一种解淀粉芽孢杆菌及在非水相中制备琥珀酰芒柄花苷的方法与流程

本发明属于生物催化技术领域，涉及一种制备琥珀酰芒柄花苷的菌株及方法，特别涉及一种解淀粉芽孢杆菌及在非水相中制备琥珀酰芒柄花苷的方法。

背景技术：

黄酮类化合物(flavonoids compounds)是植物次生代谢产物，广泛地存在于自然植物中，以游离态或与糖结合为苷的形式存在，不仅数量种类繁多，而且结构类型复杂多样，表现出多种多样的药理活性，能防治心脑血管系统的疾病和呼吸系统的疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、抗辐射、抗癌、抗肿瘤以及增强免疫能力等药理作用。近年来，黄酮类化合物的研究进入了一个新的层次，随着对其构效关系的深入研究，发现了部分药理作用的作用机制，为其在医药、食品领域的应用提供了理论依据，加快了黄酮类化合物的开发利用。

芒柄花素作为具有代表性的黄酮类化合物之一可以通过调节血管张力，起到调节血压的作用，从而对相关心血管疾病进行有效的预防和治疗。然而芒柄花素的水溶性较低，这在一定程度上限制了芒柄花素的使用。而芒柄花素的糖基化产物——芒柄花苷及衍生物具有较高的水溶性。同时，芒柄花苷是中药黄芪、甘草、红芪、葛根等药材中黄酮类化合物的代表性成分，具有促进皮肤生长、清除氧自由基、抑制脂质过氧化、维持血中NO浓度和保护缺血再灌注损伤、增强免疫等多种药理活性(张蔚,等.药学学报,2014,49(8):1162-1168)。芒柄花苷可以实现有效预防心血管疾病、调节肠道环境等功能。目前，制备芒柄花苷及衍生物主要采用的是化学法合成，成本高，步骤繁琐。因此，如何转化制备成芒柄花苷或其衍生物是本发明的关键所在。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌及在非水相中制备琥珀酰芒柄花苷的方法，应用上述菌株在非水相中通过糖基化及琥珀酰化制备琥珀酰芒柄花苷的方法，通过非水相中的糖基化反应提高芒柄花素的水溶性，通过琥珀酰化制备得到琥珀酰芒柄花苷。作为新化合物，此前未有报道。

为解决本发明的技术问题，本发明的技术方案是：

一种解淀粉芽孢杆菌，保藏名称：解淀粉芽孢杆菌FJ18(Bacillus amyloliquefaciens FJ18)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉大学，保藏日期：2016年5月20日；保藏号为：CCTCC NO：M 2016272。

本发明的另一技术方案是：一种解淀粉芽孢杆菌的用途，在非水相中制备琥珀酰芒柄花 苷中的应用。

本发明的另一技术方案是：一种使用解淀粉芽孢杆菌在非水相中酰化制备琥珀酰芒柄花苷的方法，该方法以芒柄花素和糖基供体为原料，在解淀粉芽孢杆菌FJ18的催化作用下，芒柄花素7位酚羟基发生糖基化反应，形成芒柄花素-7-O-葡萄糖苷；芒柄花素-7-O-葡萄糖苷继而在解淀粉芽孢杆菌FJ18的催化作用下，葡萄糖基5位羟基发生琥珀酰化，形成琥珀酰芒柄花苷。

优选的，包括以下三个步骤：

步骤(1)：将所述的解淀粉芽孢杆菌FJ18，进行常规培养、发酵，发酵液过滤获得湿菌体；

步骤(2)：以芒柄花素和糖基供体为原料，用磷酸缓冲溶液及非水相溶剂配制得到原料溶液；

步骤(3)：将步骤(1)的湿菌体或用载体固定化后的湿菌体加入到步骤(2)的溶液中进行催化反应。

优选的，步骤(2)中所述的磷酸缓冲溶液浓度为100～150mmol/L，pH为8.0。

优选的，步骤(2)中所述的原料溶液，其组分中，芒柄花素的浓度为0.01～0.5g/L，糖基供体的溶液浓度为5～50g/L，非水相溶剂体积百分比为5％～20％。

优选的，所述的非水相溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮中的任意一种。

优选的，所述的非水相溶剂为二甲基亚砜或乙醇。

优选的，所述的糖基供体选自麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、糊精中的任意一种。

优选的，所述的糖基供体为蔗糖或乳糖。

有益效果：

1.本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌FJ18，难溶于水的底物芒柄花素在非水相中可以以相对较高的浓度下与糖供体之间在生物催化剂存在下发生糖基化反应，提高反应的催化效率，解决芒柄花苷类化合物稀缺的问题，改善溶解度，为进一步研究黄酮类化合物的生物活性奠定基础；与化学法合成相比，具有极高的催化位置与立体选择性，成本较低，糖基化产物单一，分离简单，具备一定的工业化前景；

2.相比传统解淀粉芽孢杆菌，在该菌株的非水相催化体系中，可以进一步得到琥珀酰化产物，即本发明首次利用解淀粉芽孢杆菌催化得到琥珀酰芒柄花苷；

3.本发明不仅解决了芒柄花素的水溶性低、使用受限的问题，而且所得催化产物琥珀酰芒柄花苷为新化合物，作为一种新的芒柄花苷衍生物，在心血管疾病等领域具有很高的潜在 研究价值。

附图说明

图1是琥珀酰芒柄花苷的¹H NMR谱图。

图2是琥珀酰芒柄花苷的¹³C NMR谱图。

图3是琥珀酰芒柄花苷的HMBC谱图。

本发明提供的解淀粉芽孢杆菌FJ18已经于2016年5月20日提交中国典型培养物保藏中心(简称为CCTCC，位于中国武汉大学)进行保藏，保藏号为CCTCC NO：M2016272。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

实施例1

非水相中制备琥珀酰芒柄花苷的菌株的筛选与菌种鉴定

菌种分离土样为来自江苏省各地区化学污染严重的土壤和药用植物园的土壤，从所述土样中筛选分离获得耐有机溶剂极端微生物。取约1g土样，加入到盛有20mL筛选培养基的三角瓶中，30℃，180r·min^-1水浴振荡培养24h，再以5％接种量转接3次。将培养菌液适当稀释后，以LB平板培养基稀释涂布，于30℃培养24h，观察菌落形态，然后挑取单菌落在LB平板培养基进行划线分离获得单克隆，对筛选获得的菌株编号并于超低温冻存保藏。

以蔗糖为耐有机溶剂菌的生长碳源，加入20％(v/v)二甲基甲酰为筛选压力，从受化工污染的土样中筛选分离获得耐有机溶剂极端微生物。

LB液体培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0；LB平板培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L。

筛选培养基组成为：芒柄花素0.5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁0.5g/L，蔗糖20g/L，DMSO 10％(v/v)，初始pH 7.0。

将保藏的菌株，从冻存管接种到LB平板培养基，于30℃，培养24h后接种到筛选培养基中(40mL培养液/250mL三角瓶)，于30℃，200rpm条件下培养24h，观察培养基中的荧光变化，并分别取0，12，24h的样品进行HPLC检测。反应后，经HPLC检测，获得4株具有生物转化芒柄花素的耐有机溶剂菌株。其中一株菌株具有糖基化结构修饰芒柄花素及琥珀酰基化结构修饰芒柄花苷的能力，所获琥珀酰基化的芒柄花苷产物单一，优化后此菌株对底物芒柄花素的转化率达94.2％。

该菌株在肉汤培养基中生长24h后，菌落大小直径为1.8mm～2.8mm，生长温度范围为20℃～37℃，最适生长温度为30℃，生长pH范围为7.0～9.0，最适生长pH为8.0。菌体呈 短杆状，染色均匀，具运动性，兼性厌氧，可形成内生芽孢，芽孢囊膨大，呈椭圆形，游离芽孢表面着色弱，革兰氏染色表明此菌株为革兰氏阳性菌。通过16SRNA同源性鉴定及系统发育分析，鉴定此菌株为解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌FJ18。

实施例2

解淀粉芽孢杆菌FJ18的发酵及静息细胞的制备

将解淀粉芽孢杆菌FJ18的发酵接种到种子培养基中：酵母膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，pH7.0，于30℃，200rpm培养12小时。扩大培养基、发酵培养基，其组分和含量均为：蔗糖20g/L，酵母粉15g/L.KH₂PO₄ 1.0g/L，CaCl₂ 0.8g/L。以NaOH调节pH至8.0。种子液按0.5％(v/v)接种到扩大培养基、发酵培养基，于30℃，200rpm培养12小时。10000rpm离心15分钟后收集菌体细胞，以生理盐水洗涤l～2次，得解淀粉芽孢杆菌FJ18的静息细胞。

实施例3

将实施例2中的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体。以二甲基亚砜、芒柄花素、蔗糖、磷酸缓冲配置原料溶液，即反应溶液。反应溶液中有机溶剂二甲基亚砜的比例为20％(v/v)，芒柄花素0.5g/L，磷酸缓冲的摩尔浓度为150mmol/L，磷酸缓冲的pH 8.0，蔗糖浓度为50g/L。将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养24h后，10000rpm离心10分钟得反应溶液上清，HPLC检测分析测得芒柄花素转化率为97.2％。

产物用大孔树脂进行分离，取适量树脂，用乙醇浸泡24h后，除去树脂碎片和杂物。湿法装柱用1L乙醇冲洗，再用蒸馏水洗至无醇味；接行酸碱处理，即先后用体积分数5％的HCl溶液与质量分数2％的NaOH溶液分别以2BV/h流速通过树脂柱，并静止置2～4h后，用蒸馏水洗至pH值中性。为避免DMSO溶解转化产物降低上样吸附率，所以转化液用5倍体积的去离子水(pH4.0，冰醋酸调节)稀释至DMSO<2％后加样。加样量20mg/g湿树脂，加样流速20mL/min。用10倍柱床体积的去离子水(pH4.0，冰醋酸调节)淋洗过量未反应的糖基供体(蔗糖)，直到洗脱液用浓硫酸检测不出糖为止，流速20mL/min。选用甲醇加去离子水作流动相进行洗脱，调整甲醇和去离子水的体积比，在洗脱流速20mL/min时，确定洗脱液中甲醇比例。浓缩干燥：经HPLC检测，合并洗脱液，用旋转蒸发仪对其减压真空浓缩，加热温度40℃。最后将固体置于真空干燥箱中，40℃干燥6h。

解淀粉芽孢杆菌FJ18非水相中制备琥珀酰芒柄花苷的反应化学式见下式：

经核磁共振质谱分析鉴定从NMR图谱上看，获得的结构与预期产物的结构一致。以上结果证实该反应中生成了葡萄糖基化的芒柄花素，即琥珀酰芒柄花苷。琥珀酰芒柄花苷的核磁共振波谱数据为：

¹H-NMR(MeOH-d₆,600MHz)δ：8.39(1H,s，2-H),8.07(1H,d,J＝8.9Hz，5-H),7.52(2H,d,J＝8.6Hz，2'and 6'-H),7.24(1H,d,J＝2.3Hz，8-H),7.15(1H,dd,J＝8.9Hz,2.4Hz,6-H),7.0(2H,d,J＝8.6Hz,3'and 5'-H),5.15(1H,d,J＝7.4Hz，1”-H),4.42(1H,dd,J＝11.0Hz，2.4Hz,6”-H_A),4.04(1H,dd,J＝11.0Hz，7.2Hz,6”-H_B),3.79(3H,s,-OCH₃),2.47-2.57(4H,m,2”'and 3”'-H)。

¹³C NMR(MeOH-d₆,600MHz)δ：174.7(C-4),173.4(C-4”'),172.0(C-1”'),161.2(C-7),159.1(C-4'),157.0(C-9),153.6(C-2),130.1(C-2',6'),127.0(C-5),124.0(C-3),123.4(C-1'),118.6(C-10),115.6(C-6),113.7(C-3',5'),103.5(C-8),99.8(C-1”),76.3(C-3”),74.0(C-5”),73.1(C-2”),69.9(C-4”),63,6(C-6”),55.2(C-OCH₃)28.7(C-2”'),28.7(C-3”')。

实施例4

将实施例2中的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体。以二甲基亚砜、芒柄花素、蔗糖、磷酸缓冲配置原料溶液，即反应溶液。反应溶液中有机溶剂二甲基亚砜的比例为15％(v/v)，芒柄花素1.0g/L，磷酸缓冲的摩尔浓度为125mmol/L，磷酸缓冲的pH 8.0，蔗糖浓度为25g/L。将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养24h后，10000rpm离心10分钟得反应溶液上清，HPLC检测分析测得芒柄花素转化率为95.8％。

产物用大孔树脂进行分离，方法同实施例3；产物检测方法同实施例3。

实施例5

将实施例2中的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体。以二甲基亚砜、芒柄花素、蔗糖、磷酸缓冲配置原料溶液，即反应溶液。反应溶液中有机溶剂二甲基亚砜的比例为5％(v/v)，芒柄花素0.1g/L，磷酸缓冲的摩尔浓度为100mmol/L，磷酸缓冲的pH 8.0，蔗糖浓度为5g/L。将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养36h后，10000rpm离心10分钟得反应溶液上清，HPLC检测分析测得芒柄花素转化率为95.6％。产物用大孔树脂进行分离，方法同实施例3；产物检测方法同实施例3。

实施例6

将实施例2中的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体。以乙醇、芒柄花素、蔗糖、磷酸缓 冲配置原料溶液，即反应溶液。反应溶液中有机溶剂乙醇的比例为15％(v/v)，芒柄花素1.0g/L，磷酸缓冲的摩尔浓度为125mmol/L，磷酸缓冲的pH 8.0，乳糖浓度为30g/L。将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养48h后，10000rpm离心10分钟得反应溶液上清，HPLC检测分析测得芒柄花素转化率为94.2％。产物用大孔树脂进行分离，方法同实施例3；产物检测方法同实施例3。