一种禽类肠道凝结芽孢杆菌定量检测试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及一种禽类肠道凝结芽孢杆菌定量检测试剂盒及检测方法，属于微生物检测技术领域。

背景技术：

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)为革兰氏阳性菌，属厚壁菌门，营养细胞呈杆状，两端钝圆，在培养基中呈单个或成对出现，少数呈短链状。菌落形态为不透明白色，呈圆形，表面突出。凝结芽孢杆菌的最适生长温度为37～45℃，最适pH为6.6～7.0。该菌可以产生芽孢，对环境有很强的抗性，其芽孢经90℃处理10min或100℃处理5min不会失活。在室温干燥情况下，固体芽孢可保存3～5年不失活。

凝结芽孢杆菌比其他种类的肠道益生菌更能耐受胃酸和消化酶的作用。在胃中芽孢吸收水分而膨胀，代谢加快，进入十二指肠既能萌发为营养细胞并生长繁殖，定居于肠道各段。凝结芽孢杆菌在肠道内大量生长繁殖，一方面消耗肠道中的游离氧，产生有利于肠道益生菌生长的厌氧环境，另一方面产生大量的代谢产物，如L(+)-乳酸、凝固素、Lactosporin、α-淀粉酶、脂肪酶及蛋白酶等，这些物质均为生物活性成分，能有效抑制肠道内有害菌生长繁殖，发挥其益生菌功效。

目前，凝结芽孢杆菌作为微生态制剂的有效菌种在家禽生产上已得到广泛应用。但是该菌种在家禽肠道内的计数却十分困难。众所周知，肠道微生物与寄主之间是一种互利共生关系，不同畜禽品种其肠道微生物的种类和数量存在明显差异，如何实现肠道内凝结芽孢杆菌的定量检测是一项亟待解决的难题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种禽类肠道凝结芽孢杆菌定量检测试剂盒。

同时，本发明还提供一种禽类肠道凝结芽孢杆菌定量检测的方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

禽类肠道凝结芽孢杆菌定量检测试剂盒，包括以下引物：

BaciS：5'-GGCAACCTGCCTGTAAGA-3'；

BaciAS：5'-TGTAAGTGRCAGCCGAAGC-3'，R指代碱基A或G。

具体的，禽类肠道凝结芽孢杆菌定量检测试剂盒还包括2×SYBR qPCR mix、Baci标准浓度质粒DNA、ddH₂O、DNA Marker和使用说明书等。

更具体的，禽类肠道凝结芽孢杆菌定量检测试剂盒的组成为：2×SYBR qPCR mix500μL，10μmol/L BaciS 50μL，10μmol/L BaciAS 50μL，系列浓度(10¹～10⁸分子/μL)Baci质粒DNA各10μL，ddH₂O 1mL。

禽类肠道凝结芽孢杆菌定量检测的方法，包括以下步骤：

1)以待检测样品总基因组DNA为模板，用引物BaciS、BaciAS进行荧光实时定量PCR扩增；

2)扩增反应完毕，测定溶液的Cq值，并代入标准曲线，得到样品中凝结芽孢杆菌的浓度。

步骤1)中扩增的反应体系为：2×SYBR qPCR mix 10.0μL，10μmol/L BaciS 0.7μL，10μmol/L BaciAS 0.7μL，待检测样品总基因组DNA 1.0～2.0μL，ddH₂O 6.6～7.6μL，共计20.0μL。

步骤1)中扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性15s；60℃退火20s；72℃延伸20s，采集荧光信号；最后72℃延伸5min。

步骤2)中扩增所得片段的核苷酸序列见SEQ ID NO:1。

步骤2)中标准曲线的制作步骤为：以Baci标准浓度质粒DNA为模板，分别用引物BaciS、BaciAS进行荧光实时定量PCR扩增；扩增完毕，测定各溶液的Cq值，建立Cq值与对应浓度的对数值之间的标准曲线。进一步作回归分析，得到线性回归方程。

所述扩增的反应体系为：2×SYBR qPCR mix 10.0μL，10μmol/L BaciS 0.7μL，10μmol/LBaciAS 0.7μL，Baci标准浓度质粒DNA(浓度10¹～10⁸分子/μL)1.0～2.0μL，ddH₂O 6.6～7.6μL，共计20.0μL。扩增的反应程序同上。

本发明的有益效果：

荧光实时定量PCR能够快速、准确定量样品中的核酸浓度，因此可用于肠道微生物的分类和定量研究。本发明以凝结芽孢杆菌基因组18S rDNA中保守序列为目标检测片段，采用生物信息学方法设计合成覆盖目标片段的特异性引物序列，结合荧光实时定量核酸扩增技术，定量分析禽类肠道内凝结芽孢杆菌。与其他肠道微生物计数方法相比，该方法具有操作简便、快速高效、特异性强、准确度高、经济实用等优点，适于高通量检测分析。

本发明中用于定量分析禽类肠道内凝胶芽孢杆菌的试剂盒包含2×SYBR qPCR mix、Baci标准浓度质粒DNA、引物对BaciS/BaciAS等组分，其中引物对BaciS/BaciAS根据禽类肠道微生物宏基因组特点设计，能够特异性地扩增禽类肠道中凝结芽孢杆菌基因组18SrDNA的保守序列，而不会扩增禽类肠道中其他种类微生物的同源基因序列，具有较高的特异性和准确性。使用时，先按照说明书配制qPCR反应体系，设定反应程序，进行荧光实时定量PCR扩增，扩增反应完毕，测定溶液的Cq值，并代入标准曲线回归方法，计算得到待测样品中凝结芽孢杆菌的浓度。

附图说明

图1为本发明中qPCR的反应程序；

图2为实施例2中qPCR的扩增曲线；

图3为实施例2中qPCR的溶解曲线；

图4为实施例2中qPCR的标准曲线及线性回归方程。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

禽类肠道凝结芽孢杆菌定量检测试剂盒的组成为：2×SYBR qPCR mix(购自北京索莱宝科技有限公司)500μL，10μmol/L BaciS 50μL，10μmol/L BaciAS 50μL，系列浓度(10¹～10⁸分子/μL)Baci质粒DNA各10μL，ddH₂O 1mL，DNA Marker和试剂盒使用说明书一份。其中，引物BaciS、BaciAS的核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。

实施例2

禽类肠道凝结芽孢杆菌定量检测的方法，包括以下步骤：

1)制作标准曲线

以Baci标准浓度质粒DNA为模板(浓度见下表1)，配制qPCR反应体系(组成见下表2)，分别用引物BaciS、BaciAS(如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示)进行荧光实时定量PCR扩增。反应程序如图1所示，即94℃预变性3min；94℃变性15s；60℃退火20s；72℃延伸20s，采集荧光信号；最后72℃延伸5min。

表1 Baci标准浓度质粒DNA的浓度

表2 qPCR反应体系

扩增反应完毕，得到qPCR扩增曲线(见图2)，同时添加融解曲线(见图3)。由图2可知，Baci标准浓度质粒DNA的稀释倍数合适；由图3可知，qPCR产物单一，可排除非特异性扩增和异常扩增。

建立Baci标准浓度质粒DNA的Cq值(X)与对应浓度的对数值(Y)之间的标准曲线(见图4)，作回归分析，得到线性回归方程：Y＝-0.3687X+13.418，R²＝0.9572。因为Baci标准浓度质粒DNA是以10为倍数稀释的，所以后面需要计算10^Y确定凝结芽孢杆菌的浓度。

2)提取待检测样品中肠道微生物总基因组DNA，并以此为模板用引物BaciS、BaciAS进行荧光实时定量PCR扩增；扩增的反应体系为：2×SYBR qPCR mix 10.0μL，10μmol/LBaciS 0.7μL，10μmol/L BaciAS 0.7μL，肠道微生物总基因组DNA 1.6μL，ddH₂O 7.0μL，共计20.0μL；反应程序同上。

3)扩增反应结束，测定溶液的Cq值为29.87，代入线性回归方程，得到Y＝2.4049，则每微升样品基因组DNA中的凝结芽孢杆菌数量为10^2.4049≈254个。