与猪生产性状相关的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于猪标记辅助选择技术领域，涉及与猪生产性状相关的分子标记及其应用，具体涉及猪ROCK2基因编码序列中的3处SNP标记，这3处标记均可应用到猪的标记辅助选择中。

背景技术：

肉类是人类营养的主要来源，而猪肉在所有肉类消费中所占的比例是最大的。随着社会的发展与人们生活水平的提高，人们对肉类的消费观念已由原来对量的追求转变为对质的追求。过去的几十年里，传统的育种方法在提高猪的生长速度、瘦肉率以及饲料转化率等方面发挥了重要的作用，并取得了显著的成绩。但随着对高生长率与高瘦肉率的强度选择导致了猪肉品质的严重下降，劣质猪肉大量涌现。因此，改良猪肉品质，培育出安全环保优质的新品种猪成为目前猪遗传育种中的重要研究课题。

近年来，随着现代分子和基因组学突飞猛进的发展，分子标记辅助选择越来越受到人们的关注。通过寻找对动物特定性状有较大影响的数量性状位点附近的分子标记，利用这些分子标记可以实现对特定性状的选择。相对传统的育种方法，分子标记辅助选择具有许多明显的优势，它不受年龄、性别等的限制，可以进行早期选种，缩短世代间隔，加快遗传改良的进度，降低选育的成本；对遗传力低、晚期表现、以及活体难于度量的性状(肉质性状)更具有显著的优势。到目前为止，已成功鉴定了多个可用于猪育种的分子标记。其中氟烷基因(也称兰尼定I型受体基因)、酸肉基因、胰岛素生长因子2、黑皮质素受体4以及肌肉生长抑制素已被证实对肌肉的发育以及猪肉的品质有显著影响，已经成功的应用到了猪育种当中。此外，猪的雌激素受体基因、牛的双肌基因与鸡的矮小基因也在育种和生产中得以应用。

肌肉的发育以及猪的肉质性状与胴体性状具有复杂的特性，许多性状只具有中等遗传力，而且这些性状由多基因控制。迄今为止，虽然找到了少数几个影响猪生产性能的主效基因，但还远远不能满足育种工作的需求。因此，找到更多的主效基因或与主效基因紧密连锁的分子标记，并合理的运用到猪肉品质改良中，势必成为育种工作者们迫在眉睫的要事。在所有分子标记中，单核苷酸多态性(SNP)有望成为最重要最有效的分子标记。现阶段能够有效用于猪生产性状相关的分子标记仍有待挖掘。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供与猪生产性状相关的分子标记，该分子标记在猪ROCK2基因的编码序列中。本发明的另一目的在于提供检测所述分子标记的扩增引物以及检测所述分子标记的测序引物。本发明的目的还在于提供所述分子标记在猪标记辅助选择中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

与猪生产性状相关的分子标记，其序列如SEQ ID NO.1所示，长度为145bp，在猪ROCK2基因的编码序列中。所述的分子标记为3处SNP：A27G、C42T和T61C，即SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第27位碱基存在突变，第27位碱基是A或G；或SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第42位碱基存在突变，第42位碱基是C或T；或SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第61位碱基存在突变，第61位碱基是T或C。

检测上述分子标记的扩增引物对的序列如下所示：

上游引物：ACAGGCATGGTGCATTGTG(SEQ ID NO.2)，

下游引物：CCACCAGCATCTCAAAAAGGA(SEQ ID NO.3)。

检测上述分子标记的测序方法优选为焦磷酸测序法。

检测上述分子标记的测序引物的序列如下所示：

测序引物：GGTGCATTGTGATACG(SEQ ID NO.4)。

通过上述分子标记与猪生产性状的关联分析，发现上述3个SNP与猪胴体性状、肉质性状呈显著相关。因此，上述分子标记可用于猪标记辅助选择中。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

(1)本发明发现了3个与猪生产性状相关的分子标记，为猪的分子育种提供了新的分子标记。

(2)本发明所采用的焦磷酸测序法可以同时检测3个突变位点，与PCR-RFLP方法相比更加迅速。

(3)本发明的结果判定由焦磷酸测序仪自动完成，判定方便，节约人工成本。

附图说明

图1是所扩增得到的猪ROCK2基因的部分编码序列，片段大小为145bp，图中下划线标记的分别为上、下游引物序列，图中阴影所标记的为焦磷酸测序引物序列，括号内所显示的是碱基突变。

图2是PCR扩增的ROCK2基因片段的核酸电泳鉴定图，1、2和3泳道为目的片段，M为DL2000。

图3是分子标记A27G、C42T和T61C的焦磷酸测序仪测序峰图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1(制备实施例)

1、猪ROCK2基因部分DNA序列克隆及SNP寻找

(1)引物设计

用人ROCK2基因的mRNA序列为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为90％以上的猪ESTs序列，以其中存在多处突变的一段序列为模板设计一对引物，以猪的基因组DNA为模板扩增图1所示序列(SEQ ID NO.1)，序列大小为145bp。

所设计引物的序列如下：

上游引物：ACAGGCATGGTGCATTGTG，

下游引物：CCACCAGCATCTCAAAAAGGA。

(2)目的片段的克隆和测序

分别以10头大白猪和10头梅山猪的基因组DNA样品作为模板，按照以下体系(25μL)进行PCR反应：2×GC bufferⅠ12.5μL，dNTPs(2mM)2.5μL，Taq(1U/μL)1μL，上游引物(10μM)0.5μL，下游引物(10μM)0.5μL，DNA模板1μL，ddH₂O 7μL。PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸10s，重复35次；72℃延伸10min。PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测(图2)，并在紫外灯照射下割取含有目的片段的胶块，放入1.5mL Ependorff管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(DP1701，购自北京百泰克生物技术有限公司)纯化PCR产物，将纯化的PCR产物与pMD18-T载体(购自TAKARA公司)4℃冰箱过夜连接。取连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆，经菌液PCR鉴定为阳性的菌液送去测序，利用DNAStar中的Seqman对测序结果进行多序列比对，确定SNP。通过测序和比对，确认了所扩增PCR产物长度为145bp，该序列第27位、42位和61位存在突变，第27bp处有1个A27-G27突变，第42bp处有1个C42-T42突变，第61bp处有1个T61-C61突变。

2、焦磷酸测序检测方法的建立

用上游引物与带有生物素标记的下游引物扩增基因组DNA得到145bp特异扩增片段，采用焦磷酸测序的方法对此序列上的3个位点进行检测，测序引物序列为：GGTGCATTGTGATACG。焦磷酸测序(Pyrosequencing)的方法与传统方法相比，更加精准，另外一个突出的优点就是它能同时对多个位点进行分析，本发明中的前两个突变位点间隔14个碱基，而后两个突变位点间隔18个碱基，本发明设计的一对扩增引物所扩增的145bp特异扩增片段同时包含了这3个突变位点。与此同时，本发明另外设计了一条可以同时检测这3个突变位点的测序引物对所扩增的序列进行测序。焦磷酸测序仪(PSQ 96MA)根据峰值自动判别3个突变的基因型，测序结果如图3所示。

实施例2(应用实施例1)：多态性在各猪品种中的分布情况

利用焦磷酸测序的方法同时检测了序列中A27G、C42T和T61C 3个突变位点在4个猪种中的多态性。3个SNP位点在各猪种的基因型与基因频率分布如表1所示。在所检测的31头大白猪、50头长白猪、32头梅山猪和30头清平猪中，对于A27G突变位点，A等位基因的频率分别为0.82、1、0.64和0.85，A等位基因占优势；对于C42T突变位点，C等位基因的频率分别为0.82、1、0.64和0.85，C等位基因占优势；对于T61C突变位点，T等位基因的频率分别为0.95、0.80、0.78和0.63，T等位基因占优势。这3个突变位点的优势等位基因在国外猪种和国内地方猪种间没有差异。

表1 猪ROCK2基因3个突变位点在不同品种猪中基因型和等位基因频率的分布

注：大白猪、长白猪为国外猪种；梅山猪、清平猪为中国地方猪种。

实施例3(应用实施例2)：猪标记―性状关联分析

用焦磷酸测序的方法对前面3个SNP即A27G、C42T和T61C在大白猪、长白猪、梅山猪和清平猪以及2003年、2004年的大白猪×梅山猪F₂代群体中的基因频率、基因型频率进行了检测，并将这3处SNP与胴体性状和肉质性状进行了关联分析。用于关联分析的主要胴体性状包括皮率、骨率、肥肉率、瘦肉率、瘦肥肉比例、胴体重、屠宰率、板油重、花油重、内脂率、至第一颈椎胴体长、至第一肋胸胴体长、6-7腰椎间背膘厚、肩部背膘厚、胸腰椎间背膘厚、臀部背膘厚、平均背膘厚、腿臀比率、眼肌高、眼肌宽、眼肌面积。用于关联分析的主要肉质性状包括背最长肌pH、股二头肌pH、头半棘肌pH、失水率、系水力、背最长肌色值、股二头肌色值、背最长肌大理石纹评分、股二头肌大理石纹评分、肌内脂肪、肌内水分。

采用SAS统计软件(SAS Institute Inc,Version 8.0)glm程序进行单标记方差分析，同时采用reg程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，所采用单标记回归统计模型为：

Y_ijkl＝μ+G_i+F_j+S_k+Y_l+b_ijklX_ijkl+e_ijkl

Y_ijkl为性状表型值；μ为平均值；G_i为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用-1、0和1分别代表AA、AB和BB基因型，显性效应用1、-1和1分别代表AA、AB和BB基因型)；F_j、S_k、Y_l分别为家系、性别和年度效应；b_ijkl为屠宰体重的回归系数，X_ijkl为屠宰体重；e_ijkl为残差效应。

A27G基因型检测结果表明：在所检测的大白×梅山两个F₂代家系中，AA基因型87头，AG基因型157头，GG基因型23头。不同基因型与生产性状的统计结果总结于表2。

C42T基因型检测结果表明：在所检测的大白×梅山两个F₂代家系中，CC基因型86头，CT基因型159头，TT基因型22头。不同基因型与生产性状的统计结果总结于表3。

T61C基因型检测结果表明：在所检测的大白×梅山两个F₂代家系中，CC基因型2头，TC基因型18头，TT基因型247头。不同基因型与生产性状的统计结果总结于表4。

A27G突变位点与胴体性状中皮率和胸腰椎间背膘厚呈显著相关，其中GG型个体的皮率显著高于AA型个体(p<0.05)，而GG型个体的胸腰椎间背膘厚显著低于AA型个体(p<0.05)；与至第一颈椎背膘厚和至第一肋胸背膘厚呈极显著相关，其中GG型个体的至第一肋胸背膘厚显著高于AA型个体(p<0.05)，GG型个体的至第一颈椎背膘厚极显著高于AA型个体(p<0.01)。

C42T突变位点与胴体性状中的至第一颈椎背膘厚呈显著相关，与至第一肋胸背膘厚呈极显著相关，TT型个体的至第一颈椎背膘厚显著高于CC型个体(p<0.05)。

对于T61C突变位点，由于CC型个体只有两个，不符合统计学的要求，我们将其剔除后进行性状关联分析。该位点与胴体性状中的皮率呈显著相关，TT型个体的皮率显著高于TC型个体；该位点与肉质性状中的背最长肌和股二头肌大理石纹评分呈显著相关，与股二头肌pH值呈极显著相关，TC型个体的背最长肌和股二头肌大理石纹评分显著高于TT型个体，而TC型个体的股二头肌pH值则极显著高于TT型个体。

表2 猪ROCK2基因A27G突变位点与猪生产性状的关联分析

注：以上数值为最小二乘均值±标准误；同行含有相同字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)。“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01(下表同)。

表3 猪ROCK2基因C42T突变位点与猪生产性状的关联分析

表4 猪ROCK2基因T61C突变位点与胴体性状的关联分析

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉生物工程学院

<120> 与猪生产性状相关的分子标记及其应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 145

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 1

acaggcatgg tgcattgtga tacggcagtt ggaacacctg actatatatc acctgaggtt 60

ttgaaatcac aagggggtga tggttactat gggcgagaat gagattggtg gtctgtgggt 120

gttttccttt ttgagatgct ggtgg 145

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游引物

<400> 2

acaggcatgg tgcattgtg 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物

<400> 3

ccaccagcat ctcaaaaagg a 21

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 测序引物

<400> 4

ggtgcattgt gatacg 16