一种促进人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法及应用与流程

本发明属于干细胞生物技术与骨组织工程技术领域，特别涉及到一种促进人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法及应用。

背景技术：

运动创伤、退行性病变、感染、肿瘤切除等原因所致关节软骨损伤，是骨科疾病中常见病、多发病，并成为影响人类健康的重要疾病。由于关节软骨没有血供，且软骨细胞包埋于稠厚的胞外基质中，难以迁移到受损部位参与修复。 然而，传统治疗方法，疗效极其有限。关节软骨缺损一直是骨科临床疾病治疗难点和研究的重要课题。目前，治疗软骨损伤的手段主要包括自体或异体软骨组织块移植、自体软骨细胞移植、植入生物支架等。这些治疗方法虽然对软骨损伤修复有一定作用，但存在供体来源有限、移植物与健康软骨难以弥合，易引起关节纤维化并发症，修复效果不佳等问题。软骨组织工程为解决这一难题提供了新思路。利用组织工程手段构建组织工程软骨用于治疗软骨损伤可以大大减少以上诸多弊端，为解决这一难题带来新的希望。然而，软骨组织工程亟待解决种子细胞、生长调节因子和支架材料等三大瓶颈问题。

种子细胞是构建组织工程的第一要素，是开展组织工程研究的前提与基础。大量的研究表明，由于人羊膜间充质干细胞具有比骨髓间充质干细胞更强的扩增能力、分化能力、低免疫原性、无致瘤风险和伦理学限制等优势，被认为是再生医学的理想种子细胞，亦是软骨组织工程的理想的种子细胞来源(肖建辉. 人羊膜干细胞：再生医学的理想种子细胞资源. 遵义医学院学报 2015, 38: 439-449)。本实验室的前期研究提示，采用现有骨髓间充质干细胞的成软骨分化生长调节诱导因子，人羊膜间充质干细胞显示了的成软骨细胞分化的能力。但是，类似其它间充质干细胞成软骨分化报道结果，现有诱导分化体系，需要特殊的、价格昂贵的生长调节因子，如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β(TGF-β)、骨形态发生蛋白(BMP)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、肝细胞生长因子(HGF)和血小板源生长因子(PDGF)等，而这些生长调节因子是体内生物大分子，不仅介入到体内纵横交错的生理过程，而且呈极其复杂的多重调控功能。这也是当前干细胞诱导成软骨分化效率低主要原因。近年来，也有报道毒蛇神经生长因子、褪黑素等可诱导干细胞成软骨分化（郑立, 雷丹青, 陆真慧, 等. 眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法. 申请号201410373621.4；龚逸鸿, 何帆, 刘小珍, 等.褪黑素在制备促进间充质干细胞成软骨分化药物中的应用.申请号201310383987.5），不过，同样也存在诱导干细胞成软骨分化效率低等问题。而且，作为外源性因子，存在被人类免疫系统识别和攻击的风险。因此，亟待寻找更高效、安全、经济的生长调节因子或诱导分化体系，促进软骨组织工程技术的发展，服务广大患者。

透明质酸是人体细胞外基质主要结构成分。而细胞外基质决定细胞的形状、影响细胞的活力、迁移、增殖分化，并参与信号传递，透明质酸在其中扮演了重要角色，并在机体正常和病理状态下发挥多重生物学功能。透明质酸是一种由D-葡萄糖醛酸、N -乙酰氨基-D -葡萄糖，以-1,3糖苷键和-1,4糖苷键交接形成的非蛋白类直链高分子酸性粘多糖，透明质酸的生物学功能与其自身分子量大小、剂量、细胞密度等有密切的关系。譬如，Kumta研究组报告了60kDa，900 kDa和2100kDa分子量的透明质酸对幼鼠颅盖间充质细胞的增殖分化作用。结果提示，低分子量的HA能促进细胞增殖，并呈剂量依赖增强成骨细胞分化特异标志骨钙素基因mRNA的表达，但对碱性磷酸酶、骨形成等指标无明显变化，而其它两个分子量的HA均能明显促进骨祖细胞增殖和诱导分化成骨细胞，Kimata等观察HA调节对数生长期鼠表皮成纤维细胞增殖情况，发现存在正、负效应调节现象，而这完全取决于加入一定剂量范围HA时的细胞密度，相对高密度培养加药后呈剂量依赖促进增殖趋势，反之抑制增殖。因此，研究人员首次以人羊膜间充质干细胞为种子细胞，筛选特定分子量透明质酸为主要因子的诱导组合物，并建立相应诱导分化体系，高效促进人羊膜间充质干细胞向成软骨细胞分化，为构建组织工程软骨用于治疗软骨损伤奠定基础。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种安全、高效、经济的促进人羊膜间充质干细胞向成软骨细胞分化的方法。

一种促进人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，其具体步骤为：

（1）人羊膜间充质干细胞的分离培养：健康足月剖宫产新鲜胎盘钝性机械剥离羊膜，用含1%双抗的D-Hank’s液反复冲洗羊膜，除去残留血渍和表面粘液后；将羊膜剪成1～3 cm²大小，分装于50mL离心管内，加入约羊膜组织2倍体积的含0.02% EDTA-2Na 的0.05% 胰蛋白酶消化液，于35～37℃恒温水浴箱中，150～185rpm旋转消化约30 min，经300目不锈钢滤网过滤后，弃去含有羊膜上皮细胞的消化液，重新加入新鲜的含0.02% EDTA-2Na 的0.05% 胰蛋白酶消化液，重复消化一次，再次经300目不锈钢滤网过滤后，弃去消化液；经上述胰蛋白酶消化后剩余的羊膜组织用含1% 双抗的D-Hank’s液清洗一次，除去残留的胰蛋白酶消化液，加入含0.05 mg/mL DNase I的 0.5 mg/mL II型胶原酶消化液，于35～37℃恒温水浴箱中，150～185 rpm旋转消化1～2 h，直至剩余的羊膜组织碎片完全消化成絮状，经300目不锈钢网过滤，收集细胞滤液，1500rpm，4℃离心10 min，弃上清，细胞沉淀即为人羊膜间充质干细胞；用含10%胎牛血清的低糖DMEM重悬细胞，种于T25细胞培养瓶，在35～37℃，含1～10%CO₂及85～100%空气饱和湿度恒温培养，待细胞融合度达80%以上进行传代培养；

（2）诱导人羊膜间充质干细胞向成软骨细胞分化诱导组合物的制备：在1L高糖DMEM完全培养基中，加入含0.01～2 g/L和0～100mg/L抗坏血酸的诱导组合物，即得人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导组合物；

（3）诱导组合物促人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法：取2代对数生长期人羊膜间充质干细胞，按2×10⁵ cells/孔的细胞量，接种于6孔板内，0～48时间后添加诱导组合物，每2～3天换一次应用基质和诱导组合物，35～37℃，含1～10% CO₂及85～100%空气饱和湿度恒温培养箱内培养14～28天，诱导分化终止。

用于诱导分化的人羊膜间充质干细胞为2～5代。

用于诱导分化的人羊膜间充质干细胞初始种子密度，按5×10⁵ ～5×10⁶个/瓶的细胞接种密度种于25cm²培养瓶。

诱导组合物中透明质酸的分子量为20～2200KD。

本发明所述方案调控人羊膜间充质干细胞向成软骨细胞分化，可作为软骨损伤细胞移植和软骨组织工程种子细胞的用途。

本发明所述方案调控人羊膜间充质干细胞向成软骨细胞分化，可作为种子细胞替代成软骨细胞，避免体外获取软骨细胞难和软骨细胞移植后高免疫原性问题。

本发明所述诱导组合物可制备治疗软骨损伤药物，联合人羊膜间充质干细胞移植治疗相关软骨损伤疾病。

附图说明

图1为人羊膜间充质干细胞诱导分化28天后的形态特征图（×100），（a）对照组，（b）阳性对照组，（c）加诱导组合物的药物组；

图2为甲苯胺蓝染色检测人羊膜间充质干细胞诱导分化28天后糖胺聚糖分泌情况（×200），（a）对照组，（b）阳性对照组，（c）加诱导组合物的药物组；

图3为人羊膜间充质干细胞诱导分化28天后成软骨相关基因的表达情况；

图4为人羊膜间充质干细胞诱导分化28天后干性基因的表达情况；

图5为人羊膜间充质干细胞诱导分化28天后的成骨相关蛋白的表达情况。

具体实施方式

本发明通过如下实施例和附图作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：促进人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化效率的方法及应用

1、人羊膜间充质干细胞的分离培养

健康足月剖宫产新鲜胎盘钝性机械剥离羊膜，用含1%双抗的D-Hank’s液（终浓度为青霉素：100 IU/mL，链霉素:100 IU/mL，临用前新鲜配制）反复冲洗羊膜，除去残留血渍和表面粘液后。将羊膜剪成1～3 cm²大小，分装于50mL离心管内，加入约羊膜组织2倍体积的含0.02% EDTA-2Na 的0.05% 胰蛋白酶消化液，于35～37℃恒温水浴箱中，150～185rpm旋转消化约30 min，经300目不锈钢滤网过滤后，弃去含有羊膜上皮细胞的消化液，重新加入新鲜的含0.02% EDTA-2Na 的0.05% 胰蛋白酶消化液，重复消化一次，再次经300目不锈钢滤网过滤后，弃去消化液。经上述胰蛋白酶消化后剩余的羊膜组织用含1% 双抗的D-Hank’s液清洗一次，除去残留的胰蛋白酶消化液，加入含0.05 mg/mL DNase I的 0.5 mg/mL II型胶原酶消化液，于35～37℃恒温水浴箱中，150～185rpm旋转消化1～2 h，直至剩余的羊膜组织碎片完全消化成絮状，经300目不锈钢网过滤，收集细胞滤液（即消化液），1500 rpm，4℃离心10 min，弃上清，细胞沉淀即为人羊膜间充质干细胞。用含10%胎牛血清的低糖DMEM重悬细胞，种于T25细胞培养瓶，在35～37 ℃，含1～10% CO₂及85～100%空气饱和湿度恒温培养，待细胞融合度达80%以上进行传代培养，第2～5代用于以下实验。

2、诱导人羊膜间充质干细胞向成软骨细胞分化诱导组合物的制备

在1L高糖DMEM完全培养基中，加入含0.01～2 g/L、 20～2200KD透明质酸和0～100mg/L抗坏血酸的诱导组合物，即获得提高人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化效率的诱导组合物。

3、诱导组合物促人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化的应用

取2代对数生长期人羊膜间充质干细胞，按2×10⁵ cells/孔的细胞量，接种于6孔板内，0～48小时后加入诱导组合物，每2天换一次应用基质和诱导组合物。连续培养7～28天。

细胞水平分析实验：光学显微镜下观察细胞形态变化；反映成软骨细胞分化水平指标包括糖胺聚糖分泌和II型胶原蛋白表达。采用甲苯胺兰染色测定糖胺聚糖，采用免疫细胞化学法测定II型胶原蛋白表达。

在培养到28天时，与对照组相比，阳性对照组（阳性组）及加诱导组合物的药物组（药物组）诱导的细胞均由长梭形变成铺路石状，而对照组多数细胞仍呈长梭形（图1）；在培养到28天时，甲苯胺兰染色，与对照组相比，阳性组和实验组均有呈深蓝紫色的阳性细胞，而且药物组阳性细胞颜色比阳性组深（图2），提示诱导组合物有较强的成软骨能力。

基因表达检测结果：采用RT-qPCR法定量测定了Col2α1、ACAN 和Sox9等成软骨细胞相关基因的表达情况，用β -actin作为内参。在培养到28天时，与对照组相比，阳性对照组和药物组中成软骨相关基因表达明显上调，提示诱导组合物有较强的成软骨能力。而药物组又明显高于阳性组（图3）。而且，药物组的干性基因 Nanog、Oct4基因的表达水平也明显增强（图4）。因此，诱导组合物有利于维持人羊膜间充质干细胞的分化能力。

蛋白表达检测结果：采用Western blotting法检测了Col2α1、ACAN 和Sox9等成软骨细胞相关蛋白的表达情况，以β -actin作为内参。在培养到28天时，与对照组相比，阳性对照组和药物组中成软骨相关蛋白表达明显上调（图5），提示其已向软骨细胞分化。

实施例2. 促进人羊膜间充质干细胞成软骨细胞在其它方面的用途

人羊膜间充质干细胞在体外用本发明诱导组合物诱导向成软骨细胞分化，可作为软骨组织工程和细胞移植的种子细胞的用途。对软骨损伤疾病均有一定的防治作用。用本发明诱导组合物诱导分化人羊膜间充质干细胞作为种子细胞替代软骨细胞，可避免软骨细胞体外较难获取和高免疫原性的问题。