优先权
本申请要求于2008年3月21日提交的美国临时申请系列号61/038,520的优先权，其通过引用全文并入到本文中。
技术领域
本组合物和方法涉及用于改善纤维素材料酶促水解的纤维素酶/半纤维素酶的酶混合物。
背景
生物量的主要组分是纤维素和半纤维素。纤维素由β-1,4-连接的葡萄糖残基的聚合物组成，这些残基装配成更高级的纤维状结构。半纤维素是杂多糖，包括除葡萄糖以外的单糖，例如D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖和4-O-甲基-D-葡糖醛酸，不仅通过糖苷键而且还通过酯键相连接。半纤维素的组成和结构比纤维素更复杂，在多种木本植物物种、草本植物和谷类中可以定量且定性的改变。
纤维素可以转化为糖，例如葡萄糖，并被多数微生物用作能源，所述微生物包括用于工业目的的细菌、酵母和真菌。纤维素材料还可由可商购的酶转化为糖，所获得的糖可用作工业微生物的原料，来生产产品例如塑料和乙醇。然而，目前的纤维素酶产品通常缺少水解半纤维素材料的能力，半纤维素仍未消耗地保留在生物量组合物中，可以干扰生物量的处理和处置。
因此，仍然需要开发用于同时水解纤维素和半纤维素的有效的酶系统，包括优化的酶组合的共同产生或混合物，所述酶组合用于将半纤维素寡聚物和聚合物转化为游离戊糖用于发酵。此类优化的酶系统对提高生物量的效率和经济是理想的。
概述
本教导内容提供了优化的生物转化酶混合物，生产所述酶混合物的方法，以及使用优化的生物转化酶混合物将生物量转化为糖的方法。生物转化酶混合物包括完整的纤维素酶和一种或多种半纤维素酶的混合物，所述酶的选择由预期的生物量底物和处理条件决定。
在一个方面，提供了用于水解纤维素和半纤维素材料的混合物的酶混合组合物，包含：
(a)第一种酶组合物，包含纤维素酶；
(b)第二种酶组合物，包含至少一种选自GH10或GH11木聚糖酶的木聚糖酶，和
(c)第三种酶组合物，包含至少一种其它的半纤维素酶，所述半纤维素酶不是GH10或GH11木聚糖酶，或者不是与(b)中相同的GH10或GH11木聚糖酶，
其中，与缺少至少一种其它的半纤维素酶的等同的酶混合组合物相比，上述酶混合组合物提供至少一种的(i)增加的葡聚糖转化或(ii)增加的木聚糖转化。
在一些实施方案中，第一种酶组合物是来自丝状真菌的全纤维素酶混合物。在一些实施方案中，第一种酶组合物是补充了额外量的β-葡糖苷酶的来自丝状真菌的全纤维素酶混合物。
在一些实施方案中，第二种酶组合物包含来自里氏木霉的木聚糖酶XYN2。在一些实施方案中，第二种酶组合物包含来自里氏木霉的木聚糖酶XYN3。
在一些实施方案中，至少一种木聚糖酶具有与选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一种木聚糖酶具有与选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，至少一种木聚糖酶具有选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶是选自GH54半纤维素酶、GH62半纤维素酶、GH27半纤维素酶、GH36半纤维素酶、GH5半纤维素酶、GH74半纤维素酶、GH67半纤维素酶、GH28半纤维素酶、GH11半纤维素酶、GH10半纤维素酶、GH3半纤维素酶和CE5半纤维素酶。
在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶是β-木糖苷酶或阿拉伯呋喃糖苷酶。在特定的实施方案中，β-木糖苷酶是来自里氏木霉的BXL1，阿拉伯呋喃糖苷酶是来自里氏木霉的ABF1、ABF2或ABF3。在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶是β-木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的组合。
在一些实施方案中，第一种酶组合物是补充了额外量的β-葡糖苷酶的来自丝状真菌的全纤维素酶混合物，第二种酶组合物包含木聚糖酶，且至少一种其它的半纤维素酶是β-木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的组合。
在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶是里氏木霉半纤维素酶，其选自α-阿拉伯呋喃糖苷酶I(ABF1)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶II(ABF2)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶III(ABF3)、α-半乳糖苷酶I(AGL1)、α-半乳糖苷酶II(AGL2)、α-半乳糖苷酶III(AGL3)、乙酰木聚糖酯酶I(AXE1)、乙酰木聚糖酯酶III(AXE3)、内切葡聚糖酶VI(EG6)、内切葡聚糖酶VIII(EG8)、α-葡糖醛酸糖苷酶I(GLR1)、β-甘露聚糖酶(MAN1)、多聚半乳糖醛酸酶(PEC2)、木聚糖酶I(XYN1)、木聚糖酶II(XYN2)、木聚糖酶III(XYN3)，和β-木糖苷酶(BXL1)。
在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶具有与选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17的氨基酸序列至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一种其他的半纤维素酶具有与上述氨基酸序列之一至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，至少一种其他的半纤维素酶具有对应上述氨基酸序列之一的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了用于水解纤维素和半纤维素材料的混合物的方法，包括将纤维素和半纤维素材料的混合物与下列物质接触：
(a)第一种酶组合物，包含纤维素酶；
(b)第二种酶组合物，包含至少一种选自GH10或GH11木聚糖酶的木聚糖酶，和
(c)第三种酶组合物，包含至少一种其它的半纤维素酶，所述半纤维素酶不是GH10或GH11木聚糖酶，或者不是与(b)中相同的GH10或GH11木聚糖酶，
从而水解纤维素和半纤维素材料的混合物，
其中，与在缺少至少一种其它的半纤维素酶的条件下等同的接触相比，上述接触导致至少一种的(i)增加的葡聚糖转化或(ii)增加的木聚糖转化。
在一些实施方案中，第一种酶组合物是来自丝状真菌的全纤维素酶混合物。在一些实施方案中，第一种酶组合物是补充了额外量的β-葡糖苷酶的来自丝状真菌的全纤维素酶混合物。
在一些实施方案中，第二种酶组合物包含来自里氏木霉的木聚糖酶XYN2。在一些实施方案中，第二种酶组合物包含来自里氏木霉的木聚糖酶XYN3。
在一些实施方案中，至少一种木聚糖酶具有与选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一种木聚糖酶具有与选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，至少一种木聚糖酶具有选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的的氨基酸序列。
在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶选自GH54半纤维素酶、GH62半纤维素酶、GH27半纤维素酶、GH36半纤维素酶、GH5半纤维素酶、GH74半纤维素酶、GH67半纤维素酶、GH28半纤维素酶、GH11半纤维素酶、GH10半纤维素酶、GH3半纤维素酶和CE5半纤维素酶。
在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶是β-木糖苷酶或阿拉伯呋喃糖苷酶。在特定的实施方案中，β-木糖苷酶是来自里氏木霉的BXL1，阿拉伯呋喃糖苷酶是来自里氏木霉的ABF1、ABF2或ABF3。在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶是β-木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的组合。
在一些实施方案中，第一种酶组合物是补充了额外量的β-葡糖苷酶的来自丝状真菌的全纤维素酶混合物，第二种酶组合物包含木聚糖酶，且至少一种其它的半纤维素酶是β-木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的组合。
在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶是里氏木霉半纤维素酶，选自α-阿拉伯呋喃糖苷酶I(ABF1)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶II(ABF2)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶III(ABF3)、α-半乳糖苷酶I(AGL1)、α-半乳糖苷酶II(AGL2)、α-半乳糖苷酶III(AGL3)、乙酰木聚糖酯酶I(AXE1)、乙酰木聚糖酯酶III(AXE3)、内切葡聚糖酶VI(EG6)、内切葡聚糖酶VIII(EG8)、α-葡糖醛酸糖苷酶I(GLR1)、β-甘露聚糖酶(MAN1)、多聚半乳糖醛酸酶(PEC2)、木聚糖酶I(XYN1)、木聚糖酶II(XYN2)、木聚糖酶III(XYN3)，和β-木糖苷酶(BXL1)。
在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶具有与选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17的氨基酸序列至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶具有与上述氨基酸序列之一至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或甚至至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶具有对应于上述氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施方案中，纤维素和半纤维素材料的混合物与第一种酶组合物、第二种酶组合物和第三种酶组合物的接触同时进行。
在一些实施方案中，以单一组合物酶混合物提供第一种酶组合物、第二种酶组合物和第三种酶组合物。
根据下列说明，本组合物和方法的这些和其他方面和实施方案是显而易见的。
详细说明
I.定义
除非在本文中另外定义，本文使用的所有的技术和科学术语都具有本领域普通技术人员通常理解的相同含义。本文提供的小标题不是对发明的各个方面的限制，在一处小标题下的实施方案可以作为整体用于组合物和方法。前文的概括描述和后文的详细描述都是示例性的和解释性的，而不是对本文所述组合物和方法的限制。除非另外特定地说明，使用的单数包括了复数，除非另外特定地说明，使用“或”意指“和/或”。术语“包括”、“包括的”、“包含了”、“包含”、“包含的”和“包含了”并非意在限制。本文提及的所有专利和出版物，包括此类专利和出版物中公开的所有氨基酸和核苷酸序列，都通过引用清楚地并入本文中。出于澄清，定义下列术语：
如本文中使用的，术语“纤维素”指由β(1→4)连接的D-葡萄糖单位组成的多糖，具有通式(C6H10O5)n。纤维素是绿色植物、多种类型的藻类和卵菌的初生细胞壁的主要组分。
如本文中使用的，术语“纤维素酶”指能够将纤维素聚合物水解成较短的寡聚物和/或葡萄糖的酶。
如本文中使用的，术语“全纤维素酶组合物/制剂/混合物”或类似说法指天然存在的和非天然存在的组合物，所述组合物包括由生物体(例如丝状真菌)生产的多种纤维素酶。全纤维素酶组合物的一个实例是培养丝状真菌的培养基，其包括分泌的纤维素酶，例如预定比例的一种或多种纤维二糖水解酶，一种或多种内切葡聚糖酶，和一种或多种β-葡糖苷酶。
如本文中使用的，“半纤维素”是植物材料的聚合物组分，含有葡萄糖以外的糖单体，与只含葡萄糖的纤维素不同。除葡萄糖以外，半纤维素可以包括木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖，而木糖是最常见的糖单体。半纤维素含有大量的D-戊糖，偶尔含少量的L-糖。半纤维素中的糖可以通过酯键和糖苷键连接。半纤维素的示例性形式包括但不限于半乳聚糖、甘露聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖等。
如本文中使用的，术语“半纤维素酶”指能够将半纤维素分裂成其组分糖或较短聚合物的一类酶，包括内切作用的水解酶、外切作用的水解酶和各种酯酶。
如本文中使用的，术语“木聚糖酶”指源自微生物(例如，真菌、细菌)或来自植物或动物的蛋白质或多肽的蛋白质或多肽结构域，并具有催化在木聚糖的碳水化合物骨架的一个或多个不同位置切割木聚糖的能力，包括分枝的木聚糖和低聚木糖。注意木聚糖酶是一类半纤维素酶。
如本文中使用的，“生物量底物”是既含纤维素又含半纤维素的材料。
如本文中使用的，“天然存在的”组合物是自然产生的，或由自然界存在的生物产生的组合物。
如本文中使用的，“变体”蛋白质不同于“亲本”蛋白质，其源自少数氨基酸残基，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸残基的取代、缺失或添加。在一些情况下，亲本蛋白质是“野生型”、“天然的”或“天然存在的”多肽。变体蛋白质可以描述为与亲本蛋白质具有一定百分比序列同一性，例如至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，甚至至少99％同一性，其可以使用本领域已知的任何合适的软件程序确定，例如在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人，(编著)1987,Supplement 30,section 7.7.18)中描述的。
优选的程序包括Vector NTI AdvanceTM9.0(Invitrogen Corp.Carlsbad,CA)，GCG Pileup程序，FASTA(Pearson等人，(1988)Proc.Natl,Acad.Sci USA 85:2444–2448)和BLAST(BLAST Manual,Altschul等人，Natl Cent.Biotechnol.Inf.,Natl Lib.Med.(NCIB NLM NIH),Bethesda,Md.，和Altschul等人，(1997)NAR 25:3389–3402)。另一个优选的比对程序是ALIGN Plus(Scientific and Educational Software,PA)，优选使用缺省参数。另一种可使用的序列软件程序是可从Sequence Software Package Version 6.0中获得的TFASTA Data Searching Program(Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)。
II.生物转化酶混合物组合物及其使用方法
纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此是线性的β-(1,4)-D-葡聚糖。相反，半纤维素包括复杂分枝结构的多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，并具有多种取代基。由于半纤维素，特别是阿拉伯木聚糖的复杂分枝和异源组成的结果，植物材料的酶促降解需要一组脱枝和解聚活性的作用。此外，植物材料的降解需要作用于半纤维素的酶，所述半纤维素同时含有五碳糖(戊糖)，例如木糖和阿拉伯糖，和六碳糖(己糖)，例如甘露糖和葡萄糖。
半纤维素酶促水解为其单体需要具有不同功能的若干半纤维素酶的参与。半纤维素酶可分为三类一般类别：攻击多糖内部键的内切作用酶，从多糖链的还原端或非还原端持续作用的外切作用酶，以及附属的酶，水解木质素糖苷键的乙酰酯酶和酯酶，例如香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶。
尽管一些真菌产生完整的纤维素酶系统，包括外切纤维二糖水解酶(或CBH-型纤维素酶)、内切葡聚糖酶(或EG-型纤维素酶)和β-葡糖苷酶(或BG-型纤维素酶)，已知的纤维素酶及其混合物通常对半纤维素具有有限的活性，在水解植物材料中具有有限的价值。本生物转化酶混合组合物和方法是部分基于这样的观察结果，即纤维素酶和半纤维素酶的一些组合显著地提高了植物材料水解的效率，主要通过监测葡聚糖和木聚糖的转化而确定。
用于鉴别增加葡聚糖和/或木聚糖水解的纤维素酶/半纤维素酶组合物的示例性纤维素酶组合物是由丝状真菌(如，里氏木霉)生产的全纤维素酶组合物。组合物包括一些外切纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶，并补充了其它的β-葡糖苷酶来增加葡萄糖的释放。该组合物是可商购的，如ACCELLERASE 1000TM(Danisco A/S,Genencor Division,Palo Alto,CA)。ACCELLERASE 1000TM包括外切纤维二糖水解酶(即，约50％(wt/wt)CBHI(CEL7A)和约14％CBHII(CEL6A))、内切葡聚糖酶(即，约12％EGI(CEL7B)和约10％EGII(CEL5A))，和β-葡糖苷酶(即，约5％BGLI(CEL3A))。还可以存在少量的XYN2(即，少于约1％)。其他未鉴别的组分也以少于约1％的量存在。
可以使用其它的纤维素酶组合物，包括其它的全纤维素酶混合物和由多种分别分离的纤维素酶组合成的纤维素酶混合物。优选的纤维素酶组合物包括各至少一种的外切纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。在一些实施方案中，从生物制备包括多种纤维素酶的完整培养液，所述生物为例如支顶孢(Acremonium)、曲霉(Aspergillus)、裸孢壳(Emericella)、镰孢(Fusarium)、腐质霉(Humicola)、毛霉(Mucor)、毁丝霉(Myceliophthora)、链孢霉(Neurospora)、小柱孢(Scytalidium)、梭孢壳(Thielavia)、Tolypocladium、青霉(Penicillium)或木霉(Trichoderma)，或源自它们的种。
组合物还包括至少一种，在一些情况下至少2、3或更多种半纤维素酶。合适的其它半纤维素酶的实例包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、内切或外切阿拉伯聚糖酶、外切半乳聚糖酶，及其混合物。合适的内切作用的半纤维素酶的实例包括内切阿拉伯聚糖酶、内切阿拉伯半乳聚糖酶、内切葡聚糖酶、内切甘露聚糖酶、内切木聚糖酶和feraxan内切木聚糖酶。合适的外切作用的半纤维素酶的实例包括α-L-阿拉伯糖苷酶、β-L-阿拉伯糖苷酶、α-1,2-L-岩藻糖苷酶、α-D-半乳糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-葡糖醛酸糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、β-D-木糖苷酶、外切葡糖苷酶、外切纤维二糖水解酶、外切甘露二糖水解酶、外切甘露聚糖酶、外切木聚糖酶、木聚糖α-葡糖醛酸糖苷酶，和coniferinβ-葡糖苷酶。合适的酯酶的实例包括乙酰酯酶(乙酰木聚糖酯酶、乙酰半乳聚糖酯酶、乙酰甘露聚糖酯酶和乙酰木聚糖酯酶)和芳基酯酶(香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶)。
优选的，本组合物和方法包括至少一种木聚糖酶，木聚糖酶是特定类型的半纤维素酶，其切割半纤维素的木聚糖主链。优选的，木聚糖酶是内切-1,4-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)。已经鉴别和表征了来自真菌和细菌微生物的多种木聚糖酶(参见例如，美国专利号5,437,992；Coughlin,M.P.见上文；Biely,P.等人，(1993)Proceedings of the second TRICEL symposium on Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases,Espoo 1993；Souminen,P.和Reinikainen,T.(编著)，in Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research 8:125-135)。在里氏木霉中已经鉴别了三种特定的木聚糖酶(XYN1、XYN2和XYN3)(Tenkanen等人，(1992)Enzyme Microb.Technol.14:566；Torronen等人，(1992)Bio/Technology 10:1461；和Xu等人，(1998)Appl.Microbiol.Biotechnol.49:718)。在标题为“Xylanase from Trichoderma reesei(来自里氏木霉的木聚糖酶)”的Saloheimo等人的美国专利号6,555,335和6,768,001中，描述了分离自里氏木霉的第四种木聚糖酶(XYN4)，以及使用该酶的方法，其通过引用全文并入到本文中。
用于本组合物和方法的示例性木聚糖酶是XYN2和XYN3。XYN2和XYN3的合适的变体，以及来自其它生物的合适的相关酶，与XYN2或XYN3(即分别是SEQ ID NO:1和2)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或甚至至少99％的氨基酸序列同一性。
除纤维素酶组合物和木聚糖酶外，组合物和方法可以包括一种或多种其它的半纤维素酶，例如内切作用的半纤维素酶、外切作用的半纤维素酶，和/或酯酶。
合适的内切作用的半纤维素酶包括但不限于甘露聚糖-内切-1,4-β-甘露糖苷酶(E.C.3.2.1.78，也称为β-甘露聚糖酶(mannase)和β-甘露聚糖酶(mannanase))，其催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖中的1,4,-β-D-甘露糖苷键的随机内切水解；α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，其催化含有三个或多个1,4-α-连接的D-葡萄糖单位的多糖中的1,4-α-D-葡萄糖苷键的内切水解；木聚糖α-1,2-葡糖醛酸糖苷酶(E.C.3.2.1.131，也称为α-葡糖醛酸糖苷酶)，其催化硬木木聚糖主链中的a-D-1,2-(4-O-甲基)葡糖醛酸基连接的水解；和内切葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、木质素和谷类的β-D-葡聚糖中的1,4-β-D-葡糖苷键的内切水解。已经鉴别了适合用于组合物和方法的多种亚型的内切葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II、内切葡聚糖酶III、内切葡聚糖酶V和内切葡聚糖酶VI。
合适的外切作用的半纤维素酶包括但不限于α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-半乳糖苷酶和β-木糖苷酶。α-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为a-N-阿拉伯呋喃糖苷酶(E.C.3.2.1.55)，催化末端非还原的α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基水解为α-L-阿拉伯糖苷。可以使用至少三种已知的α-阿拉伯呋喃糖苷酶亚型(即，abf1、abf2和abf3)中的任一种。α-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.22)催化α-D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖和半乳甘露聚糖)中末端非还原的α-D-半乳糖残基水解。可以使用三种已知亚型中的任一种，即，α-半乳糖苷酶I(agl1)、α-半乳糖苷酶II(agl2)和α-半乳糖苷酶III(agl3)。葡糖淀粉酶也称为葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.3)，催化末端1,4-连接的α-D-葡萄糖残基从链的非还原端连续水解，释放β-D-葡萄糖。β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)催化末端非还原的β-D-葡萄糖残基水解释放β-D-葡萄糖。β-木糖苷酶也称为木聚糖1,4-β-木糖苷酶(E.C.3.2.1.37)，催化1,4-β-D-木聚糖水解，从非还原末端依次去除D-木糖残基。包括全纤维素酶混合物，以及木聚糖酶和α-阿拉伯呋喃糖苷酶或者β-木糖苷酶的组合物对葡聚糖和/或木聚糖转化是特别有效的。
合适的酯酶包括但不限于阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶。阿魏酸酯酶也称为阿魏酸盐酯酶(E.C.3.1.1.73)，催化从酯化的糖水解4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酸)基团，所述糖在“天然”底物中通常是阿拉伯糖。已知的微生物阿魏酸酯酶分泌到培养基中。在本组合物和方法中可以使用阿魏酸酯酶的三种已知亚型(fae1、fae2和fae3)的任一种。乙酰木聚糖酯酶I(E.C.3.1.1.72)催化木聚糖和木-寡糖的去乙酰化，也可用于组合物和方法。DeGraaff等人的美国专利号5,426,043和5,681,732描述了从真菌来源克隆和表达乙酰木聚糖酯酶。EP 507369公开了编码分离自黑曲霉的乙酰木聚糖酯酶的DNA序列。Christgau等人的美国专利号5,830,734，名称为“Enzyme with acetyl esterase activity(具有乙酰酯酶活性的酶)”，描述了分离多种酯酶用于食品工业。
在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶选自GH54半纤维素酶、GH62半纤维素酶、GH27半纤维素酶、GH36半纤维素酶、GH5半纤维素酶、GH74半纤维素酶、GH67半纤维素酶、GH28半纤维素酶、GH11半纤维素酶、GH10半纤维素酶、GH3半纤维素酶和CE5半纤维素酶。在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶选自α-阿拉伯呋喃糖苷酶I(ABF1)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶II(ABF2)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶III(ABF3)、α-半乳糖苷酶I(AGL1)、α-半乳糖苷酶II(AGL2)、α-半乳糖苷酶III(AGL3)、乙酰木聚糖酯酶I(AXE1)、乙酰木聚糖酯酶III(AXE3)、内切葡聚糖酶VI(EG6)、内切葡聚糖酶VIII(EG8)、α-葡糖醛酸糖苷酶I(GLR1)、β-甘露聚糖酶(MAN1)、多聚半乳糖醛酸酶(PEC2)、木聚糖酶I(XYN1)、木聚糖酶II(XYN2)、木聚糖酶III(XYN3)，和β-木糖苷酶(BXL1)，其可来自丝状真菌，例如里氏木霉。在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶具有的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17的氨基酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或甚至至少99％的氨基酸序列同一性。
半纤维素酶(包括木聚糖酶)的变体可包括基本不影响功能，或者给酶增加了有利特征的取代、插入或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失不在保守基序中，而是限于保守基序以外的氨基酸序列。示例性取代是保守取代，其保留了相对于亲本氨基酸序列的电荷、疏水性或侧基大小。保守取代的实例提供在下表中：
通过改变编码多肽的核酸的编码序列，可以将天然存在的氨基酸引入到多肽中，而通常通过化学修饰表达的多肽产生非天然存在的氨基酸，这是显而易见的。
在本组合物和方法的生物转化酶混合物中，还可以包括其他的附属的酶，例如漆酶(E.C.1.10.3.2)，其催化芳香化合物的氧化，随后还原氧气为水。
在一些实施方案中，可以从一种或多种丝状真菌的菌株中制备用于本生物转化酶混合物的酶。合适的丝状真菌包括真菌亚门和卵菌亚门的成员，包括但不限于下列属：曲霉属、支顶孢属(Acremonium)、短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauveria)、头孢菌属(Cephalosporium)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛壳菌属(Chaetomium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochiobolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、白腐菌属(Cyathus)、Endothia、毛霉属(mucor)、镰孢属(Fusarium)、粘帚霉属(Gilocladium)、腐质霉属(Humicola)、稻瘟病菌属(Magnaporthe)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、毛霉属(Mucor)、链孢霉属(Neurospora)、Phanerochaete、柄孢壳菌属(Podospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、梨孢霉属(Pyricularia)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophylum)、Stagonospora、踝节菌属(Talaromyces)、木霉属(Trichoderma)、嗜热真菌属(Thermomyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、发癣菌属(Trichophyton)和栓菌属(Trametes)。在一些实施方案中，丝状真菌包括但不限于下列：构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awomari)、棘孢曲霉(A.aculeatus)、A.kawachi，例如，NRRL 3112、ATCC 22342(NRRL 3112)、ATCC 44733、ATCC 14331和菌株UVK 143f；米曲霉，例如ATCC 11490；粗糙链孢霉(N.crassa)；里氏木霉(Trichoderma reesei)，例如RRL 15709、ATCC 13631、56764、56765、56466、56767；和绿色木霉(Trichoderma viride)，例如ATCC 32098和32086。在优选的实现中，丝状真菌是木霉物种。用于本发明的特别优选的品种和菌株是里氏木霉RL-P37。
在特定的实施方案中，单个改造的菌株以理想的比例过表达组分酶，使得不需要额外的纯化或补充。在备选的实施方案中，从两种或多种天然存在的或改造的丝状真菌菌株中获得生物转化酶混合物。通过改变终混合物中酶的相对量，可以实现组分酶的理想比例。甚至当使用两种或多种生产菌株时，通过补充纯化的或部分纯化的酶，也可以实现组分酶的理想比例。
在特定的实施方案中，从以下菌株制备半纤维素酶：棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉。在另一个方面，从以下菌株制备全培养液：杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、Fusarium venenatum或轮状镰孢(Fusarium verticilloides)。在另一个方面，半纤维素酶复合物是从孤独腐质霉(Humicola insolens)、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑根霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、嗜热革节孢菌(Scytalidium thermophilum)或太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)制备的。在其他实施方案中，半纤维素酶是从哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(例如，RL-P37[Sheir-Neiss等人，(1984)Appl.Microbiol.Biotechnology 20:46-53；美国专利号4,797,361；可作为生物纯培养物从Northern Regional Research Laboratory,U.S.Department of Agriculture,Peoria,Ill.,U.S.A.(NRRL 15709)的永久保藏中心获得；ATCC 13631、56764、56466、56767])或绿色木霉(例如，ATCC 32098和32086)制备的。
在一些实施方案中，通过表达编码半纤维素酶的基因来生产组分半纤维素酶。例如，木聚糖酶可以分泌到胞外空间中，例如革兰氏阳性生物，如芽孢杆菌或放线菌；或真核生物，如木霉、曲霉、酵母或毕赤酵母的胞外空间。可以理解，在一些实施方案中，可以在重组微生物中相对于天然水平过表达一种或多种半纤维素酶。可以遗传改造宿主细胞以降低细胞的一种或多种内源蛋白质的表达。在一个实施方案中，细胞可以含有一种或多种被缺失或失活的天然基因，特别是编码分泌蛋白的基因。例如，可以缺失或失活一种或多种蛋白酶-编码基因(例如，天冬氨酰蛋白酶编码基因；参见Berka等人，(1990)Gene 86:153-162和美国专利号6,509,171)，或纤维素酶编码基因。编码半纤维素酶的核酸可以存在于生物的基因组中，或由在生物中复制的质粒携带。当从基因组表达半纤维素酶时，基因和与其相关的调控序列可以通过随机的或同源整合引入基因组中。在一些情况下，例如当需要特别高的表达水平时，可以同时使用随机和同源整合。
用作使用本组合物和方法水解的纤维素和半纤维素来源的生物量底物可以是，例如草本材料、农业残渣、林业残渣、城市固体废弃物、废纸、纸浆和造纸残渣等。生物量底物的常见形式包括但不限于树、灌木和草本植物、小麦、小麦秸秆、甘蔗渣、玉米、玉米皮、玉米种子包括种子的纤维、研磨(包括湿磨和干磨)谷粒如玉米的产物和副产物，以及城市固体废弃物、废纸和家庭废弃物。可以从“原始生物量”(例如树、灌木、草本植物、果实、花、草本农作物、硬木和软木)、“非原始生物量”(例如农业副产物、商业有机废物、建筑业和拆除残骸、城市固体废弃物和家庭废弃物)或原始和非原始生物量的“混合生物量”中获得生物量底物。生物量底物可以包括例如木头、木浆、造纸淤泥、纸浆废液、刨花板、玉米秆、玉米纤维、水稻、纸和纸浆加工废弃物、木本或草本植物、果肉块、蔬菜浆、浮石、酒糟、草、谷壳、甘蔗渣、棉花、黄麻、大麻、亚麻、竹子、剑麻、马尼拉麻、稻草、玉米穗轴、酒糟、叶、小麦秸秆、椰棕、藻类、柳枝稷，及其混合物。
生物量底物可直接使用，或者使用本领域已知的常规方法进行预处理。此类预处理包括化学的、物理的和生物的预处理。例如，物理的预处理技术包括但不限于各类型的研磨、破碎、蒸煮/蒸汽暴露、辐射和水热解。化学的预处理技术包括但不限于稀酸、碱性试剂、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳和pH受控的水热解。生物预处理技术包括但不限于使用溶解木质素的微生物。
生物转化酶混合物，和其中的纤维素酶和半纤维素酶的优化剂量水平根据所使用的生物量底物和预处理技术而改变。操作条件例如pH、温度和反应时间也可以影响乙醇生产的速率。优选地，反应组合物含有0.1-200mg生物转化酶混合物/克生物量，更优选的，1-100mg生物转化酶混合物/克生物量，最优选的，10-50mg生物转化酶混合物/克生物量。示例的量是0.1-50、1-40、20-40、1-30、2-40和10-20mg生物转化酶混合物/克生物量。备选地，可以根据系统中底物的量确定酶量。在此类情况下，反应组合物优选含有0.1-50mg生物转化酶混合物/克总糖类，更优选的，1-30mg生物转化酶混合物/克总糖类，最优选的，10-20mg生物转化酶混合物/克总糖类。备选地，可以根据系统中的纤维素底物的量确定酶量。在此类情况下，反应组合物优选含有0.2-100mg生物转化酶混合物/克总葡聚糖，更优选的，2-60mg生物转化酶混合物/克总葡聚糖，最优选的，20-40mg生物转化酶混合物/克总葡聚糖。相似的，可以通过底物生物量中的半纤维素的量确定所使用的生物转化酶混合物的量。因此，反应组合物优选含有0.2-100mg生物转化酶混合物/克半纤维素，更优选的，2-60mg生物转化酶混合物/克半纤维素，最优选的，20-40mg生物转化酶混合物/克半纤维素。
在一些实施方案中，本组合物的形式是增强了半纤维素酶的全纤维素酶组合物，包含全纤维素酶制剂和至少一种半纤维素酶，其中半纤维素酶的量的范围是总蛋白质的1％至50％，全纤维素酶的量的范围是低于总蛋白质的99％至50％。例如，半纤维素酶可以代表1％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表99％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表2％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表98％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表3％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表97％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表4％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表96％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表5％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表95％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表6％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表94％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表7％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表93％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表8％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表92％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表9％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表91％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表10％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表90％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表11％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表89％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表12％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表88％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表13％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表87％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表14％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表86％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表15％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表85％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表16％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表84％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表17％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表83％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表18％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表82％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表19％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表81％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表20％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表80％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表21％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表79％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表22％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表78％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表23％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表77％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表24％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表76％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表25％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表75％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表26％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表74％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表27％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表73％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表28％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表72％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表29％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表71％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表30％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表70％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表31％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表69％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表32％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表68％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表33％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表67％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表34％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表66％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表35％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表65％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表36％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表64％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表37％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表63％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表38％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表62％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表39％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表61％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表40％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表60％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表41％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表59％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表42％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表58％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表43％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表57％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表44％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表56％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表45％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表55％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表46％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表54％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表47％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表53％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表48％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表52％的总蛋白质；半纤维素酶可以代表49％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表51％的总蛋白质；或者半纤维素酶可以代表50％的总蛋白质，并且全纤维素酶组合物可以代表50％的总蛋白质；
在使用中，生物转化酶混合物组合物可以分别添加到合适的底物材料中，即，作为分离的酶组合物，或作为单一的酶混合物，其中在添加到底物中之前存在所有的纤维素酶和半纤维素酶。当纤维素酶和半纤维素酶是分离的酶组合物时，它们可以依次或同时添加到底物中。当纤维素酶和半纤维素酶存在于单一的混合物中时，它们是同时添加的。
根据下列实施例，可以进一步理解组合物和方法的其它方面和实施方案，但所述实施例不应视为限制。本领域技术人员的显而易见是，可以对材料和方法进行多种修饰而不背离本文的教导。
实施例
使用ACCELLERASE 1000TM(Danisco A/S,Genencor Division,Palo Alto,CA)作为纤维素酶的来源，其是被杀死的细胞材料的全培养液，包括里氏木霉的全纤维素酶混合物，补充了里氏木霉BGLU1β-葡糖苷酶。使用木聚糖酶(Danisco A/S,Genencor Division,Palo Alto,CA)作为XYN2的来源，其是木聚糖酶II，高pI，经配制的产品。
在里氏木霉菌株中分别过表达里氏木霉半纤维素酶，在所述菌株中缺失了编码CBHI、CBHII、EG1和EG2的基因，以避免在所获得的细胞材料中(例如，条件培养基或“培养液”)存在这些纤维素酶。在培养液中，目标半纤维素酶的范围是总蛋白质的<10％至85％。在许多情况下，直接使用培养液；然而，进一步纯化了一些半纤维素酶，以证实观察到的活性不是培养液中存在的其它蛋白质的结果。
表1中提供了特定酶的简称、多肽SEQ ID NOs，和碳水化合物-活性酶(CAZY)家族以及clan命名(若已知)。上述XYN2多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且是家族GH11Clan C酶。下文还显示了未成熟多肽的氨基酸序列。
表1
XYN2(SEQ ID NO：1)
MVSFTSLLAASPPSRASCRPAAEVESVAVEKRQTIQPGTGYNNGYFYSYWNDGHGGVTYTNGPGGQFSVNWSNSGNFVGGKGWQPGTKNKVINFSGSYNPNGNSYLSVYGWSRNPLIEYYIVENFGTYNPSTGATKLGEVTSDGSVYDIYRTQRVNQPSIIGTATFYQYWSVRRNHRSSGSVNTANHFNAWAQQGLTLGTMDYQIVAVEGYFSSGSASITVS
XYN3(SEQ ID NO：2)
MKANVILCLLAPLVAALPTETIHLDPELAALRANLTERTADLWDRQASQSIDQLIKRKGKLYFGTATDRGLLQREKNAAIIQADLGQVTPENSMKWQSLENNQGQLNWGDADYLVNFAQQNGKSIRGHTLIWHSQLPAWVNNINNADTLRQVIRTHVSTVVGRYKGKIRAWDVVNEIFNEDGTLRSSVFSRLLGEEFVSIAFRAARDADPSARLYINDYNLDRANYGKVNGLKTYVSKWISQGVPIDGIGSQSHLSGGGGSGTLGALQQLATVPVTELAITELDIQGAPTTDYTQVVQACLSVSKCVGITVWGISDKDSWRASTNPLLFDANFNPKPAYNSIVGILQ
ABF1(SEQ ID NO：3)
MLSNARIIAAGCIAAGSLVAAGPCDIYSSGGTPCVAAHSTTRALFSAYTGPLYQVKRGSDGATTAISPLSSGVANAAAQDAFCAGTTCLITIIYDQSGRGNHLTQAPPGGFSGPESNGYDNLASAIGAPVTLNGQKAYGVFVSPGTGYRNNAASGTAKGDAAEGMYAVLDGTHYNGACCFDYGNAETNSRDTGNGHMEAIYFGDSTVWGTGSGKGPWIMADLENGLFSGSSPGNNAGDPSISYRFVTAAIKGQPNQWAIRGGNAASGSLSTFYSGARPQVSGYNPMSKEGAIILGIGGDNSNGAQGTFYEGVMTSGYPSDATENSVQANIVAARYAVAPLTSGPALTVGSSISLRATTACCTTRYIAHSGSTVNTQVVSSSSATALKQQASWTVRAGLANNACFSFESRDTSGSYIRHSNFGLVLNANDGSKLFAEDATFCTQAGINGQGSSIRSWSYPTRYFRHYNNTLYIASNGGVHVFDATAAFNDDVSFVVSGGFA
ABF2(SEQ ID NO：4)
MELKALSAVVLSFVTLVAAAPATCTLPSTYRWNSTGALASPKSGWVSLKDFSHVIYNGQHLVWGSTHDTGTIWGSMNFGLFSDWSNMATASQNKMTPGTVAPTVFYFAPKNIWVLAYQWGPTTFSYLTSSNPSSVNGWSSPQPLFSGSISGSSPLDQTVIGDSTNMYLFFAGDDGKIYRASMPIGNFPGSFGSTSTVVLSDERNNLFEAVQVYTVSGQKQYLMIVEAIGANGRYFRSFTATNLGGTWTPQATSESQPFAGKANSGATWTNDISHGDLIRSNPDQTMTIDPCNLQFLYQGRATNSGGDYGLLPYRPGLLTLQR
ABF3(SEQ ID NO：5)
MSPRTDRRRSGLLALGLVAASPLATAGPCDIYASGGTPCVAAHSTTRALYGAYSGPLYQVSRGSDGATTNIATLSAGGVANAAAQDSFCAGTTCLITVIYDQSGRGNHLTQAPPGGAASGPQPNGYDNLASAIGAPVRLNGQKAYGVFIAPFTGYRNNQPNGTATGDQPQGMYAIFDGTHYNTGCCFDYGNAETNSLDTGNGHMEAIYFGTGDGSGRGTGSGSGPWIMADLENGLFSGYDPINNPADPTINFRFVTAVVKGEPGQWAIRGGDATSGTLSTFYSGQRPANGYNPMSKEGAIILGIGGDNSNRAQGTFYEGVMTSGYPSDSTENAVQANLVAAKYVYDTSLMTSGPALSVGSSISLRATTSCCTNRYIAHTGATVNTQVVSSSSSTALKQQASWTVRTGLGNSACFSFESRDSPGSFIRHSNYQLMVNANDNSKLFHEDATFCPQAGLNGQGNSFRSWSYPTRYWRHFNSLGYIAANGGEHDFDTTTLFNDDVSFVVSAGFA
AGL1(SEQ ID NO：6)
MTPHSIDRAARPSVWSGLALLLSTAHAIVMPDGVTGKVPSLGWNSWNAYHCDIDESKFLSAAEVIVSSGLLDAGYNYVNIDDCWSMKDGRVDGHIAVNTTRFPDGIDGLAKKVHDLGLKLGIYSTAGTATCAGYPASLGYEDVDAADFADWGVDYLKYDNCNVPSDWQDEYVACAPDAVQTGPNGTCSTALEPNLAPPGYDWSTSKSAERFNAMRNALAKQSREIVLSLCIWGVADVFSWGNETGISWRMSGDISPEWGSVTHIINMNSFKMNSVGFWGHNDADILEVGNGNLTAAETRTHFALWAAMKSPLLIGTDLAQLSQENIELLKNKHLLAFNQDSVYGQPATPYKWGVNPDWTFNYTNPAEYWAGPSSKGHLVLMMNTLDHTVRKEAKWSEIPGLSAGRYEVRDVWTDKSLGCLSSYKTAVAAHDTAVILVGKKCRNW
AGL2(SEQ ID NO：7)
MLGAPSPRRLADVLAVTAGLVASVRAASPISVSGKSFALNGDNVSYRFHVDDDSKDLIGDHFGGPATEDGVFPPIIGPIQGWVDLIGRQRREFPDLGRGDFRTPAVHIRQAAGYTVSDFQYKSHRVVEGKPALRGLPSTFGDAGDVSTLVVHMYDNYSSVAADLTYSIFPKYDAIVRSVNITNMGKGNITIEKLASLSVDLPYEDFDMLELKGDWAREGKRLRRKVDYGSQGFGSTTGYSSHLHNPFFSLITPTTTESQGEAWGFSLVYTGSFSVEVEKGSQGLTRAAIGVNPYQLSWPLGPGETFSSPEAVAVFSTTGVGGMSRKFHNLYRKHLIKSKFATQMHPVLLNSWEGLGFDYNDTTILHLAQESADLGIKLFVLDDGWFGVKHPRVSDNAGLGDWEANPKRFPQGLPDFISDVTKLKVANSSDHLQFGLWFEPEMVNPNSTLYMEHPDWAIHAGSYPRTLTRNQLVLNVALPEVQDFIIESLSNILSNASISYVKWDNNRGIHEAPYPGLDYAYMLGLYRVFDTLSSKFPNVRWEGCASGGGRFDPGVLQYFPHIWTSDDTDAVERIAIQFGTSLVYPPSAMGAHVSAVPNGQTQRTTSIAFRAHVAMMGGSFGFELTPAEMPEDDKAQIPGIIALAEKVNPIVVKGDMWRLSLPEESNWPAALFISQDGSQAVLFYFQIRANINNAWPVLRLQGLDASAKYKIDGNQTFSGATLMNIGLQYQFNGDYDSKVVFLEKQT
AGL3(SEQ ID NO：8)
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AXE1(SEQ ID NO：9)
MPSVKETLTLLLSQAFLATGSPVDGETVVKRQCPAIHVFGARETTVSQGYGSSATVVNLVIQAHPGTTSEAIVYPACGGQASCGGISYANSVVNGTNAAAAAINNFHNSCPDTQLVLVGYSQGAQIFDNALCGGGDPGEGITNTAVPLTAGAVSAVKAAIFMGDPRNIHGLPYNVGTCTTQGFDARPAGFVCPSASKIKSYCDAADPYCCTGNDPNVHQGYGQEYGQQALAFINSQLSSGGSQPPGGGPTSTSRPTSTRTGSSPGPTQTHWGQCGGQGWTGPTQCESGTTCQVISQWYSQCL
AXE3(SEQ ID NO：10)
MPSIKSTVTFLLSQALLATATPMDLEKRQCPGIHVFGARETTAPPGYGSSATVVNLIINAHPGTTAEAINYPACGGQAQCGGISYANSVVAGINAVVQAVTNFHNRCPSTKLVLVGYSQGGQIMDDALCGGGDPAEGYPNTAVPLPAAAVSAIRAAIFMGDPRYVHGLAYNVGSCQAQGFAPRNVGFVCPSGNKIKSYCDASDPYCCNGNNANTHQGYGQEYGQQALAFVNSLLG
EG6(SEQ ID NO：11)
MKVSRVLALVLGAVIPAHAAFSWKNVKLGGGGGFVPGIIFHPKTKGVAYARTDIGGLYRLNADDSWTAVTDGIADNAGWHNWGIDAVALDPQDDQKVYAAVGMYTNSWDPSNGAIIRSSDRGATWSFTNLPFKVGGNMPGRGAGERLAVDPANSNIIYFGARSGNGLWKSTDGGVTFSKVSSFTATGTYIPDPSDSNGYNSDKQGLMWVTFDSTSSTTGGATSRIFVGTADNITASVYVSTNAGSTWSAVPGQPGKYFPHKAKLQPAEKALYLTYSDGTGPYDGTLGSVWRYDIAGGTWKDITPVSGSDLYFGFGGLGLDLQKPGTLVVASLNSWWPDAQLFRSTDSGTTWSPIWAWASYPTETYYYSISTPKAPWIKNNFIDVTSESPSDGLIKRLGWMIESLEIDPTDSNHWLYGTGMTIFGGHDLTNWDTRHNVSIQSLADGIEEFSVQDLASAPGGSELLAAVGDDNGFTFASRNDLGTSPQTVWATPTWATSTSVDYAGNSVKSVVRVGNTAGTQQVAISSDGGATWSIDYAADTSMNGGTVAYSADGDTILWSTASSGVQRSQFQGSFASVSSLPAGAVIASDKKTNSVFYAGSGSTFYVSKDTGSSFTRGPKLGSAGTIRDIAAHPTTAGTLYVSTDVGIFRSTDSGTTFGQVSTALTNTYQIALGVGSGSNWNLYAFGTGPSGARLYASGDSGASWTDIQGSQGFGSIDSTKVAGSGSTAGQVYVGTNGRGVFYAQGTVGGGTGGTSSSTKQSSSSTSSASSSTTLRSSVVSTTRASTVTSSRTSSAAGPTGSGVAGHYAQCGGIGWTGPTQCVAPYVCQKQNDYYYQCV
EG8(SEQ ID NO：12)
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GLR1(SEQ ID NO：13)
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MAN1(SEQ ID NO：14)
MMMLSKSLLSAATAASALAAVLQPVPRASSFVTISGTQFNIDGKVGYFAGTNCYWCSFLTNHADVDSTFSHISSSGLKVVRVWGFNDVNTQPSPGQIWFQKLSATGSTINTGADGLQTLDYVVQSAEQHNLKLIIPFVNNWSDYGGINAYVNAFGGNATTWYTNTAAQTQYRKYVQAVVSRYANSTAIFAWELGNEPRCNGCSTDVIVQWATSVSQYVKSLDSNHLVTLGDEGLGLSTGDGAYPYTYGEGTDFAKNVQIKSLDFGTFHLYPDSWGTNYTWGNGWIQTHAAACLAAGKPCVFEEYGAQQNPCTNEAPWQTTSLTTRGMGGDMFWQWGDTFANGAQSNSDPYTVWYNSSNWQCLVKNHVDAINGGTTTPPPVSSTTTTSSRTSSTPPPPGGSCSPLYGQCGGSGYTGPTCCAQGTCIYSNYWYSQCLNT
PEC2(SEQ ID NO：15)
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XYN1(SEQ ID NO：16)
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BXL1(SEQ ID NO：17)
MVNNAALLAALSALLPTALAQNNQTYANYSAQGQPDLYPETLATLTLSFPDCEHGPLKNNLVCDSSAGYVERAQALISLFTLEELILNTQNSGPGVPRLGLPNYQVWNEALHGLDRANFATKGGQFEWATSFPMPILTTAALNRTLIHQIADIISTQARAFSNSGRYGLDVYAPNVNGFRSPLWGRGQETPGEDAFFLSSAYTYEYITGIQGGVDPEHLKVAATVKHFAGYDLENWNNQSRLGFDAIITQQDLSEYYTPQFLAAARYAKSRSLMCAYNSVNGVPSCANSFFLQTLLRESWGFPEWGYVSSDCDAVYNVFNPHDYASNQSSAAASSLRAGTDIDCGQTYPWHLNESFVAGEVSRGEIERSVTRLYANLVRLGYFDKKNQYRSLGWKDVVKTDAWNISYEAAVEGIVLLKNDGTLPLSKKVRSIALIGPWANATTQMQGNYYGPAPYLISPLEAAKKAGYHVNFELGTEIAGNSTTGFAKAIAAAKKSDAIIYLGGIDNTIEQEGADRTDIAWPGNQLDLIKQLSEVGKPLVVLQMGGGQVDSSSLKSNKKVNSLVWGGYPGQSGGVALFDILSGKRAPAGRLVTTQYPAEYVHQFPQNDMNLRPDGKSNPGQTYIWYTGKPVY
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在一式三份的混合物中测试表达ABF1、ABF2、ABF3、AGL1、AGL2、AGL3、AXE1、AXE3、EG6、EG8、GLR1、MAN1、PEC2、XYN1、XYN3和BXL1的分泌蛋白质培养液。在96孔微量滴定板的每个孔中，添加150μl AFEX-预处理的玉米秸秆(31.7％葡聚糖、19.1％木聚糖、1.83％半乳聚糖和3.4％的阿拉伯聚糖，基于干重，在pH5，50mM乙酸钠缓冲液中配制成15.6或12％的固体浆液)(所有数据点都是基于一式三份的孔)。一个实验(表9显示)使用稀释的氨水预处理的玉米穗轴(13.84％固体)作为底物。向选定的孔中添加：仅20mg/G纤维素的ACCELLERASE1000TM(CEL)、20mg/G的ACCELLERASE 1000TM+5mg/G木聚糖酶，或者20mg/G的ACCELLERASE 1000TM+5mg/G木聚糖酶+1或5mg/G的各半纤维素酶培养液，所有都为20μl总酶体积。
根据各底物浆液中的总纤维素(15.6％或12％固体)调整酶剂量。密封板，并在50℃振荡下孵育72小时。然后，用100μl的100mM甘氨酸，pH 10终止反应。过滤该混合物，再稀释6x(20μl+100μl蒸馏H20)，在Agilent Chem Station HPLC仪器的HPLC-Aminex HPX-87P柱上分析糖含量。根据纤维二糖和葡萄糖的纤维二糖标准曲线或根据木糖的木糖标准曲线，将HPLC峰面积转换为糖浓度。计算基于起始纤维素含量的百分比转化以包括三种糖聚合物每种的水解H2O。还计算了一式三份的标准差。
表2和3提供了每种酶混合物的葡聚糖和木聚糖的平均转化(±标准差)，如由两份独立执行的程序确定。用两种不同的AFEX底物浆液来实施上述独立的运行，所述底物浆液是15.6％(表2)和12％(表3)的固体，从而包括纤维素不同的总毫克数，虽然作为mg/G纤维素的剂量是相同的。
表2
表3
添加XYN2对增加木聚糖转化是有效的。与含XYN2的纤维素酶相比，具有第三种组分(即，XYN3、AGL2、EG8、BXL1、ABF3或PEC2)的六种酶混合物在葡聚糖和/或木聚糖转化方面表现出进一步的优势。根据上述程序运行一式四份的酶混合物。表4提供了每种酶混合物的葡聚糖和木聚糖的平均转化(±标准差)
表4
在另一个实验中，将ACCELLERASE 1000TM与纯化的XYN2和/或XYN3混合，并测定(表5)。XYN2和XYN3的组合产生更有效的葡聚糖和木聚糖转化。
表5
在其他实例中，如上述，在含有20mg/G ACCELLERASE 1000TM+5mg/GXylanase XYN2的混合物中，测试了XYN4、XYN5、FAE1，和新一批的含～50％目标蛋白质的ABF3(前一批为<10％)。结果显示在表6中。添加XYN4、XYN5或FAE1对增加葡聚糖和木聚糖的转化是有效的。
表6
在另一个实验中，如上述，混合ACCELLERASE 1000TM和纯化的Bxl1和XYN2和/或XYN3，并测定。结果显示在表7中。一些酶组合对增加葡聚糖和/或木聚糖的转化是有效的。
表7
在另一个实例中，ABF1、ABF2和ABF3(具有<10％目标蛋白质的ABF3样品批次)以单个的、成对的和三个一组的组合，添加到20mg/G ACCELLERASE 1000TM+5mg/G纯化的XYN3+5mg/G纯化的BXL1的背景中。结果显示在表8中。一些酶组合对增加葡聚糖和/或木聚糖的转化是有效的。
表8
在另一个实例中，将3.4mg/G木聚糖的纯化ABF1、ABF2和/或ABF3添加到20.7mg/G葡聚糖的ACCELLERASE 1000TM+5.1mg/G木聚糖的每种纯化的XYN3和BXL1中。结果显示在表9中。一些酶组合对增加葡聚糖和/或木聚糖的转化是有效的。
表9