本发明涉及鹅坦布苏病毒疫苗技术领域，具体涉及一种坦布苏病毒及其疫苗。
背景技术：
鹅坦布苏病毒病是一种新发现的鹅急性病毒性传染病，其主要特征为发热、减食、瘫痪和种鹅产蛋下降。本病于2010年4月份发生于产蛋鸭，并在当年传播至全国主要水禽养殖地区的鸭群和鹅群。目前，在我国华北、华东和华南各省鹅生产区均有流行发生，已成为严重危害养鹅业的传染病之一。
鹅坦布苏病毒病为新发传染病，具有高度传染性，且一年四季均可流行，给鹅坦布苏病毒病等防控带来了极大困难，而免疫接种是防治该病的最有效手段，但目前尚无有效的防控措施，没有针对鹅坦布苏病毒的疫苗可用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种坦布苏病毒GD06P105，本发明提供的坦布苏病毒遗传性稳定、安全性好，能够很好地应用于鹅坦布苏病毒弱毒疫苗的制备中。
本发明提供了一种坦布苏病毒GD06P105，由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC 12670，保藏日期为2016年9月19日。
本发明还提供了一种鹅坦布苏病毒弱毒疫苗，包括坦布苏病毒GD06P105和药学上可接受的载体和/或辅料。
优选的是，所述疫苗中病毒的滴度在10-7.65/0.1mL以上。
本发明还提供了上述技术方案所述疫苗的制备方法，包含以下步骤：
将上述技术方案所述坦布苏病毒GD06P105接种至Vero细胞进行培养，当细胞病变达到80％时，将培养物进行冻融处理，得到病毒悬液；
将所述病毒悬浮液离心，将所述离心得到的上清液与药学上可接受的载体和/或辅料混合，冻干得到鹅坦布苏病毒弱毒疫苗。
本发明还提供了上述技术方案所述坦布苏病毒GD06P105在制备预防或治疗鹅坦布苏病毒药物中的应用。
本发明提供了一种坦布苏病毒GD06P105，由坦布苏病毒制备得到的鹅坦布苏病毒弱毒疫苗遗传性稳定、安全性好，免疫次数少，避免蛋鹅出现减蛋和产蛋异常现象。试验效果表明，坦布苏病毒GD06P105制备得到的疫苗安全性良好，免疫后中和抗体滴度高，疫苗中病毒的滴度在10-7.65/0.1mL以上。
生物保藏说明
坦布苏病毒(Tembusu virus)。本病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.12670，保藏时间为2016年9月19日。
具体实施方式
本发明提供了一种坦布苏病毒GD06P105，由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC 12670，保藏日期为2016年9月19日。
本发明所述坦布苏病毒GD06P105是坦布苏病毒GD06经传代获得的，本发明将坦布苏病毒GD06接种至原代细胞上进行原代培养，随后对原代培养得到的病毒接种至传代细胞上进行培养，得到坦布苏病毒GD06P105。本发明对所述坦布苏病毒GD06的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的坦布苏病毒GD06的市售产品即可。本发明所述原代细胞优选包括鸭胚成纤维细胞、鸭肾原代细胞，采用所述鸭胚成纤维细胞培养坦布苏病毒，能够提高其病毒滴度。本发明所述传代细胞优选包括Vero细胞或BHK-21，更优选将在鸭胚成纤维细胞上培养的病毒转到Vero细胞进行培养，所述Vero细胞的使用能够降低坦布苏病毒的毒力，提高病毒滴度并保留其免疫生物活性。本发明对所述原代培养和传代培养的条件没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的传代培养条件即可。
本发明还提供了一种鹅坦布苏病毒弱毒疫苗，包括坦布苏病毒GD06P105和药学上可接受的载体和/或辅料。
在本发明中，所述疫苗中病毒的滴度优选在10-7.65/0.1mL以上。
本发明对所述药学上可接受的载体和/或辅料没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的药学上可接受的载体和/或辅料即可。如稀释剂、赋形剂和水等；填充剂如淀粉、蔗糖，乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐和聚乙烯吡咯烷酮；冻存保护剂如明胶等；润湿剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠，羟丙纤维素，交联羧甲基纤维素，琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇，十二烷基硫酸钠；吸附载体如高龄土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、微粉硅胶和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明还提供了上述技术方案所述鹅坦布苏病毒弱毒疫苗的制备方法，包含以下步骤：
将上述技术方案所述坦布苏病毒GD06P105接种至Vero细胞进行培养，当细胞病变达到80％时，将培养物进行冻融处理，得到病毒悬液；
将所述病毒悬浮液离心，将所述离心得到的上清液与药学上可接受的载体和/或辅料混合，冻干得到鹅坦布苏病毒弱毒疫苗。
本发明将坦布苏病毒GD06P105接种至Vero细胞进行培养，所述坦布苏病毒GD06P105是由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏的毒株。本发明对所述坦布苏病毒GD06P105的培养方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的弱毒疫苗的培养方法即可。
在本发明中，当培养至细胞病变达到80％时，本发明将得到的培养物进行冻融处理，得到病毒悬液。本发明对所述细胞病变鉴定方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的细胞病变鉴定方法即可。
在本发明中，所述反复进行冻融优选处理2～3次，本发明对所述冻存温度和时间没有特殊的限定，采用常规细胞冻存条件即可。具体的，在本发明的实施例中，优选把细胞培养瓶转入-80℃冰箱反复冻融2～3次，收集病毒悬液。
得到病毒悬液后，本发明将所述病毒悬液进行离心，在所述离心前优选进行无菌检验，病毒悬液达标后，进行离心，得到上清液。在本发明中，所述离心的转速优选为10000～15000rpm，更优选为12000rpm；所述离心的时间优选为10～20min，更优选为15min。本发明对所述无菌检测的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的病毒悬液无菌检验方法即可。
得到上清液后，本发明将所述上清液与药学上可接受的载体和/或辅料混合，冻干后得到鹅坦布苏病毒弱毒疫苗。
将所述上清液和药学上可接受的载体和/或辅料混匀后。本发明将得到的混合料液进行冻干处理，得到鹅坦布苏病毒弱毒疫苗。在本发明中，所述冻干处理优选为在-20℃～-30℃的条件下冻存过夜后，真空冷冻干燥20～24h，所述真空冷冻干燥的时间更优选为22h。本发明对所述真空冷冻干燥使用的设备没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的真空冷冻干燥机即可。
本发明还提供了上述技术方案所述坦布苏病毒GD06P105在制备预防或治疗鹅坦布苏病毒药物中的应用。所述药物可制备成多种制剂，如片剂、胶囊、软胶囊、颗粒剂、滴丸、口服液、注射剂等。
下面结合具体实施例对本发明提供的坦布苏病毒及其疫苗做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
坦布苏病毒GD06P105的制备及检测
坦布苏病毒GD06致弱
(1)鸭胚成纤维细胞上传代培养：取无坦布苏病毒母源抗体的鸭胚成纤维细胞，用6％V/V小牛血清稀释成105/mL的细胞密度后，移至T25(5mL)细胞培养瓶内，于37℃，5％CO2细胞培养箱培养，次日用于接种坦布苏病毒GD06株。按1/10的培养基体积感染的病毒液，病毒的感染复数为1～5PFU/细胞，在病毒吸附细胞1h后，补加1％V/V小牛血清和抗生素(2000IU青霉素和2000μg/mL链霉素)的培养基维持液进行病毒增殖。当细胞病变达到80％时，将T25细胞培养瓶置于-80℃冰箱冻存，结冻后取出细胞瓶放室温解冻，冻融两次后，于生物安全柜里用移液管用力吹打细胞，将病毒悬液移至离心管，以10000rpm离心15min，收集离心后的上清液，即为病毒液。这样连续传代至第35代时，GD06株在鸭胚成纤维细胞上的细胞病变时间稳定在第3d开始出现，且病毒滴度已达104.15TCID50/0.1mL。
以第30代病毒液作为毒种，转在传代细胞(Vero)进行培养。
(2)坦布苏病毒GD06在传代细胞(Vero)上的培养
①坦布苏病毒GD06的细胞传代培养
按5％的接种量接种75mL 2单层Vero细胞，感作1h，用无菌PBS清洗2次后，加入15mL含2％胎牛血清及1％双抗的高糖DMEM培养基于5％CO2，37℃温箱培养观察。待80％的细胞出现病变时，将细胞反复冻融3次，回收含毒细胞液，将一部分传代毒冻存，另一部分作为下一代的种毒，如此反复传代。按上述步骤在番鸭胚成纤维细胞连续传代到105代，观察每一代细胞病变情况及病变时间。选取第30、40、50、60、70、80、90、95、100、105代细胞毒分别测定其TCID50和产生CPE的时间。测定结果表明，第30代的传代毒的病毒效价为10-4.15/0.1mL，随后的传代毒病毒滴度逐步增加，第95-105代传代毒的病毒效价TCID50基本稳定在10-7.65/0.1mL左右；不同代次的传代毒引起细胞病变的时间也随着传代次数的增加而缩短，第30代时接种病毒后96h左右出现皱缩等细胞病变，到105代时，接种病毒后48h左右即可见明显的细胞病变，选用105代作为弱毒疫苗的预备毒种，为了证明该毒株在鸭胚成纤维细胞已稳定遗传，此基础上再传了5代后TCID50稳定在10-7.65/0.1mL和病变时间仍为48h。因此，选用105代作为弱毒疫苗的预备毒种，命名为鹅坦布苏病毒GD06株P105。
a.不同代次的传代毒在Vero细胞上的病毒滴度及致细胞病变时间(见表1)。
表1不同代次传代毒对Vero的致病性研究
b.纯净性检验
按照常规方法排除致弱病毒内无细菌、支原体和其他外源病毒的污染。
c.最佳免疫剂量及攻毒保护试验
对开产鹅的最佳免疫剂量及攻毒保护试验
对200～210日龄开产鹅75只，随机分为5组，15只/组，其中第1组注射致弱病毒原液，第2、3、4组每只腿部肌肉注射以细胞培养基维持液10、100和1000倍稀释的致弱病毒液0.1mL，第5组注射细胞培养基维持液，接种后7d，对所有试验鹅进行采血、分离血清和对最小免疫剂量组进行抗坦布苏病毒抗体的测定，同时以鹅源坦布苏病毒肌注，每羽0.1mL(105TCID50)，观察14d，纪录数据。
结果：以第1组(致弱病毒原液)的剂量接种组鹅均健康，10倍稀释(106.65TCID50)的剂量接种组1只鹅发病，保护率为93.3％。因此以0.1mL致弱病毒原液的剂量为最小免疫剂量，保护率达100％。而细胞培养基维持液对照组全发病，保护率为0。攻毒保护试验结果见表2。
其中最小免疫剂量组的15只开产鹅免疫后中和抗体滴度分别为25.6、25.6、25.9、25.6、25.9、25.6、25.6、25.7、25.8、25.7、25.8、25.6、25.4、25.8、25.7。细胞培养基维持液对照鹅抗体为阴性。
表2对开产鹅的最佳免疫剂量及攻毒保护试验
d.致弱病毒安全性检验
对开产鹅的致病性试验：取200～210日龄开产鹅20只随机分成两组，10只/组，其中一组通过大剂量肌肉注射坦布苏病毒GD06P105制弱病毒液1mL/只(含108.65TCID50)，另一组接种同剂量灭菌生理盐水作空白对照，攻毒后7日各组分别剖杀观察卵巢病变情况。
结果：每只肌肉注射后7d，攻毒组中10只开产鹅全部卵巢(卵泡)、卵黄均无异常，且其他的组织器官剖检未见肉眼可见的大体病变。对所有攻毒组鹅的组织器官进行组织学观察与对照组的试验鹅的组织学观察结果一致，说明坦布苏病毒GD06P105对开产鹅无致病性。
实施例2
坦布苏病毒弱毒疫苗的制备及检测
①基础种子批建立
取第105代细胞冻干毒种，接种Vero，当细胞病变达到80％时，把细胞培养瓶转入-80℃冰箱反复冻融两次后，收集病毒悬液，进行无菌检验达标后，以12000rpm离心15分钟，收集离心后的上清液，获得含坦布苏病毒GD06P105的病毒液作为基础毒种，置-80℃冰箱保存备用。
②生产种子批建立
将基础毒种接种于Vero，当细胞病变达到80％时，把细胞培养瓶转入-80℃冰箱反复冻融两次后，收集病毒悬液，以12000rpm离心15分钟，收集离心后的上清液，获得含坦布苏病毒GD06P105的液体，按生产种子批指定的检验标准进行检验，即得生产毒种。
将合格后用作生产毒种的坦布苏病毒GD06P105保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏编号是CGMCC 12670，保藏日期为2016年9月19日。
③坦布苏病毒弱毒疫苗的制备
取生产用坦布苏病毒GD06P105毒种，以细胞培养基维持液作l：10稀释，接种至Vero，当细胞病变达到80％时，把细胞培养瓶转入-80℃冰箱反复冻融两次后，收集病毒悬液，进行无菌检验达标后，以12000rpm离心15分钟，收集离心后的上清液，分装5mL(用于纯净性检验和TCID50测定)，其余按1.5％的比例加入明胶混匀后分装无菌冻干瓶，每瓶2.5mL，-20℃冻存过夜后用真空冻干机冻干22h，制成坦布苏病毒弱毒疫苗，病毒效价应在107.65TCID50/0.1mL以上。
坦布苏病毒弱毒疫苗的测定
①坦布苏病毒弱毒疫苗的安全性检验
对开产鹅的安全性测定
取200～210日龄开产鹅20只随机分成两组，10只/组，其中一组通过肌肉注射坦布苏病毒弱毒疫苗1mL/只(含108.65TCID50)，另一组接种同剂量灭菌生理盐水作空白对照，免疫后7d各组分别剖杀观察卵巢病变情况。取卵巢固定于10％福尔马林溶液中，制作病理切片，观察组织显微变化，评价疫苗株的安全性。
结果：每只肌肉注射后7d，结果攻毒组中10只开产鹅全部卵巢(卵泡)、卵黄均无异常，且其他的组织器官剖检未见肉眼可见的大体病变。对所有试验组鹅的卵巢进行组织学观察与对照组的组织学观察均为发现病变，说明该批疫苗对鹅安全性良好。
②坦布苏病毒弱毒疫苗的免疫保护试验
对开产鹅的免疫保护试验
取200～210日龄开产鹅60只，随机分为2组，30只/组，其中1组每只腿部肌肉注射坦布苏病毒弱活疫苗0.1mL，第2组注射细胞培养基维持液作为对照，免疫后7d，对所有试验鹅进行采血、分离血清和抗坦布苏病毒抗体测定，同时每只鹅肌注105TCID50鹅源坦布苏病毒，观察14d，纪录数据。
结果：30只开产鹅免疫后中和抗体滴度平均为25.7。细胞培养基维持液对照鹅抗体为阴性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。