人脐带源间充质干细胞诱导分化成软骨细胞的方法与流程

文档序号:11145009阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种人脐带源间充质干细胞诱导分化成软骨细胞的方法,其特征在于将脐带组织清洗去除血迹后剪成小段,剖开脐带小段剔除血管组织,将脐带小段剪碎并消化得到单个间充质干细胞,将获得的间充质干细胞扩增培养至第七代制得单细胞悬液,接种于含软骨分化诱导剂的无血清培养基中继续培养,每隔3天半量更换新鲜培养基,诱导14天后,即可得到软骨细胞。

2.根据权利要求1所述方法,其特征在于所述制得单细胞悬液是先进行(1)脐带组织的预处理、后用(2)酶消化法从脐带中获取原代的MSCs细胞,再将(3)脐带来源MSCs细胞的扩增培养制得单细胞悬液;

所述(1)脐带组织的预处理是剪取健康足月剖宫产的新生儿脐带靠近婴儿端脐带长约20cm左右,先置于含双抗的生理盐水中浸泡,后在无菌条件下,将脐带组织置于皿中,以含双抗的DPBS反复冲洗,直至无明显血块;先将脐带剪成小段,后纵向剖开,再剔除动静脉;以含双抗的DPBS将组织块漂洗干净,并将其剪碎至组织小块;

所述(2)酶消化法从脐带中获取原代的MSCs细胞是将剪碎的组织块收集至离心管内,加入胰蛋白酶,37℃水浴摇床上消化,弃去消化液,用DPBS将组织块反复冲洗多次,并移至另一新离心管内,加胶原酶I消化液,置于水浴摇床上消化,并确保组织块与消化液充分接触;将消化液以细胞筛网过滤后收集滤液,加入多倍滤液体积的完全培养基终止消化,离心、吸弃上清液,即得到一次原代MSCs细胞沉淀;剩余组织块加胶原酶I重复上述步骤继续消化,收集得到二次原代MSCs细胞沉淀;将两次消化获取的细胞沉淀重悬于无血清培养基,于37℃,5%CO2的培养箱内静置培养;待次日细胞贴壁后,更换新鲜的培养基,以后每3天更换一次培养液,观察细胞的生长状态;

所述(3)脐带来源MSCs细胞的扩增培养是待原代培养的细胞达到80%以上汇合时,吸弃培养液,加入Tryple消化,以无血清培养基终止消化,离心,将细胞沉淀重悬于无血清培养基中;借助台盼蓝计数法,将5x105/瓶活细胞接种于新的培养瓶中,置于培养箱中37℃,5%CO2培养中继续培养并观察细胞生长情况,待细胞扩增后得单细胞悬液。

3.根据权利要求2所述方法,其特征在于(1)步骤中:含双抗的生理盐水是含1%双抗的生理盐水,将脐带组织置于皿中是将脐带组织置于10cm培养皿中,双抗的DPBS是1%双抗的DPBS,将脐带剪成小段是将脐带剪成2-3cm长的小段,剪碎至组织小块是用眼科剪将其剪碎至1-2mm3的组织小块;

(2)步骤中:所述离心管为50ml的离心管,加入胰蛋白酶是加入0.25%胰蛋白酶,37℃水浴摇床上消化是37℃水浴摇床上消化10分钟,用DPBS将组织块反复冲洗多次是用DPBS将组织块反复冲洗三次,加胶原酶I消化液是加0.1%胶原酶I消化液,置于水浴摇床上消化是置于37℃水浴摇床上消化1小时,摇床转速为100转/分钟;加入多倍滤液体积的完全培养基终止消化,离心是加入3倍滤液体积的完全培养基终止消化,1000转/分钟,离心5分钟;剩余组织块加胶原酶I重复上述步骤继续消化是剩余组织块加0.1%胶原酶I重复上述步骤继续消化1小时;

(3)加入Tryple消化是加入Tryple消化2-3min,离心是1000rpm离心5min,培养瓶是T-75。

4.根据权利要求1所述方法,其特征在于在制得单细胞悬液后,先进行(1)MSCs细胞的形态学鉴定和(2)MSCs细胞表面标志物表达的鉴定,鉴定合格后才进行接种;

所述(1)MSCs细胞的形态学鉴定是倒置显微镜下观察,在无血清培养基条件下贴壁生长的细胞呈梭形或分支状生长,接种后第4天即大量汇合,以平行排列状或漩涡状生长,细胞在增殖传代过程中形态无明显改变,即为形态学鉴定合格;

所述(2)MSCs细胞表面标志物表达的鉴定是取扩增培养至第七代的MSCs单细胞悬液,去掉培养液,加入Tryple消化细胞,以无血清培养基终止消化后,加DPBS洗涤细胞,并制成1ml共含有1×107个MSCs的单细胞悬液,等分为10份,分别加入10个Eppendorf管中,按照人类间充质干细胞分析试剂盒说明加入对应的抗体,室温避光孵育30min,用DPBS清洗两次,去除未标记的抗体,流式细胞仪进行检测;如果结果是获取的MSCs均表现为CD44、CD73、CD90、和CD105阳性比率均高于95%的强阳性,阳性比率低于2%的不表达CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR,即为MSCs细胞表面标志物表达检测合格。

5.根据权利要求1-4任一所述方法,其特征在于制得单细胞悬液加入Tryple消化细胞,以无血清培养基终止消化,将得到的细胞沉淀以无血清培养基调整至1x107个/ml,之后接种于96孔板中,次日待细胞贴壁后,更换为100μl成软骨分化培养基,每3天以半换液的形式补充成软骨分化培养基,诱导约14天后,得到细胞球。

6.根据权利要求5所述方法,其特征在于之后接种于96孔板中是之后以5μl/孔接种于96孔板中。

7.根据权利要求5所述方法,其特征在于其中成软骨分化培养基组成为:DMEM高糖培养液,5%血清替代物,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素,10ng/ml的TGF-β1,转铁蛋白5μg/ml,抗坏血酸50μg/ml,地塞米松10-7mol/L,丙酮酸钠6.25μg/ml。

8.根据权利要求1-4任一所述方法,其特征在于得到软骨细胞后进行MSCs细胞成软骨分化能力的检测,判断到的细胞是否为软骨细胞。

9.根据权利要求8所述方法,其特征在于MSCs细胞成软骨分化能力的检测是对在分化培养基内诱导培养14天的细胞球,用4%多聚甲醛室温固定15min后执行阿利新蓝染色鉴定,检测得到的细胞是否为软骨细胞。

10.根据权利要求9所述方法,其特征在于阿利新蓝染色鉴定是吸去多聚甲醛,用PBS漂洗2次后,加入pH2.5的阿利新蓝染液染色30min,蒸馏水冲洗2min,在倒置相差显微镜下观察染色情况,如果显微镜下可见有细胞小球生成,且被阿利新蓝染液染为蓝色,即为细胞胞浆内硫酸化糖胺多糖表达阳性,表现出了软骨细胞的生物学特性。

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