获取间充质干细胞的方法获取的间充质干细胞采用流式细胞术检测细胞表面阴性标志物表达的峰形图；

图10是本发明从脐带组织中高效获取间充质干细胞的方法获取的间充质干细胞在成脂诱导12天，对脂肪细胞进行油红0染色的照片；

图11是本发明从脐带组织中高效获取间充质干细胞的方法获取的间充质干细胞在成骨诱导18天，对矿化结节进行茜素红染色的照片。

具体实施方式

本发明从脐带组织中高效获取间充质干细胞的方法步骤包括：(1)脐带MSCs细胞的分离：向洗净剪碎预处理后的脐带组织块内加入胰蛋白酶，在37℃水浴摇床上预消化后弃去消化液，用DPBS反复冲洗后，加入胶原酶I消化液置于37℃水浴摇床上消化1小时，用细胞筛网过滤后收集到的滤液加入数倍体积的完全培养基终止消化，经离心分离得到一次沉淀物原代MSCs细胞；上述用细胞筛网过滤后收集到的剩余组织块重复上述消化至离心分离的步骤得到二次沉淀物原代MSCs细胞；

(2)原代培养：将上述两次沉淀物合并后重悬于完全培养液中，接种至细胞培养瓶内，置于37℃，5％CO₂的培养箱内静置培养；细胞接种24小时后更换新鲜的完全培养液，以后每隔数日更换一次培养液，观察细胞的生长状态；

(3)脐带MSCs细胞的扩增培养：待上述原代培养的细胞达到80％以上汇合时，吸弃细胞培养液，加入DPBS浸洗贴壁细胞多次，吸弃洗涤液，加入胰蛋白酶消化液，静置消化至贴壁细胞脱落，加入数倍体积的完全培养液终止消化，经离心分离所得的细胞沉淀加入aMEM培养液重悬并清洗细胞，重悬清洗多次所得细胞沉淀重悬于无血清培养液，并以数倍比例进行分瓶传代扩增培养得到脐带MSCs细胞。增代培养的细胞培养及扩增过程所涉及到的培养液均为无血清培养液。

具体是：洗净剪碎处理后的脐带组织块是健康足月的新生儿脐带，取其靠近婴儿端置于含双抗的生理盐水保存液中，置于冰盒内尽快运输；在生物安全柜内取出脐带，置于培养皿中，将其剪成长的小段，用含双抗的DPBS反复冲洗，直至无明显血块；将脐带纵向剖开，剔除血管；用含双抗的DPBS将组织块漂洗干净，并用眼科剪剪成碎块。

更具体是：靠近婴儿端是靠近婴儿端约20cm左右，培养皿是10cm培养皿，长的小段是2-3cm长的小段，碎块是1-2mm³碎块。

更具体是：含双抗的生理盐水是含1％双抗的生理盐水，冰盒是4℃冰盒，含双抗的DPBS是含1％双抗的DPBS。

优选：含1％双抗的DPBS是含I00U/ml青霉素、100ug/ml链霉素。

具体是：脐带MSCs细胞的分离步骤中：向洗净剪碎预处理后的脐带组织块内加入胰蛋白酶是将剪碎的组织块收集至六孔板内，加入0.25％胰蛋白酶；反复冲洗是反复冲洗三次，并移至六孔板另外一孔内；置于37℃水浴摇床上消化是置于37℃摇床上消化1小时，摇床转速是100转/分钟，以保证组织块与消化液充分接触；离心分离1000转/分钟，离心5分钟，吸弃上清液，收集得到细胞沉淀。

具体是：脐带MSCs细胞的分离步骤中：预消化时间是10分钟，胶原酶I消化液是0.1％胶原酶I消化液，细胞筛网是70um细胞筛网，数倍体积的完全培养基3倍滤液体积的完全培养基。

具体是：每隔数日更换一次培养液是每3天更换一次培养液；置于37℃水浴摇床上消化是置于37℃摇床上消化1小时，摇床转速是100转/分钟。

具体是：脐带MSCs细胞的扩增培养步骤中：加入DPBS浸洗贴壁细胞多次是加入DPBS浸洗贴壁细胞两到三次，静置消化时间是2-3分钟，离心分离是1000转/分钟，离心5分钟；重悬清洗次数是两次。

具体是：脐带MSCs细胞的扩增培养步骤中：胰蛋白酶消化液是0.25％胰蛋白酶消化液3ml，数倍体积的完全培养液是3倍消化液体积的完全培养液；aMEM培养液是8-10ml的aMEM培养液，以数倍比例进行分瓶培养是以1∶3-1∶5的比例进行分瓶培养。

实施例一，本发明从脐带组织中高效获取间充质干细胞的方法步骤是：(1)脐带组织的预处理：健康足月的新生儿脐带，取其靠近婴儿端约20cm左右，置于含1％双抗的生理盐水保存液中，于4℃冰盒内尽快运输。在生物安全柜内取出脐带，置于10cm培养皿中，将其剪成2-3cm长的小段，用含1％双抗的DPBS反复冲洗，直至无明显血块。将脐带纵向剖开，剔除血管。用含1％双抗的DPBS将组织块漂洗干净，并用眼科剪将组织块剪碎至1-2mm3。(2)脐带MSCs细胞的分离：将剪碎的组织块收集至六孔板内，加入0.25％胰蛋白酶，37℃水浴摇床上预消化10分钟。弃去消化液，用DPBS将组织块反复冲洗三次，并移至另外一孔内，加0.1％胶原酶I消化液，置于37℃水浴摇床上消化1小时，摇床转速是100转/分钟，以保证组织块与消化液充分接触。将消化液用70um细胞筛网过滤，收集滤液，加入3倍滤液体积的完全培养基终止消化，1000转/分钟，离心5分钟，吸弃上清液，得到的沉淀物即为原代MSCs细胞。将剩余组织块重复上述操作，加0.1％胶原酶I消化液，继续消化1小时，收集得到的细胞沉淀。(3)脐带来源MSCs细胞的原代培养：将两次消化所得的细胞沉淀重悬于完全培养液中，接种至细胞培养瓶内，于37℃，5％CO₂的培养箱内静置培养。细胞接种24小时后更换新鲜的完全培养液，以后每3天更换一次培养液，观察细胞的生长状态。(4)脐带来源MSCs细胞的扩增培养：待原代培养的细胞达到80％以上汇合时，吸弃细胞培养液。加入DPBS浸洗贴壁细胞两次，吸弃洗涤液。加入0.25％胰蛋白酶消化液3ml，静置消化2分钟至贴壁细胞脱落。加入3倍消化液体积的完全培养液终止消化，1000转/分钟，离心5分钟。将所得细胞沉淀加入8ml的aMEM培养液，重悬并清洗细胞。重复两次后，将所得细胞沉淀重悬于无血清培养液，并以1∶3的比例进行分瓶培养。此后的细胞培养及扩增过程所涉及到的培养液，均为无血清培养液。

其中：所述双抗(PS)购自Gibco公司。所用完全培养液为aMEM、胎牛血清(FBS)、双抗(PS)的混合液，其中aMEM∶FBS∶PS的体积比为89∶10∶1。所用无血清培养液来自Gibco公司。

上述实施例一方法获得的人脐带MSCs细胞形态学观察：对于同样长度、同一来源的脐带组织，我们对比了组织块贴壁培养法与本发明酶多步消化法提取的MSCs。通过观察细胞贴壁时间、收获的细胞数目及细胞形态，发现本发明酶多步消化法获取的细胞次日即可贴壁，约5-7天即可进行传代培养，参见图3-4。而现有组织块贴壁法7天时初见有少量细胞爬出，约14天左右方可进行传代，参见图1-2。同样长度的脐带组织，采用酶多步消化法获取的细胞在传代时获取的细胞总数目稍多，传代后为均一长梭形以平行排列为主或以漩涡状生长。由此可见，在原代细胞提取时采用酶多步消化法可以节约很长时间，且细胞提取的成功率较高。图1-2为现有组织块贴壁法(A：×40倍，B：×100倍)从脐带中获取的MSCs细胞培养至第三代的形态。图3-4为本发明酶多步消化法(C：×40倍，D：×100倍)从脐带中获取的MSCs细胞培养至第三代的形态。

上述实施例一方法获得的人脐带MSCs的生物学特性检测：在MSCs细胞扩增培养的过程中，我们采用无血清细胞培养液，很好地维持了干细胞的特性。我们采用流式细胞术检测了P7代的MSCs细胞表面标志物。结果表明，细胞表面表达的CD44、CD73、CD90、和CD105阳性比率均在97％之上，参见附图5-8，表面标志物CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阳性比率低于2％，参见附图9。

上述实施例一方法获得的人脐带MSCs的诱导分化能力检测：对P7代细胞进行了多向分化能力的检测。结果表明，在常规诱导条件下，人脐带MSCs可以分化成为脂肪细胞和成骨细胞，也证实了我们的细胞具有较强的可塑性及多向分化潜能。

P7代细胞经成脂诱导培养12天后，显微镜下可见有大量脂滴形成，且油红0染色呈阳性，证明我们的细胞具有向成脂肪方向分化的潜能。

P7代细胞经成骨诱导培养18天后，细胞基质矿化物逐渐出现，显微镜下可见明显钙化结节，经茜素红染色后呈深红色，证明我们的细胞具有向成骨方向分化的潜能。

附图10为成脂诱导12天，油红0染色可见细胞内有大量红色颗粒(×100倍)；附图11为成骨诱导18天，茜素红染色可见红色矿化结节(×100倍)。

采用上述技术方案后，本发明从脐带组织中高效获取间充质干细胞的方法极大程度上缩短了原代细胞的获取时间，更加方便快捷；很大程度上避免了动物源成分对人体造成的不良反应，更安全可靠；通过对脐带MSCs生物学特性如生长状态、表面标志物、多向分化潜能等方面的系统研究，证实了经体外多次扩增培养以后，细胞仍具有较强的干细胞特性，可满足临床和实验研究的需要。